许文胜 康文磊 陈永军 杨增华 张 涛
包头医学院第一附属医院骨三科 内蒙古包头 014010
摘要：目的：观察石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微结构的影响，观察相关细胞的形态学变化，分析探讨其作用机制。[方法]：将30只雌性KM小鼠按体重随机分为3组：空白对照组、实验对照组、实验组，除空白对照组实施假手术外，其余2组全部在麻醉下切除卵巢制作成骨质疏松症模型，分别给实验对照组和实验组喂食普通饲料和添加一定剂量的石榴籽油的饲料，4周后拟对小鼠股骨近端骨小梁微结构进行检测。同时对4周后三组动物采血获得其血清，利用体外血清培养成骨细胞和破骨细胞，研究三组动物血清对成骨细胞和破骨细胞相关基因表达的影响。[结果]：实验对照组动物股骨近端骨小梁微结构破坏程度最为严重，其次为实验组，空白组骨小梁微结构正常；石榴籽油代谢物（CLA9C）抑制RANKL诱导破骨细胞的分化，通过增加碱性磷酸酶（ALP）活性和基质矿化促进成骨，同时，主要的转录水平（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN and成骨细胞标记物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈现显著上调。[结论]：石榴子油可以抑制雌激素相关的骨质疏松症骨量的丢失同时可以促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞活性
关键词：石榴籽油；雌激素相关骨质疏松症；骨量的影响；分子机制
Keywords：pomegranate seed oil；osteoporosis；regulation of estrogen；prevents bone loss and molecular mechanism
近年来，有关石榴食用和药用价值的研究越来越为人们所关注，石榴籽油富含不饱和脂肪酸-石榴酸，具备多种药理功能，本研究旨在观察石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微结构的影响，观察相关组织形态学变化，分析探讨其作用机制，为预防和治疗女性绝经后骨质疏松症提供安全、经济、有效的食物或药物做初步探讨。
1、材料与方法
1.1建立动物模型、分组和膳食干预
将30只雌性KM小鼠按体重随机分为3组：空白对照组、实验对照组和实验组，除空白对照组实施模拟手术外，其余2组全部在麻醉下切除卵巢制作成骨质疏松症模型，给模拟组和实验组喂食普通饲料和添加5%石榴籽油的饲料，4周后麻醉下处死小鼠，取出双侧股骨加以检测分析
1.2组织形态学检测
对实验动物股骨近端进行5μm厚非脱灰组织切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）进行染色。形态学计量用与光学纤维镜相连的半自动显微图像分析仪（型号：TRH-JX2000A/B），对股骨近端二次海绵骨组织构造，进行定量分析，内容包括骨的骨量/组织量、骨小梁厚度和骨小梁间距，并对酒石酸抵抗性酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞的数目进行测定。
1.3模型动物体外血清实验
将30只8周龄的KM小鼠（购自内蒙古大学实验动物中心）经过1周的适应性喂养，随机分为2组（N=15），一组是PSO组，另一组是普通对照组，PSO组每天的灌胃剂量为200μG，对照组使用相同的剂量，10天后，麻醉下心脏抽血离心（3000r/min，5min 室温），去上清液，与同一组动物血清混合，过滤45μM，分装并储存在-80℃直到细胞使用到培养基为止。
以最适浓度的 NF-k B受体活化因子配体（RANKL）作为诱导剂，在体外细胞培养基诱导培养小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞分化为破骨细胞，待破骨细胞分化成熟后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法进行破骨细胞鉴定，并采用real-timePCR方法检测各不同处理组之间，破骨细胞表型基因及功能基因NF-κB受体活化因子（RANK）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、破骨细胞降钙素受体（CTR）、组织蛋白酶K（CTSK）、趋化因子受体CCR2和整合素基因β3（ITG -β3）的mRNA表达的差异。经过体外特定培养基培养小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，检测细胞的增殖及基因的表达量，对骨碱性磷酸酶（ALP）、骨保护素基因（OPG）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、盘状结构域受体2（DDR2）、Ⅰ型胶原蛋白（Coll1a1）进行检测。
