白生宾[1]2012年在《氟对破骨细胞增殖的影响及可能的分子机制》文中研究表明第一章慢性氟中毒对大鼠骨相损伤的影响目的：通过慢性染氟,观察氟对大鼠骨相(牙和骨骼)损伤的影响,探讨破骨细胞与氟中毒导致骨相变化的可能关系。方法：本实验采用Wistar大鼠染氟干预(剂量分别是0mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L)的方法,染氟6个月,分别通过体视显微镜、病理学、X线以及染氟大鼠的氟的负荷量等几个方面检测氟中毒大鼠的特征性指标。结果：①大鼠一般状况的变化,随着染毒时间的延长,染氟第2个月时,100mg/L组和150mg/L组大鼠表现出精神萎靡,食欲减弱；染氟第5个月,50mg/L组大鼠出现上述表现,随着染氟时间的延长,其表现更加明显；实验末期大鼠体重与实验前相比,25mg/L组与空白组比较,大鼠体重值要比空白组低,但统计学显示,差异不具有显着性,(P>0.05)；50mg/L组和100mg/L组与对照组相比较体重增长曲线基本一致,而150mg/L组从第八周开始,体重增长趋势逐渐减弱,与空白组比较,差异具有显着性,(P<0.05)。②大鼠牙齿的变化,大鼠切齿4颗,上齿短,下齿长而尖。对照组大鼠切齿呈均匀的淡黄色,表面光滑有光泽。实验组大鼠个体差异较大,100mg/L、150mg/L组大鼠有的在3个月左右就可出现氟斑牙,轻者牙表面黄、白相间,白垩条纹清晰,尚有一定光泽。随时间的延长,氟斑牙症状逐渐加重,牙齿表面呈无光泽粉笔样白色斑(白垩状)。有的大鼠牙齿表面出现小沟、裂纹、或部分脱落,牙齿呈锯齿状严重缺损。说明染氟剂量对氟斑牙的形成程度有一定的影响,表现出剂量和时间依赖性。③X线征象变化：100mg/L、150mg/L组骨盆的骶髂关节改变最多见。X线征象检查显示骨盆改变出现最早,2个月时少数几例见骨纹模糊,3个月后骨纹模糊、紊乱明显增加骨密度增高,染氟6个月时,染氟150mg/L组部分髓腔密度降低,说明高剂量染氟导致大鼠骨小梁的骨吸收增强,表现出骨质疏松。不同剂量氟干预导致结果不同,主要表现为骨硬化,高剂量表现出骨质疏松。④大鼠股骨组织形态计量参数分析：150mg/L组股骨干骺端平均骨小梁密度(MTPD)及平均骨小梁厚度(MTPT)明显减小,差异有显着性(P<0.05),说明高剂量可以造成骨质疏松的表现。⑤组织病理学改变：150mg/L组：骨板弯曲变形,排列不规则；骨陷窝与骨基质之间的裂隙较多,骨细胞数量减少,胞核皱缩或消失,骨小管细小甚至消失；骨小梁排列紊乱,数量减少,间距变大,宽度变窄,连接呈网状；成骨细胞成层排列,数量增多,破骨细胞数量较其他剂量组明显增多,胞体肥大,细胞核为多个。⑥氟负荷量的变化：染氟6个月后尿液中氟离子随着染氟浓度的升高而呈上升趋势,与对照组比较,差异具有显着性(P<0.05)；血液中氟离子在6个月时,染氟组与对照组比较,氟离子浓度值轻微上升,但统计学比较差异不具有显着性(P>0.05)；大鼠股骨中氟离子浓度值与对照组比较,25mg/L组有轻微上升,但没有统计学意义,而50mg/L、100mg/L、150mg/L叁组氟离子上升比较明显,差异具有显着性(P<0.05)；大鼠下切牙的氟离子浓度值与对照组比较,各染氟组都明显升高,差异具有显着性(P<0.05)。结论：染氟后大鼠体内氟负荷量随着时间和剂量基本呈递增趋势；高剂量长时间染氟导致骨质疏松,与破骨细胞的功能活跃有一定的关系。第二章氟对离体培养破骨细胞增殖的影响目的：探讨sRANKL对小鼠RAW264.7细胞的诱导分化及氟对RAW264.7细胞增殖的影响。方法：本实验采用体外培养破骨细胞,以sRANKL诱导RAW264.7细胞进行鉴定,以氟化钠0到160mg/L范围内给出13个剂量组进行染氟,采用噻唑蓝(MTT)法,观察存活细胞数量,并绘制增殖曲线,筛选出与破骨细胞增殖相关的4个剂量组,分别是0、2、10、50mg/L组,用HE染色、甲苯胺蓝染色、TRAP染色以及扫描电镜和透射电镜对破骨细胞的诱导分化及增殖作用进行了形态学和功能方面的鉴定。结果：①诱导前RAW264.7细胞呈星形、圆形或不规则形,细胞核1-2个。诱导后外形仍然呈不规则形,但圆形细胞基本消失,细胞核为多个。TRAP染色阳性细胞为细胞质鲜红色或者淡红色,细胞核2-3个多见,形态呈多突起不规则形。②诱导后倒置显微镜观察与HE染色、甲苯胺蓝染色表明与牛骨磨片共培养发现经过诱导分化后的RAW264.7细胞吸收陷窝明显增多,组间比较差异具有显着性(P<0.05)。③诱导后电镜结果显示,RAW264.7细胞边缘呈指状、刺状或不规则的突起,外形不规则,细胞密度较低的是已分化成熟的破骨细胞,能够形成吸收陷窝。④染氟后通过光镜、电镜及MTT法检测,说明当氟化钠浓度低于2mg/L时,对RAW264.7细胞生长无明显影响；当氟化钠浓度介于2mg/L与10mg/L时,RAW264.7细胞增殖数量明显增加；而当氟化钠浓度高于50mg/L时,RAW264.7细胞增殖受到明显抑制；组间比较差异具有显着性(P<0.05)。