1.湖南中医药大学第一附属医院普外科 湖南长沙 410007
摘要：目的 探讨白藜芦醇白蛋白纳米粒对体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞株凋亡的影响，为白藜芦醇纳米制剂的临床应用及胆囊癌的临床治疗提供新的思路。方法 将实验对象分为空白对照组、阳性药物5-Fu对照组、白藜芦醇组、白藜芦醇白蛋白纳米颗粒组、空白纳米粒组，并利用CCK-8及RT-PCR评估其体外抗肿瘤活性，检测不同浓度及药物组对凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平的影响。结果（1）白藜芦醇及其纳米粒、5-Fu在10~80μg/ml浓度区间对GBC-SD细胞的生长有抑制作用，且呈一定的浓度依赖性。与RES相比，在20~80μg/ml浓度时5-Fu与RES-BSANP对胆囊癌GBC-SD的增殖抑制率明显增强。（2）三种药物均能通过上调胆囊癌GBC-SD细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的相对表达量，促进胆囊癌细胞凋亡。结论 白藜芦醇白蛋白纳米粒对胆囊癌GBC-SD细胞株增殖有明显的抑制作用，而且抑制作用相较于单独的白藜芦醇要更强，这种作用机制可能与上调凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 有关。
关键词：白藜芦醇；白蛋白纳米粒；胆囊癌；Caspase
The Effect Of Resveratrol Albumin Nanoparticles On Cell Apoptosis Of Human Gallbladder Carcinoma GBC-SD Cells
Yang Jianbo1 Li Jiayi1 Ding Dan1 Zhang Wengxing1
（1. General Surgery Department，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha Hunan，410007）
Abstract：【Objective】To prepare the RES-BSANP，and to explore the effect and mechanism research of the proliferation and apoptosis for human cholecystic cell line GBC-SD in vitro. Provides new way for RES' clinical application and cancer clinical care. 【Methods】 The encapsulation efficiency and drug loading of albumin were determined by HPLC method. The RES and RES-BSANP were measured by CCK-8 method. And the effect of RES and RES-BSANP on the expression of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 were detected by polymerase chain reaction . 【Results】（1） Compared with RES，5-Fu and RES-BSANP inhibited the proliferation of gallbladder carcinoma GBC-SD was significantly enhanced in 20~80 μg/ml concentration，and showed concentration dependent on the 10~80 μg/ml in the range of concentration.（2）5-Fu，RES and albumin nanoparticles can increase the relative expression of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 mRNA in gallbladder carcinoma cell line GBC-SD. Which indicates that the three can affect the Caspase signal transduction pathway，activation of Caspase-8 and Caspase-9 respectively into exogenous and endogenous apoptosis，stimulate Caspase cascade，activation of downstream effectors in common Caspase-3，thereby promoting apoptosis of gallbladder cancer cells，the inhibition of cell proliferation of gallbladder carcinoma. Conclusion RES-BSANP have a significant inhibitory effect on the proliferation of gallbladder carcinoma GBC-SD cells，and the inhibitory effect is stronger than that of RES alone. This mechanism may be related to up-regulation of Caspase gene expression，leading to apoptosis.【Conclusion】RES-BSANP have a significant inhibitory effect on the proliferation of gallbladder carcinoma GBC-SD cells，and the inhibitory effect is stronger than that of RES alone. This mechanism may be related to up-regulation of Caspase gene expression，leading to apoptosis.
Keywords：RES；Albumin nanoparticles；Gallbladder Neoplasms；Caspase