2结果
图1 3组动物股骨近端骨小梁微结构变化比较
图2 对特定细胞因子蛋白表达的调节作用
3讨论
绝经后骨质疏松症（POP）是老年妇女的常见病和多发病，是以骨量减少，骨小梁微结构破坏，脆性骨折风险性增加为主要特征的全身性骨骼系统疾病[1]。
3.1雌激素对骨质疏松症的作用关系
雌激素对骨质疏松发病的影响主要是通过以下途经实现。1.对钙调节激素的作用 雌激素可以增强肝25-羟化酶肾1α-羟化酶活性，提高1，25-双羟维生素D水平，促进肠钙吸收并使钙盐和磷盐在骨质中沉积从而促进骨基质合成。雌激素还有拮抗甲状旁腺素的作用与甲状旁腺素共同维持血中钙磷平衡。甲状旁腺素是刺激骨溶解的激素，当雌激素减少，对甲状旁腺素拮抗作用减弱可以加速骨质消融而逐渐发展为骨质疏松。降钙素具有抑制破骨细胞活性，雌激素可促进降钙素分泌。2.通过细胞因子的作用参与骨形成与吸收过程 自从1988年Komm证明成骨细胞中有雌激素受体存在之后，Ernst发现外源性雌激素可促进大鼠成骨细胞产生IGF-I。由于IGF-I的产生增强使雌激素受体过度表达。还发现雌激素能促进成骨细胞中TGF-β的产生[2]，表明这些生长因子对骨形成有促进作用，雌激素通过这些生长因子的产生，促进骨形成。实验表明，当雌激素缺乏，骨髓单核细胞分泌IL-1和间质细胞分泌IL-6都增多。Pacifici等还发现在培养的末梢血单核细胞中能产生TNF-α和GM-CSF；切除卵巢的患者体内TNF-α和GM-CSF水平升高，接受雌激素治疗的患者TNF-α和GM-CSF恢复到正常水平。以上细胞因子对骨吸收过程有促进作用，雌激素通过抑制上述细胞因子的产生而抑制骨吸收。3.雌激素对骨细胞的直接作用 自从1988年komm健康搜索在成骨细胞上发现了雌激素受体（ER），1990年Penlser又在破骨细胞上发现了雌激素受体，更加明确了雌激素与骨细胞的直接作用关系，雌激素可与成骨细胞和破骨细胞上的雌激素受体结合，直接抑制破骨细胞的溶酶体酶活性，降低其在骨切片上产生陷窝的能力[3]。
最近的研究证实卵巢切除的小鼠峰值骨量低，由于小鼠基因易于调控，可借助分子生物学技术，对其基因进行研究，以便定位决定峰量骨值的基因[4]。骨是由成骨（osteoblast OB）和破骨细胞（osteoclast OC）共同作用维持的组织，成年后骨不断进行更新和改造，即骨重建（bone remodeling），成骨细胞控制的骨形成和破骨细胞控制的骨吸收之间的平衡保证了骨重建的正常进行。在骨重建过程中，破骨细胞是“启动子”，成骨细胞是“调节者”，骨保护蛋白、NF-JB 受体活化因子配体是偶联成骨细胞和破骨细胞分化、活化与生物活性的主要因子。OPG是一个分泌型的TNF受体，是骨代谢的重要负调控因子，能抑制OC 生成、活化，减少骨吸收，增加骨密度，它主要通过直接结合成骨/基质细胞上RANKL发挥骨保护作用[5]。RANKL是诱导OC 生成的关键性细胞因子，通过作用于OC 上的受体RANK，刺激OC 形成、分化和活化，增强骨吸收。OPG竞争性结合RANKL，阻断RANKL与其靶信号受体RANK的结合，抑制RANKL /RANK对破骨细胞信号转导的活化，减少OC 生成，发挥抗骨质疏松作用。因此，RANKL /OPG 比值决定破骨细胞分化、成熟及功能。[6]
3.2、石榴籽油的结构与理化特性
石榴籽油（PSO）是唯一植物来源的多不饱和共轭脂肪酸，由石榴籽通过化学工艺萃取而来，其主要含有六种脂肪酸：石榴酸、亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸等。而石榴酸是石榴籽油的最主要成分，约占86％。石榴酸的分子结构为：
因石榴酸的结构与共轭亚油酸（CLA）最为接近而将其称为”超级共轭亚油酸”，近些年国内外研究表明，石榴籽油具有多种药理作用，包括抗氧化、清除自由基和抗衰老；抗基因突变与抗癌作用；降低血压、血糖、血脂和抗动脉粥样硬化的功能；雌激素样作用；抗腹泻、抑制大肠杆菌等致病菌的生长及其肠毒素的产生等；其中雌激素样作用在动物实验研究方面表明[7]，以含石榴提取物的溶液喂饲卵巢切除的大鼠，更年期症状得到有效缓解，即大鼠的增重得到控制，子宫重量有所增加，骨质流失受到抑制，抑郁症状明显减轻，更年期的持续时间缩短，各项骨骼组织参数均接近正常大鼠的水平。石榴缓解更年期综合症的作用与其所含类雌激素物质具有参与脂代谢、保留骨质、增强中枢肾上腺系统的功能和类雌激素样作用有关。
3.3、石榴籽油对雌激素相关的骨质疏松症小鼠骨量的影响