结论：明确TRAP染色可以作为破骨细胞一种形态学鉴定方法；低剂量的氟可以促进体外培养小鼠破骨细胞增殖,随剂量增加其促进作用减弱；高剂量氟对破骨细胞增殖有抑制作用。第叁章氟对破骨细胞作用的可能分子机制目的：探讨氟对MCM3基因表达和分布的影响以及MCM3对破骨细胞增殖活力的影响。方法：本实验采用体外培养破骨细胞,用免疫荧光技术、Western blot以及半定量RT-PCR的方法,检测不同剂量0、2、10、50mg/L的氟对MCM3mRNA以及蛋白的影响；以及染氟6个月大鼠,用ELISA法检测MCM3在染氟大鼠血清中的变化；通过MTT法检测MCM3对破骨细胞增殖活力的影响。结果：①通过RT-PCR检测比较各组之间MCM3mRNA的表达量,2mg/L组与空白组之间表达量略高,但无统计学意义(P>0.05)；10mg/L组与空白组相比,MCM3mRNA的表达量明显升高(P<0.05)；50mg/L组与空白组相比较MCM3mRNA的表达量明显下降(P<0.05)；各组间比较发现50mg/L组与其他各组具有显着性差异(P<0.05)。②Western-blot结果显示2mg/L、l0mg/L组与空白组相比较,MCM3蛋白表达量略高于空白组(P>0.05),50mg/L组与空白组相比较,MCM3蛋白表达量略低于空白组(P>0.05),2mg/L组与10mg/L组相比较,2mg/L组蛋白表达量略高,但无统计学意义(P>0.05)。③免疫荧光结果显示MCM3蛋白表达0、2、10mg/L各组主要表达在细胞核,有微量在细胞质,表达量依次增强；50mg/L组主要表达在细胞质,细胞核有少量表达,表达强度较弱。④ELISA结果显示高剂量染氟150mg/L组,在染氟6个月时,MCM3的表达量与其他各组比较差异均有统计学意义,P<0.05。⑤体外破骨细胞培养48h内,染氟组在24h～36h,与空白组比较,破骨细胞增殖活力明显提高,有统计学意义,P<0.05；MCM3抗原组在培养24h,增殖活力提高,与空白组比较有统计学意义,P<0.05；当氟与MCM3抗原共同作用时,在破骨细胞培养12h～36h,增殖活力最明显,与空白组比较都有统计学意义,P<0.05；当MCM3抗体作用于破骨细胞,在培养24h～48h时,细胞增殖活力具有下降趋势,与氟+抗原组比较,差异具有统计学意义,P<0.05。说明MCM3抗原相对于抗体在早期就具有刺激破骨细胞增殖的趋势,随着作用时间的延长,MCM3抗原加强了破骨细胞的增殖作用,在染氟晚期,破骨细胞增殖能力也与MCM3有一定的关系。结论：不同剂量的氟对体外培养破骨细胞MCM3的表达量不同,基本表现出2mg/L、10mg/L染氟组促进MCM3的表达,50mg/L染氟组明显抑制了MCM3的表达,从10mg/L氟剂量开始出现抑制作用,随剂量增加促进作用逐渐减弱,50mg/L基本达到毒性反应；高剂量150mg/L氟对在体MCM3表达具有明显增强作用,说明促进破骨细胞增殖,其机制有待进一步研究；MCM3在一定时间内对体外破骨细胞增殖有促进作用,但具体机制需要进一步研究。
马雷, 林兆全, 刘开泰[2]2004年在《氟对兔体外破骨细胞性骨吸收影响的研究》文中研究表明目的:探讨不同剂量氟化钠 (Na F)对兔体外破骨细胞功能的影响。方法:从新生兔四肢长骨中分离破骨细胞 ,采用体外培养破骨细胞的方法 ,用倒置相差显微镜和计算机图像分析技术 ,测量在含有不同浓度 (1.0 0×10 - 7～ 1.0 0× 10 - 4m ol/ L )的 Na F培养液中骨吸收陷窝数和表面积。结果:染氟 1.0 0× 10 - 6 、1.0 0× 10 - 5和 1.0 0×10 - 4m ol/ L 组骨片上骨吸收陷窝数量和表面积与对照组比较均减少 (P <0 .0 1) ,而且骨吸收陷窝数及表面积随氟浓度的增加而减少。 结论 :氟对体外培养的破骨细胞有直接的损伤作用。
马雷[3]2003年在《氟对体外破骨细胞性骨吸收影响的研究》文中提出目的：观察不同剂量的氟化钠(NaF)对兔破骨细胞功能的影响，进而探讨氟中毒时的口腔颌骨、牙槽骨的病理变化。方法：选用新生日本大耳白乳兔(出生24小时内)，采用体外培养破骨细胞法，从细胞水平观察氟对破骨细胞的生长、分化和激活等各种生物学行为的影响，可以排除体内诸多因素的干扰，用显微摄影、显微光密度仪扫描及计算机图像分析技术，测量在含有不同浓度的氟化钠培养液里，破骨细胞功能的变化。用原子吸收分光光度法测定溶出的钙，并用扫描电镜观察吸收陷窝的形态，以评价破骨细胞活性。结果：当氟浓度为10~(-7)mol/L对破骨细胞的活性的影响不明显，浓度为10~(-4)、10~(-5)和10~(-6)mol/L的氟均能抑制破骨细胞活性(P＜0.01)，而且骨吸收陷窝数目及表面积随氟浓度的增加而减少。结论：低剂量氟对破骨细胞功能的影响与对照组差别不明显。高浓度氟对体外培养的破骨细胞有直接的损伤作用，作用呈剂量依赖关系。
