连云港市第一人民医院心内科，江苏连云港222000
通讯作者:高大胜,蚌埠医学院附院心内科主任医师，副教授，
摘要：研究肿瘤坏死因子βC804A基因多态性分布及其与冠心病（CHD）发病的相关性，对151例CHD患者与75例健康对照组进行病例对照研究，发现冠心病组TNF-βC804A基因型分布与对照组相比有显著统计学意义（X2=11.794，P=0.003）。等位基因的相对风险分析发现含A等位基因人群患CHD的危险性是对照组的2.012倍（OR=2.012，95%CI：1.353，2.993），提示该位点A等位基因可能是CHD的易感基因，主要表现在AA基因型的患者，其在病例组中出现频率高于对照组，有统计学差异（X2=5.068，P=0.026），AA基因型人群患CHD风险增加2.031倍（OR=2.031,95%CI：1.090，3.185），而携带C等位基因的人群患CHD的风险为对照组的0.497倍（OR=0.497,95%CI:0.334，0.739），尤其CC型在对照组中出现的频率高于病例组，有明显的统计学差异（X2=10.694，P=0.001），携带CC基因型人群患CHD的风险为0.353（OR=0.353，95%CI:0.186，0.667）从而提示C等位基因可能是CHD的保护基因。
关键词：肿瘤坏死因子β；基因多态性；冠心病；易感基因；聚合酶链反应-序列特异性扩增技术
冠心病（coronary heart disease,CHD）不仅仅是一种脂肪沉积类疾病，机体炎症在粥样血栓的形成及发展中也起着关键的作用,并且人们发现某些基因可以影响炎症发生从而可能成为冠心病的独立危险因素。因而检测并确定冠心病的易感基因型对早期预防甚至诊断冠心病具有重要意义。本研究对TNF-βC804A基因进行基因多态性分析，探索其与冠心病发病的关系。
1 对象及方法
1.1对象及分组
所选对象为我院拟冠心病收住入院的226例患者，所选研究对象均经冠状动脉造影（CAG）检查,证实为冠心病者151例，其中男100例，女51例，年龄34-83岁，平均年龄（61.7±9.9）岁；余75人经冠状动脉造影检查排除冠心病，其中男47例，女28例，年龄33-79岁，平均年龄（59.4±10.8）岁，作为健康对照组，两组在年龄、性别、血脂等冠心病危险因素上无差别。
1.2 模板提取
采用全血基因组提取试剂盒提取外周血细胞DNA，参考文献[1]设计一对外引物，P1：5’CCGTGCTTCGTGCTTTGGACCT-3’P2: 5’AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG -3’，扩增包含804位点的740bp的基因片段，针对该位点等位基因设计两条特异性引物，P3:5’GAGGTGAGCAGCAGGTTTGAGGG-3’P4:5’GAGGTGAGCAGCAGGTTTGAGGT-3’,与P2配对，扩增相应的等位基因片段，产物为694bp片段。
1.3 扩增方法及产物鉴定
首先应用外引物P1，P2，扩增体系包含P1，P2、模板DNA、 PCR-master Mix(2X)、灭菌用水。扩增条件：95℃预变性7分钟，按以下条件循环32次，95℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸30秒。末次循环后，72℃再延伸7分钟。然后用特异性引物P2和P3（或P4）扩增第一步产物，得到目的基因片段，扩增体系包含P2,P3（或P4）、第一步扩增产物、 PCR-master Mix(2X)、灭菌用水，扩增条件：95℃预变性6分钟，按以下条件循环7次，95℃变性45秒，65℃退火5秒，72℃延伸30秒。末次循环后，72℃再延伸7分钟。取2μl产物加1μl×buffer混匀后进行凝胶电泳，分析判读，使用特异性引物对P2与P3（或者P4）时扩增出694bp产物时为AA或者CC型，两者均能扩增出者为CA型。
1.4 冠脉狭窄程度评价
冠状动脉病变狭窄程度采用Gensini评分系统进行评定，各病变支得分总和即为患者的冠脉病变狭窄程度总积分。
1.5 统计学处理
基因频率采用频数计数法，计量资料采用t检验，采用SPSS17.0软件包进行处理。
2 结果
2.1 冠心病组和对照组肿瘤坏死因子β804位点基因型及等位基因频率比较
病例组TNF-β804位点AA、CA、CC型的基因频率与对照组相比有统计学差异（P<0.05）(表2.1)；其中病例组A等位基因频率为61.2%，C等位基因频率为38.8%，对照组A等位基因频率为44%，C等位基因频率为56%，等位基因频率亦有统计学差异（P<0.05）；在对TNF-β804位点基因频率的相对风险分析时发现携带A等位基因的人群患CHD的风险增加2.012倍（OR=2.012，95%CI：1.353，2.993），可见该位点A等位基因可能是CHD的易感基因，主要表现在AA基因型的患者，其在病例组中出现频率高于对照组并有显著的统计学差异（X2=5.068，P=0.026），AA型等位基因患CHD风险增加2.031倍（OR=2.031,95%CI：1.090，3.185）（表2.2），提示携带该等位基因是患CHD独立的危险因素。