石榴富含类固醇激素和植物雌激素，其中植物雌激素对人体具有双向调节作用，即当体内雌激素水平较低时，它们直接与雌激素受体结合发挥雌激素效应；当体内雌激素水平较高时，它们与雌醇竞争性结合雌激素受体，从而表现出抗雌激素作用。雌激素能促进成骨细胞中TGF-β的产生，表明这些生长因子对骨形成有促进作用，雌激素通过这些生长因子的产生，促进骨形成[8]。实验表明[9]，当雌激素缺乏，骨髓单核细胞分泌IL-1和间质细胞分泌IL-6都增多，切除卵巢的患者体内TNF-α和GM-CSF水平升高，接受雌激素治疗的患者TNF-α和GM-CSF恢复到正常水平。以上细胞因子对骨吸收过程有促进作用，雌激素通过抑制上述细胞因子的产生而抑制骨吸收。骨密度是用单位面积或体积内的矿物质含量来表示 骨密度测定是直接反映骨矿物质丢失的敏感指标，其在骨量丢失5%时双能 X 线骨密度仪即可检出。本实验小鼠股骨近端进行5μm厚非脱灰组织切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）进行染色。形态学计量用与光学纤维镜相连的半自动图像分析仪，对股骨近端二次海绵骨组织构造，进行定量分析表明，石榴籽油具有抑制雌激素相关的骨质疏松症小鼠骨量减少的作用，其抑制骨量减少的作用机制可能与促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞增殖有关。
3.4、石榴籽油抑制骨质疏松症小鼠骨量的丢失分子机制的探讨
Ahmed 等研究发现石榴果提取物可抑制软骨外植体中白介素-1β诱导的蛋白多糖的分解。6.25~25mg?L-1的石榴果实提取物即可在细胞水平上将白介素-1β诱导的基质金属蛋白酶MMP-1，MMP-3，MMP -13蛋白的表达水平抑制到中等水平[10]。本研究表明，给骨质疏松症小鼠喂食5%石榴籽油饲料，4周后采血，利用体外血清培养成骨细胞和破骨细胞，研究石榴籽油对成骨细胞和破骨细胞相关基因表达的影响。结果表明：石榴籽油可能通过下调破骨细胞的基因表达抑制破骨细胞的活性。在体外血清试验中，通过检测特定破骨细胞分化标记物的表达（MMP9，CTR，和 TRAP等）进一步验证了石榴籽油代谢物（CLA9C）抑制RANKL诱导osteoclast differentiation，as shown by down-regulation of specific破骨细胞的分化。另一方面，对成骨细胞胚胎前体的MC3T3-E1细胞加以培养，通过增加碱性磷酸酶（ALP）活性和证明matrix mineralization.In addition，transcriptional levels of major基质矿化表明石榴籽油血清能促进成骨，同时，主要的转录水平osteoblast lineage markers（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN and成骨细胞标记物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈现显著上调。在培养体系中加入不同比例的石榴籽油和玉米油，通过检测RAW264.7细胞分化因子MMP9，CTR，ITG β3，RANK-RANKL的表达以及 MC3T3-E1细胞DDR2，Coll1a1，BSP等的表达证实了石榴籽油对特定细胞因子蛋白的表达具有调节作用。
综上所述，石榴籽油作为石榴果实的重要组成部分，对雌激素相关的骨质疏松症骨量丢失方面具有抑制作用。同时石榴籽油作为一种天然果实成分，有可能成为女性绝经后防治骨质疏松症方面安全、有效而经济的食品或药物之一。
参考文献：
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[7]Pomegranate extract improves a depressive state and bone properties in menopausal syndrome model ovariectomized mice[J].Journal of Ethnopharmacology，2004，92：93-101
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[10]Ahmed S，Wang N，Hafeez BB，et al.Punica granatum L.Extract Inhibits IL-1β-Induced Expression of Matrix Metalloproteinases by Inhibiting the Activation of MAP Kinases and NF-kB in Human Chondrocytes In Vitro.Nutrition，2005，135（9）：2096~2102.
作者简介：许文胜，男，副主任医师，主要从事创伤骨科研究。
项目基金：包头市社会发展科技支撑项目 编号：2014S2003-5-12
项目基金：内蒙古自治区自然科学基金项目 编号：2014MS0812
论文作者:许文胜,康文磊,陈永军,杨增华,张涛
论文发表刊物:《健康世界》2015年20期供稿
论文发表时间:2016/2/16
标签：雌激素论文; 细胞论文; 石榴论文; 小鼠论文; 受体论文; 作用论文; 抑制论文; 《健康世界》2015年20期供稿论文;