薛永峰[4]2010年在《体外诱导培养鸡胚破骨细胞及钙、磷对其活性的影响》文中指出为在细胞和分子水平上研究家禽破骨细胞形成及活化与骨代谢之间的关系,本试验拟在鸡胚破骨细胞诱导培养的基础上,通过形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色与计数、骨磨片吸收陷窝对诱导生成的破骨细胞进行鉴定,研究钙磷因子对破骨细胞生存、诱导生成和骨吸收活性的影响,以期为家禽骨骼代谢疾病的研究提供一定的科学理论支持。试验结果如下:⑴首先利用1,25(OH)2D3的诱导作用,诱导培养出鸡胚OC,通过上述鉴定方法对OC进行特异性鉴定,证明了所诱导出的OC具有成熟OC的活性,且得出1,25(OH)2D3在浓度为10-8mol/L时诱导效果最佳;⑵在没有1,25(OH)2D3诱导作用下,添加不同浓度的钙、磷,发现高浓度钙、磷短时间内能抑制OC细胞的生存(<16h),中、低浓度组从24h开始对OC生存起抑制作用。到32h时,中高浓度组差异不显着,但与低浓度组差异极显着,各试验组与对照组差异都极显着;⑶在破骨细胞诱导培养体系中,分别添加不同浓度的钙、磷,结果显示:中高浓度的钙、磷对1,25(OH)2D3诱导OC的生成有抑制作用,而且能抑制OC的骨吸收活性;⑷本研究在体外诱导培养鸡胚OC培养的基础上,分别加入了不同比例的钙、磷,研究了其对体外培养OC生成、活化和骨吸收功能的影响。结果表明:当Ca:P为2:1时,对OC的诱导生成及骨吸收活性抑制作用最大,与对照组差异极显着。
王岩[5]2017年在《TGF-β及其受体信号通路在氟调控破骨细胞分化中的作用》文中认为研究背景:转化生长因子-β(TGF-β)作为转化生长因子超家族中的多功能细胞因子,其产生于细胞分化的各个阶段,在骨组织中的含量尤为丰富。TGF-β可以由骨中的许多细胞产生并分泌在骨基质中,研究证明了TGF-β在破骨细胞的分化和骨的重吸收过程中发挥重要的作用。在氟骨症发病过程中,氟能够刺激成骨细胞和破骨细胞,均表现出不同程度的活跃性,但是对于在骨的重吸收过程中发挥主要作用的破骨细胞研究甚少。本实验从体内、体外两个方面进行研究,探究TGF-β在氟调控的破骨细胞中的作用,这在以往的氟骨症机制研究中罕见报道。本实验研究成果将为氟骨症及相关代谢性骨病的研究提供线索和理论依据。实验方案:1.体内实验:60只清洁级雄性成年Wistar大鼠平均分为对照组、低氟组和高氟组。叁组大鼠给予氟处理1个月后,每组中选取一半的大鼠进行SB431542试剂处理,实验最后分为6组:对照组,10mg F-/kg·day组,20mg F-/kg·day组,SB431542组,10mg F-/kg·day+SB431542组,20mg F-/kg·day+SB431542组。投氟联合SB431542继续处理1个月后,乙醚麻醉处死大鼠,经眼球取血进行生化分析,收集股骨、胫骨等骨组织进行HE染色、免疫组化和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析。我们主要观察了氟中毒大鼠骨组织的病理形态、骨保护素蛋白表达以及成骨、破骨标志物水平。该实验主要考察氟中毒大鼠复制氟骨症模型、骨转换特征和TGF-β受体抑制剂对氟骨症骨吸收病理过程的影响。2.体外实验:我们以小鼠单核细胞系RAW264.7为研究对象,采用培养基加RANKL(25ng/m L)诱导单核细胞融合成破骨细胞前体,作为考察氟诱导破骨细胞增殖和分化的体外模型。实验设为对照组,1、4、16mg F-/m L叁个梯度氟组以及SB431542组和叁个梯度氟联合SB431542组,共8组。RAW264.7细胞在RANKL存在的条件下,分别给予氟浓度分别为0,1,4,16 mg F-/m L,以及氟联合抑制剂SB431542(浓度为10μmol/L)进行处理,培养7天后进行实验检测。采用MTT法检测不同条件下的细胞活性;将RANKL诱导RAW264.7细胞接种在骨磨片上,培养7天后,对骨片进行甲苯胺蓝染色,光镜下观察各组形成骨陷窝的形态并进行不同条件下破骨细胞样细胞骨吸收能力的比较分析;利用实时聚合酶链式反应和蛋白杂交技术分别检测了暴露于不同条件下RAW264.7细胞内破骨相关及TGF-β信号通路各因子在基因和蛋白水平的表达变化。3.mi RNA表达分析:RAW264.7细胞在RANKL存在的条件下,给予氟浓度8mg F-/L培养液处理7天。采用Affymetrix mi RNA 4.0芯片进行染氟组与对照组细胞mi RNA表达谱分析,利用Volcano Plot filtering观察mi RNA基因表达量的变化,与对照组比较倍数改变值≥2.0或≤-2.0即为明显差异表达的mi RNA。