而在对TNF-β804位点C等位基因进行相对危险分析时发现携带C等位基因的人群患CHD的风险为对照组的0.497（OR=0.497,95%CI:0.334，0.739）（表2.3），尤其CC型在对照组中出现的频率高于病例组，有明显的统计学差异（X2=10.694，P=0.001），携带CC基因型的患CHD的风险为0.353（OR=0.353，95%CI:0.186，0.667）（表2.2）。
2.2 病例组中肿瘤坏死因子β804位点基因型与冠脉狭窄程度比较
在运用Gensini评分系统对CHD组冠脉狭窄情况进行评价时发现，TNF-β804位点AA基因型患者狭窄积分高于CC和CA基因型患者，两者具有明显统计学差异（t=6.787，P<0.01）。(表2.4)
表2.1病例组与对照组TNF-β804位点基因频率比较
3 讨论
在动脉粥样硬化过程中，TNF-β可诱发血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和某些淋巴细胞表达大量的粘附分子和细胞因子，从而释放大量活性氧与弹性蛋白酶，损伤血管内皮细胞，刺激组织因子的表达和产生，抑制凝血酶调节蛋白合成，破坏凝血-抗凝血平衡，促使血栓形成，同时血管内皮细胞表达组织纤溶酶原激活剂，促进其抑制物的表达，导致纤溶活性降低，利于血栓形成。在CHD患者中，全身和局部的炎症引起斑块表面纤维帽破裂，是急性腔内血栓形成的重要原因，从而诱发冠状动脉急性闭塞，出现心肌梗死，TNF-β804位点外显子3 C/A(Thr26Asn)变异后苏氨酸突变为天门冬氨酸（T26N）,在利用Escherichia coli体内重组后的TNF-β时,发现在携带T26N基因的Escherichia coli体内刺激产生血管细胞粘附分子1 (ICAM -1)和E－选择素（E-selectin）的能力提高了2倍[2]。
最早由日本的Ozaki[3]等人研究发现日本籍心肌梗死的病人常染色体6P21上TNF-β基因和心肌梗死易感性具有密切的相关性，其804位点T26N基因频率高于健康对照组， Shinichiro Suna[4]等人通过对包含3486例心梗患者经过10年随访发现携带A等位基因的患者死亡率明显高于不含A等位基因的患者，提示C804A基因可能成为心梗患者预测的潜在目标。欧洲的PROCARDIS[5]研究对欧洲的白人家庭进行研究也确定TNF-βC804A为CHD易感基因，这些研究结果似乎都进一步支持了TNF-βT26N基因刺激机体炎症反应而最终导致了血栓形成，从而促进了血栓类疾病的发生，国内的学者 [6]经过包含19404例心梗患者及13684例健康人群进行研究发现TNF-β804位点A等位基因显著增加心梗风险。但是在Ozaki之后的日本学者进行研究却得出了该基因与心肌梗死没有相关性的结论[7]，Koch[8,9]等在德国人群中，对患有冠心病，尤其心肌梗死以及支架植入术后再狭窄、死亡、再梗死的病例组(3657人)与对照组(1211人)进行统计分析后亦得出了冠心病的危险度与TNF-β基因多态性呈负相关的结论 (OR 0.88, 95% CI 0.80～0.98; P = 0.015)，包括Brown B[10]等对英国671个心肌梗死三人组家庭也进行类似研究也发现与Thr26Asn基因没有相关性，甚至Clarke[11]进行了迄今为止最大规模的病例对照研究，囊括了7个单核苷酸多态性序列,却也发现TNF-β基因多态性与冠心病包括急性心肌梗死的易感性没有相关性(x62=7.97,p=0.24)，欧洲学者则认为这种分歧是在病例对照组设置中存在抽样误差所致[8]。因此针对TNF-β基因多态性与CHD的关系仍需要进一步探索，达到共识还需要一段时间。
目前针对CHD易感基因的研究，是基因领域研究的热点，但尚未达成一致的结论，可能存在更多的易感基因尚未发现，并且基因位点对CHD的发病中，各种易感基因的基因型对于某些蛋白功能、炎症介质的影响，并未完全发现，甚至TNF-β在促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化等方面的作用尚不明确，随着这些问题的深入研究，该位点易感基因的研究也会更加清晰，在实验疾病的一级预防，甚至早期诊断上无疑将具有重要意义。
参考文献
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论文作者:徐良成,高大胜
论文发表刊物:《健康世界》2015年6期
论文发表时间:2015/9/28
标签：基因论文; 冠心病论文; 等位基因论文; 病例论文; 对照组论文; 频率论文; 多态性论文; 《健康世界》2015年6期论文;