最后用层次聚类法分析明显差异基因的表达框架。实验结果:1.体内实验:投氟大鼠随着投氟时间延长和投氟量的加大,氟斑牙病损和骨转换活跃状态更加显着。SB431542联合氟处理组大鼠的氟斑牙损害程度比相同投氟条件下大鼠牙齿损害加重,但是骨组织病理性骨转换特征被抑制。与之相对应的是氟能够促进大鼠血清内PINP和CTX的浓度提高,而单独SB431542处理显着抑制了两者的表达;氟降低了大鼠的骨密度,而且高氟组大鼠明显比低氟组大鼠骨密度低,骨密度变化情况与前面的病理结果相互支持。此外,大鼠骨组织抑制破骨关键因子OPG蛋白表达明显降低,SB431542促进骨髓B细胞前体表达OPG。大鼠暴露于不同氟水平能够引起活跃骨转换,造成不同程度的成骨和破骨活动加强。SB431542作为TGF-β1细胞内受体抑制剂能够抑制骨转换,明显影响氟引起的骨转换状态,说明TGF-β1在氟刺激的骨转换机制中扮演着重要角色。2.体外实验:结果表明低量氟显着刺激RAW264.7细胞活性,高量氟早期也能促进该细胞活性,但是随着氟作用时间的延长,细胞活性受到抑制。同样地,低量氟对RAW264.7细胞诱导破骨细胞骨吸收能力和破骨细胞分化特征的细胞数具有显着的刺激作用,高氟却抑制这种作用。经过破骨细胞分化标志物TRAP和调控因子RANK表达在染氟破骨细胞样细胞内的变化,证明了氟对破骨细胞分化成熟的刺激作用,并且伴随着TGF-β1细胞内两个受体及其下游磷酸化Smad3的表达。然而,氟对破骨细胞样细胞的刺激作用在联合给予TGF-β1细胞内受体抑制剂SB431542后显着下降;相应地,磷酸化Smad3和TβR1的表达比单独氟作用组细胞明显降低。这些结果提示了TGF-β1在氟作用破骨细胞分化和功能机制中有着重要作用。3.mi RNA芯片分析:结果显示出染氟能够促进破骨细胞前体细胞内的诱导细胞分化及参与调控的IGF1和TGF-β1等的mi RNA表达显着增加。我们知道每个mi RNA可以有多个靶基因,而几个mi RNAs也可以调节同一个基因。在本实验经过KEGG富集分析发现了氟刺激了多个参与调控破骨细胞分化信号通路,如IGF1和TGF-β1及其细胞内下游信号因子Smad3、MAPK等的mi RNA变化。结论:低量氟对破骨细胞活性、分化和功能具有显着的刺激作用,高氟作用一定时间后却能抑制这种刺激作用,并阻碍破骨细胞的分化和功能。TGF-β1在氟作用破骨细胞分化和功能机制中有着重要作用,氟很可能通过TGF-β1细胞内的TβR1-磷酸化Smad3信号通路发挥这种刺激作用。同时,氟可以同时刺激破骨细胞内多个参与调控破骨细胞分化信号通路,如IGF1和TGF-β1及其细胞内下游信号因子Smad3、MAPK等的mi RNA变化,这为我们下一步分析氟诱导破骨精细调控机制提供了线索。
吴培福[6]2004年在《成骨细胞和破骨细胞的体外培养及氟对其的影响》文中进行了进一步梳理本文通过细胞培养技术,研究氟对成骨细胞和破骨细胞形态结构,以及对成骨细胞体外增殖和矿化能力的影响。试验采用24h内昆明乳鼠,拉颈处死,无菌取出头盖骨,在超净工作台内将其剪碎,先用0.25%胰蛋白酶37℃消化30min,然后用0.2%胶原酶37℃振荡消化60min,反复吹打骨片分离更多细胞。用含15%胎牛血清的DMEM培养液将细胞配成所需浓度进行接种。培养第二天换液,以后隔天换液。采用此法成功分离培养出了具有典型特征的成骨细胞。培养过程中,成骨细胞表现出不同的体外生长时相(潜伏期、对数生长期、水平静至期),刚接种的成骨细胞呈球形,4h后部分细胞贴壁展开,24h后细胞完全贴壁展开。第3d时,成骨细胞呈半汇合状态;5d时,细胞完全汇合;7d时,细胞重迭生长,呈铺路石状;9d时,成骨细胞密积生长;11d时,基质堆积,细胞结节形成;13d时,矿化结节形成。氟对成骨细胞形态结构、体外增殖能力的影响具有剂量-时间依赖性。大于10-4mol/l的氟对成骨细胞具有明显的细胞毒性作用,10-1mol/l和10-2mol/l氟能致成骨细胞急性死亡。氟浓度小于10-4mol/l时,对成骨细胞的毒性作用不明显。10-5mol/l~10-7mol/l氟可促进成骨细胞的体外增殖,10-3mol/l和10-4mol/l氟对成骨细胞的体外增殖具有抑制作用。氟对成骨细胞矿化能力的影响具有剂量依赖性。经实验观察表明,10-5mol/l~10-7mol/l氟能促进成骨细胞的矿化能力。另外,试验采用2周龄的昆明小鼠,拉颈处死,在超净工作台内无菌分离长骨,剔除骨周组织和骨骺端。将分离骨骼置于冷DMEM培养液中,分成两半,刮取骨髓,而后吹打骨碎片,使更多细胞脱落。待骨片沉淀后,将骨髓细胞接种,30min后收集未贴壁的细胞,重接种于成骨细胞上培养,以后隔2d换液。用此法成功诱导培养出了具有多核、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性的破骨细胞。氟对破骨细胞形态的影响呈剂量-时间依赖性。倒置相差显微镜下10-1mol/L～10-3mol/L氟对破骨细胞呈现明显毒性反应。10-1mol/L、10-2mol/L可致破骨细胞急性死亡。10-4mol/L～10-7mol/L氟对破骨细胞形态的影响不明显。氟可影响破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的分泌,呈剂量依赖性。
华坤, 卜丽莎, 李广生[7]2003年在《氟化物对体外培养的大鼠破骨细胞活性的影响》文中提出目的 探讨氟对体外培养的大鼠破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)和基质金属蛋白酶 9(MMP 9)活性的影响。方法 通过机械分离大鼠乳鼠四肢长骨的方法培养破骨细胞 ,应用组织化学方法观察氟对培养的破骨细胞TRAP活性的影响 ;应用原位杂交方法观察氟对培养的破骨细胞MMP 9mRNA表达的影响。结果 染氟组单位面积的TRAP阳性细胞表达增加 ,各剂量组TRAP阳性细胞数分别为 15 4 2、16 0 0、170 6、179 0和 180 0个 /cm2 ,但差异无显着性 ;随着染氟剂量的增加 ,MMP 9mRNA的表达增加 ,以 1 0 0、2 0 0和 4 0 0mg/L染氟组最为明显 ,依次为 94 5 0、94 6 4和10 4 97,与对照组比较差异有显着性。结论 氟对破骨细胞MMP 9mRNA的表达有增强作用。
吕鹏[8]2015年在《胰岛素及胰岛素受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用》文中提出目的：最近的研究证明了成骨细胞分泌的不同形式的骨钙素在骨骼与胰岛交联作用中的地位，使得骨骼与胰腺之间相互调控和作用越来越受到关注，因此胰岛素在代谢性骨病发病机制中的地位再次成为热点。我们以往的研究已经明确了代谢性骨病之一的氟骨症主要在氟骨症发病过程中成骨细胞和破骨细胞表现出程度不同的活跃。成骨细胞功能活跃在氟骨症病变中是一个起主导作用的环节。该课题的主要目的是考察氟骨症这些特征性改变与胰岛素对骨转换的调控是否联系，并阐明胰岛素在氟中毒诱导的骨病变以及体外染氟成骨细胞的刺激作用的地位。方法及结果：采用灌胃给氟2月复制氟骨症模型，并在染氟1月后经腹腔注射一次STZ来抑制胰岛素的分泌。结果显示投氟大鼠氟斑牙特征明显，而且随着投氟剂量的升高，氟斑牙由半透明出现条纹到牙齿呈白垩色；而且STZ联合氟处理组大鼠牙齿破环较相同投氟组明显，尤其是高氟出现了牙齿缺损和断裂。利用生化方法分析的胰岛素、胰岛素敏感性、血糖和HbA1C水平，结果表明了投氟明显刺激了胰岛素的分泌，相应地血糖和HbA1C水平变化不明显。联合STZ处理组大鼠的胰岛素在低氟组是升高的，高氟组未观察到降低；然而STZ处理大鼠明显影响了胰岛素的降糖功能。胰岛素敏感实验反应了机体的胰岛素效能，从血糖的变化趋势可见投低剂量氟和联合STZ处理引起的血糖回归正常延时很可能归于一定剂量的氟能降低胰岛素的敏感性甚至引起胰岛素抵抗发生。采用免疫组化检测胰岛内胰岛素和骨钙素受体GPRC6A蛋白表达情况，发现投氟刺激了胰岛素的分泌，而且高氟组大鼠的胰岛素分泌能力提高更显着。单独STZ处理抑制了胰岛素分泌，联合氟处理大鼠后仍然刺激了胰岛素的表达。进一步骨密度和骨钙素水平的分析显示了随着投氟量的增加，骨密度下降更明显；STZ处理加重了骨密度的下降，且投氟越高骨密度下降越明显。单独氟处理大鼠轻度诱导了GPRC6A的蛋白表达，而联合STZ处理后投氟反而引起了该受体的表达下降。骨钙素仅在给予高氟条件下轻度升高，联合应用STZ处理组后各投氟组间骨钙素变化不显着。鉴于OCN与GPRC6A之间的关系，可见氟能够轻度刺激GPRC6A表达和提高血液中的骨钙素含量。联系前面观察到的氟明显刺激胰岛素的分泌；同时，STZ及联合氟作用降低了胰岛素的敏感性，影响GPRC6A在胰岛内的表达导致其下降。利用定量PCR技术分析了投氟或联合STZ处理组大鼠成骨、破骨标志及相关调控基因的变化。结果显示出低量氟明显诱导成骨细胞早期分化，高剂量氟对诱导分化作用不明显。STZ联合投氟处理明显抑制了成骨早期分化，但对成骨晚期分化有一定作用。投氟显着刺激了破骨细胞的功能，STZ降低了破骨细胞的功能，而且联合投氟破骨作用不明显。破骨调控因子的变化显示了投氟显着刺激了破骨和骨吸收。STZ处理并没有明显抑制破骨相关基因的表达，但是联合投氟显着促进OPG表达和降低RANKL基因，说明了两者联合应用抑制了破骨活性。TGFβ、β-catenin和Wnt10的基因变化说明了TGFβ在氟诱导成骨和破骨过程中起到重要作用，而且在STZ诱导的胰岛素敏感性下降而导致氟诱导成骨晚期分化和破骨过程中起到一定作用。而β-catenin和Wnt10主要参与了氟作用下引起成骨、破骨活性改变，STZ联合氟处理一定程度抑制了大鼠骨组织β-catenin的表达，主要体现了成骨受抑制而引起其表达。利用出生叁周的Wistar小鼠股骨和胫骨收集骨髓间充质干细胞进行成骨细胞分化实验观察。选取稳定和细胞种类纯化的第叁代的BMSC，矿化液孵育28天后茜素红S染色，观察到细胞出现融合和多层细胞迭加呈紫色或粉色的团块,说明了本实验收集的BMSC传至第叁代后主要是由成骨潜能的干细胞组成,从而为下面的成骨诱导实验提供依据。染氟或胰岛素处理细胞能够刺激BMSC活性，而且胰岛素联合在低、中剂量氟作用下加强了细胞活性，但是胰岛素联合高剂量氟加重抑制了细胞活性，体现了胰岛素对成骨增生作用与氟刺激成骨作用一致。通过改良钙-钴法进行碱性磷酸酶染色，观察分化细胞早期情况。低、中剂量染氟明显刺激了BMSC细胞早期分化，但是高量氟显着抑制了该细胞的分化；联合胰岛素处理BMSC细胞也是呈现低、中剂量氟的刺激作用和高剂量氟对细胞早期成骨分化的抑制作用，这种协同作用主要体现在高剂量氟对ALP的抑制作用。利用MC3T3-E1细胞作为体外成骨细胞前体染氟模型。通过不同剂量氟和胰岛素对该细胞增殖活性的影响，确定了能够诱导成骨细胞活性的染氟浓度1、2、8mgF-/L和50nmmol/L为细胞实验条件。为了观察胰岛素受体对染氟成骨细胞的诱导成骨和破骨活性的影响，我们采用基因干扰（siRNA）有效降低了胰岛素受体在成骨细胞内的表达。采用CCK-8方法观察了从低到高剂量氟联合胰岛素作用对成骨细胞活性的影响。结果显示出染氟对MC3T3-E1细胞活性的影响主要集中在低和中剂量氟处理组，胰岛素不仅本身刺激成骨细胞活性，而且能够加强氟刺激成骨细胞活性的作用。定量聚合酶链式反应分析了成骨细胞内胰岛素受体底物及与骨钙素调控胰岛素分泌密切相关因子Esp和FoxO1，结果显示出胰岛素受体有效抑制后，明显降低了胰岛素受体底物，但显着激发了Esp基因的表达；联合染氟后不同程度地诱导了胰岛素受体的基因表达和激活胰岛素受体底物的表达，相应地降低了Esp基因。说明了氟能够显着刺激胰岛素受体的表达并通过胰岛素受体底物和Esp基因信号通路相互协调发挥其调控成骨细胞的作用。进一步定量分析了染氟成骨细胞内成骨和破骨调控因子在胰岛素受体表达受抑制后的表达变化。胰岛素受体主要影响成骨转录因子osterix和骨钙素发挥刺激成骨作用，而MAPK信号通路参与胰岛素调控的成骨活性过程。另一方面，破骨细胞分化调控因子的变化说明了胰岛素受体主要通过调控OPG基因的表达变化发挥调控破骨细胞分化作用。结论:通过体内外实验结果我们发现氟斑牙病变程度随着投氟量的增加而加重，链尿佐菌素抑制胰岛素分泌加重氟中毒症状。氟能够轻度刺激GPRC6A表达和提高血液中的骨钙素含量，明显刺激胰腺分泌胰岛素作用。不同浓度氟作用大鼠可引起胰岛素敏感性的变化。链尿佐菌素（STZ）抑制大鼠胰岛素降糖效应，同时也导致胰岛素敏感性下降引起胰岛素抵抗,造成机体各器官对胰岛素调控作用不敏感。投氟诱导大鼠骨密度下降，且投氟越高骨密度下降。联合成骨和破骨标志物和基因的变化，说明了给氟激发了大鼠股骨活跃的骨转换。大鼠胰岛素活性和敏感性下降明显影响了成骨细胞和破骨细胞分化和进一步加重骨病变。TGFβ在氟诱导成骨和破骨过程中起到重要作用，而且参与了胰岛素对氟诱导的骨转换发生调控机制。氟通过调控β-catenin和Wnt10途径发挥调控成骨、破骨活性作用。体外实验验证了一定剂量氟刺激骨髓间充质细胞和成骨前体细胞的增生和诱导骨髓间质干细胞分化；胰岛素刺激两种细胞细胞增生，但诱导成骨细胞早期分化作用不明显。胰岛素主要通过胰岛素受体介导胰岛素受体底物和Esp基因参与氟诱导的成骨和破骨活性变化。胰岛素主要影响了成骨分化后期osterix和骨钙素的表达来参与氟诱导的成骨作用；同样地，它也是主要通过对OPG的表达来参与氟诱导的破骨作用。
王芳[9]2010年在《高氟暴露对人群血清OPG、RANKL及OPG/RANKL影响的研究》文中研究指明前言氟(Fluorine, F)是人体重要的微量元素之一,在生理代谢过程中,发挥着不可替代的作用。适量的氟有利于钙和磷的利用以及在骨骼中沉积,可加速骨骼形成,促进骨骼生长,增加骨骼的硬度,维护骨骼的健康。但当人体从外界摄入的氟超过正常生理需要时,将导致急性或慢性氟中毒。地方性氟中毒属于慢性氟中毒,简称地氟病。在我国,主要以饮水型地方性氟中毒病区分布范围最广、患病人数最多。地氟病已经成为威胁我国劳动人民,尤其是贫困地区农民身心健康的重大公共卫生问题。氟骨症是慢性氟中毒最主要也是最严重的临床表现,其病理表现多种多样,其骨损害包括骨硬化、骨软化、骨质疏松、骨周软组织化骨以及软骨和关节的退行性改变。成骨细胞功能活跃在氟骨症骨病变中是一个发生较早、并起主导作用的环节,是形成氟骨症骨病变多样性的病理基础。成骨细胞和破骨细胞的活动维持着持续动态平衡,任何引起这个平衡破坏的因素都会导致骨代谢生化标志物的改变,通过检测血、尿等体液中骨代谢生化标志物的变化,可间接反映骨骼的病理状态。骨保护素(osteoprotegerin, OPG)是一种以可溶性蛋白形式存在的破骨细胞负性调节因子。通过与NF-KB受体活化因子配体(receptor activator of NF-KB ligand, RANKL)结合,抑制RANKL/RANK对破骨细胞信号转导的活化,抑制骨再建和骨丢失,发挥抗骨质疏松作用。RANKL是可溶性细胞因子κB受体活化因子(RANK)的配体,是肿瘤坏死因子受体家族中的成员。RANKL在破骨细胞分化、活化、和凋亡过程中起重要作用。RANKL与破骨细胞和树突状细胞上的受体RANK结合是破骨细胞基因活化的关键步骤。RANKL是成熟破骨细胞形成的主要促进因子,也是破骨细胞存活的决定因素。现有对OPG、RANKL的研究都是用氟染毒的动物模型。本课题组2002级硕士研究生张莹研究了亚慢性过量氟暴露情况下,OPG的表达水平在氟骨症发生发展过程中所起的作用,发现OPG的表达水平在中氟组和高氟组大鼠体内明显增强。2003级硕士研究生穆金萍研究发现,在亚慢性过量氟暴露大鼠的骨组织中,RANKL的表达水平在中氟组和高氟组大鼠体内明显增强,而RANKL的表达强度与骨氟之间存在明显的正相关关系,提示氟可以通过提高RANKL的表达来增进破骨细胞的发育、活化和生存,说明氟在增强成骨活动的同时,也伴有不同程度的骨吸收增加,只是由于成骨活动增强的程度强于破骨活动从而造成了氟中毒大鼠骨质硬化性的病理表现,从而推测RANKL可能在亚慢性过量氟暴露大鼠体内骨转换增强过程中与OPG等细胞因子联合发挥重要作用。对于氟中毒人群调查血清中OPG和RANKL水平的影响尚未见相关的报道。本研究旨在了解慢性过量氟暴露对人群血清中OPG和RANKL表达的影响,为阐明氟骨症的发病机制、探索其早期诊断指标提供理论依据。对象与方法一、研究对象的选择根据辽宁省疾病预防控制中心提供的辽宁省饮水型地方性氟中毒病区分布的相关信息,选取辽宁省在历史上有代表性的4地区作为调查点,即沈阳市康平县望山堡村、锦州凌海市南建业村、阜新市彰武县丰田乡丰田村和沈阳市法库县黄荒地村。选取该4个调查点中17岁以上的常住农村居民作为调查对象。采取入户调查的方式进行资料的收集和样本的采集。收集的人口统计学资料包括,年龄、性别、文化程度、职业、吸烟、饮酒及健康情况等。并采集水样、尿样和血样。本次研究从461名调查对象中随机抽取了86人,作为骨代谢分子标志物OPG和RANKL的检测对象。根据中华人民共和国卫生行业标准,将尿氟值>1.6 mg／L的全部调查对象共计47人作为高氟暴露组(简称：高氟组),并从尿氟值≤1.6 mg/L的调查对象中随机抽取39人作为对照组。二、样品采集与测定(一)尿样采集及测定采集调查对象随时一次性尿样10 mL,记录姓名、编号,保存于-20℃冰箱中待测。采用氟离子选择电极法测定尿氟含量。(二)血样的采集及测定用抗凝真空采血管采集调查对象清晨空腹血样5 mL,做好记录,室温静置2小时后,以3000 rpm离心20分钟,分离血清,分装贮存于-70℃冰箱中待测。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清中OPG和RANKL含量。血清OPG和RANKL含量测定所用的两种试剂盒均购自奥地利Biomedica Medizinpordukte GmbH & Co KG公司。操作过程严格按照试剂盒说明书进行。结果计算时所有检测结果都减去空白值。根据标准液的结果值,通过计算机软件拟合出标准曲线,通过标准曲线求出标本血清中OPG和RANKL浓度值。浓度单位为pg/mL。叁、统计分析方法采用SPSS13.0统计软件包对实验数据进行录入,采用t检验、χ2检验、非参数检验、Spearman相关分析等对数据进行统计分析。检验水准为α=0.05。实验结果1、高氟组和对照组人群尿氟含量分布尿氟>1.6mg/L为高氟组,尿氟≤1.6mg／L为对照组。本次调查尿氟含量>1.6mg／L47人,M为3.40mg/L,QR为1.22 mg／L。尿氟含量≤1.6mg/L39人,M为0.60mg/L,QR为0.22 mg/L。2、高氟组和对照组人口学特征比较高氟组和对照组在性别构成上和年龄分布上无统计学差异。3、比较不同尿氟人群血清中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL比值不同尿氟人群血清中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL之间的差异无统计学意义。4、分性别比较不同尿氟人群血清中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL比值高氟组和对照组中,不同性别间血清中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL比值差异无统计学意义。5、分年龄比较不同尿氟人群血清中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL比值高氟组和对照组中,>50岁人群血清OPG含量和OPG/RANKL比值高于≤50岁人群血清OPG含量和OPG/RANKL比值,差异有统计学意义。6、高氟组和对照组血清中OPG含量与年龄之间的相关分析对照组中,男性和女性血清中OPG含量均与年龄呈正相关关系。高氟组中,男性和女性血清OPG含量均与年龄呈正相关关系。结论1、在本次调查的氟暴露条件下,尚未发现高氟暴露对人群血清OPG、RANKL及OPG/RANKL有影响。2、男性和女性的血清中OPG含量均随年龄的增长而升高。
金小岚[10]1995年在《氟，羟乙磷酸钠和1，25双羟维生素D_3干预对去卵巢大鼠骨的骨计量学和生物力学性质的影响》文中进行了进一步梳理氟主要通过刺激成骨前体细胞的增殖达到刺激骨形成，增加骨量的效应。活性维生素D_3是一种分化诱导因子，能诱导成骨前体细胞分化成熟。骨计骨学研究表明：氟治疗骨质疏松常伴有矿化缺陷和继发性甲状旁腺功能亢进(甲旁亢)的表现，提示在氟的强烈的刺激成骨作用下，有钙缺乏状态存在。因此，联合应用氟和活性维生素D_3，不仅有可能通过刺激成骨前体细胞的增殖和分化成熟两个环节，产生更大的成骨效应，还能促进肠钙的吸收，纠正氟治疗引起的钙缺乏状态，消除矿化缺陷和继发性甲旁亢，达到增加骨的力学性质和抗骨折能力的目的。 双磷酸盐是无机焦磷酸盐的类似物，它主要通过抑制破骨细胞的募集和破骨前体细胞的分化成熟，从而抑制骨吸收，降低骨转换，在骨计量学上表现为降低小梁骨的“吸收深度”和“刺激频率”，因而能减少“穿孔”吸收的发生，保护骨的的显微结构。氟虽能刺激骨的形成，但并不影响骨的转换，在高的骨转换状态下，氟治疗有可能加重骨的矿化异常，导致骨力学稳定性的破坏，因此，联合应用刺激骨形成的氟和抑制骨吸收的双磷酸盐，可能达到增加骨量，减少“穿孔”吸收，抑制骨转换，改善骨的力学性质，增加抗骨折效应的目的。 本研究，选用4 1／2月龄的健康雌性Wistar大鼠48只，随机分为六组：假手术组(Sham)，去卵巢不处理组(OVX)，去卵巢单用氟钙制剂处理组(0.45mgF~-+13.56mg ca~(++)／kg／d)(O+F)，和氟钙制剂与1、25(OH)_2D_3联合处理组(0.45mgF~-+13.56mg ca~(++)／kg／d+135pmol 1，25(OH)_2D_3／d)(O+F+D)，去卵巢单用羟乙磷酸钠处理组(1mg／kg／d)(O+EP)和氟钙制剂与羟乙磷酸钠联合用药组(0.45mgF~-+13.56mg ca~(++)+1mg EHDP／kg／d)。采用预防性给药方式，共给药7周。我们研究了这四种不同干预措施对胫骨干骺端次级小梁骨的骨计量学指标和股骨中段生物力学性质影响，结果发现： ①去卵巢组与假手术组比较，去卵巢组大鼠的刺激频率增加74％(P＜0.001)，破骨细胞侵蚀表面增加100％(P＜0.05)。小梁骨数量减少49％(P＜0.05)，小梁骨分离度增加80％(P＜0.001)，而小梁骨面积减少39.4％(P＜0.05)，表明去卵巢早期(7周)，破骨细胞活性增加，骨转换加速，小梁骨骨量的丢失主要是由于“穿孔”吸收导致显微结构的破坏所致。 ②与OVX组比较O+F组，O+F+D组，O+EP组和O+EP+F组小
参考文献：
[1]. 氟对破骨细胞增殖的影响及可能的分子机制[D]. 白生宾. 中南大学. 2012
[2]. 氟对兔体外破骨细胞性骨吸收影响的研究[J]. 马雷, 林兆全, 刘开泰. 新疆医科大学学报. 2004
[3]. 氟对体外破骨细胞性骨吸收影响的研究[D]. 马雷. 新疆医科大学. 2003
[4]. 体外诱导培养鸡胚破骨细胞及钙、磷对其活性的影响[D]. 薛永峰. 扬州大学. 2010
[5]. TGF-β及其受体信号通路在氟调控破骨细胞分化中的作用[D]. 王岩. 吉林大学. 2017
[6]. 成骨细胞和破骨细胞的体外培养及氟对其的影响[D]. 吴培福. 甘肃农业大学. 2004
[7]. 氟化物对体外培养的大鼠破骨细胞活性的影响[J]. 华坤, 卜丽莎, 李广生. 中华预防医学杂志. 2003
[8]. 胰岛素及胰岛素受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用[D]. 吕鹏. 吉林大学. 2015
[9]. 高氟暴露对人群血清OPG、RANKL及OPG/RANKL影响的研究[D]. 王芳. 中国医科大学. 2010
[10]. 氟，羟乙磷酸钠和1，25双羟维生素D_3干预对去卵巢大鼠骨的骨计量学和生物力学性质的影响[D]. 金小岚. 中国协和医科大学. 1995