胆囊癌（Gallbladder carcinoma，GBC）是一种最常见的胆系恶性肿瘤，以起病隐匿、早期诊断难、恶性程度高、早期易转移等为主要临床特点，严重威胁人类健康[1，2]。而目前国内外对胆囊癌的诊断和治疗仍无突破性进展，以手术为主的治疗方案对中晚期胆囊癌效果欠佳，术后5年生存率低，需术后辅助化疗[3，4]。但目前胆囊癌化疗敏感度不高、副作用大，因此寻找安全、更有效的抗癌药物对胆囊癌的辅助治疗意义重大，其中中医药资源、天然植物抗肿瘤药物成分提供了新思路。现代药理研究证实，从虎杖、葡萄中提取的抗肿瘤物质--白藜芦醇（RES）对多种肿瘤细胞包括胆囊癌细胞可抑制细胞生长的作用，并可诱导细胞凋亡[5]。利用白蛋白纳米载药技术改善白藜芦醇难溶于水、生物利用度低的化学性质，我们制备了白藜芦醇白蛋白纳米颗粒（RES-BSANP），对比RES及其白蛋白纳米制剂的生物利用度及对人胆囊癌细胞GBC-SD细胞的体外抗肿瘤作用。
1 资料与方法
1.1?细胞株及培养方法
选择人胆囊低分化腺癌细胞系GBC-SD为受体细胞，在37℃、5%CO2及饱和湿度下，含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，细胞呈单层贴壁生长，每周传代2-3次。
1.2主要材料
白藜芦醇白蛋白纳米粒（由湘雅医学院肝胆肠纳米实验室提供）、98%白藜芦醇、5-Fu、BSA FractionV、逆转录试剂盒、引物、细胞增殖与毒性检测试剂盒。高速离心机、净化工作台、超微量分光光度计、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、酶标仪、CO2培养箱、单通道移液器、微量移液器。
1.3?CCK-8检测细胞增殖抑制率
细胞增殖与毒性检测试剂盒4℃避光保存。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板，缓冲液填充边缘。CO2培养箱中培养24h后给药干预。分组方法：根据干预药物（5-Fu、白藜芦醇、白藜芦醇白蛋白纳米粒）浓度设置10、20、40、80μg/mL?5个药物浓度组，并设置GBC-SD细胞空白对照组及空白纳米粒组，每组各5重复孔。按实验需要，5%CO2，37℃培养48h。每孔加入10ul试剂盒中7sea-cell counting kit溶液，同步设调零孔。继续培养2h。用酶标仪检测得OD450。记录结果并绘制曲线图，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。
1.4 ?RT-PCR检测细胞Caspase-3/8/9 mRNA表达
收集对数生长期肿瘤细胞，以3×l04个/孔接种于孔板中，同1.5分组，药物组根据CCK-8检测结果取1/2 LC50（40μg/mL）进行实验。根据 RT-PCR法行总RNA提取、引物设计、逆转录合成cDNA、扩增，并使用bio-rad自带软件Image Lab分析得到目的与内参条带的光密度值比值，比较对照组和用药组Caspase-3/8/9 mRNA基因表达的异同。
1.5 统计学处理
数据采用SPSS18.0统计软件处理，多组计量资料比较采用单因素方差分析，两组组间比较方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett T3检验。P<0.05表示有统计学意义。
2结果
2.1 CCK-8检测GBC-SD细胞增殖率
以空白组、空白纳米粒及三种不同浓度的药物组分别处理细胞48h，CCK-8法测定各组对胆囊癌GBC-SD细胞的生长抑制作用。拟定空白对照组对胆囊癌细胞增殖抑制率为0%，结果显示空白纳米粒组对GBC-SD细胞的生长基本无抑制作用，提示空白纳米粒对GBC-SD细胞生长无影响，可排除白蛋白纳米粒对GBC-SD细胞的影响。而三种药物组在10~80μg/ml浓度区间对GBC-SD细胞的生长有抑制作用，且呈一定的浓度依赖性。比较同浓度下不同药物对胆囊癌细胞的增殖抑制率，结果显示当药物浓度为10ug/ml时，三组之间细胞抑制率无统计学意义（P＞0.05）；药物浓度为20ug/ml时，RES-BSANP＞RES（P＜0.05），5-Fu与两者相比均无统计学意义（P＞0.05）；药物浓度为40ug/ml、80ug/ml时，RES-BSANP、5Fu＞RES（P＜0.05），在此浓度区间内，5Fu与RES-BSANP结果出现反转，当浓度为80ug/ml从均数上显示5Fu反超RES-BSANP，但这种差异并无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 RT-PCR检测Caspase-3/8/9mRNA表达的结果
药物组取40μg/μl作为实验终浓度，应用bio-rad自带软件Image Lab分析得到目的条带与内参条带的光密度值比值。空白对照及空白纳米粒组间各值比较无统计学意义；5-Fu、RES及RES-BSANP组同空白、空白纳米粒组相比，各药物组作用的细胞中Caspase3/8/9 mRNA的相对表达量均有显著性差异，表明5-Fu、RES及RES-BSANP三种药物均能明显提高人胆囊癌GBC-SD细胞中凋亡相关基因Caspase3/8/9 mRNA的相对表达量，其中各药物组Caspase3/8/9 mRNA的相对表达量依次为5-Fu组＞RES-BSANP组＞RES组。药物组组间对比：与5-Fu组相比，RES、RES-BSANP作用的细胞中Caspase-3 mRNA相对表达量降低（P＜0.05），余无统计学意义；与RES组相比，RES-BSANP作用的细胞中Caspase-3 mRNA相对表达量增高（P＜0.05），余无统计学意义。
3 讨论
RES是一种存在于葡萄科、蓼科中的抗毒素，其在防治肿瘤、心血管疾病及调节免疫等方面的巨大潜力。近期研究表明，RES作为癌化学预防剂，能针对多种如消化道、泌尿生殖及神经系统等不同类型的肿瘤细胞起到抑制作用[5，7]。但由于RES难溶于水使其难以通过口服在体内发挥其良好的生物活性，限制了该药的进一步研究及临床应用[8，9]。而纳米载药系统在传递生物利用度低药物中的独特优势，可较好弥补RES的天然缺陷[10]。此次实验将利用体外细胞实验评价其抗肿瘤效应，并探讨其对人胆囊癌GBC-SD细胞株凋亡的影响。
国内外对RES与胆囊癌的研究较少，仅胜利等研究表明，RES能阻滞GBC-SD细胞中G0/G1、下调抑凋亡基因Bcl-2、上调抑癌基因P53基因，从而促进胆囊癌GBC-SD细胞凋亡。本实验通过发现，5-Fu、RES及RES-BSANP三种药物对胆囊癌GBC-SD有明显抑制作用，并在10~80μg/ml浓度范围内表现出明显浓度依赖性，并当药物40μg/ml浓度时三种药物均能明显上调人胆囊癌GBC-SD细胞中凋亡相关基因Caspase3/8/9 mRNA的相对表达量。证实三种药物诱导细胞凋亡是杀伤胆囊癌细胞的作用机制之一，其原因可能与上调Caspase相关凋亡基因有关，这与胜利等人的研究报道部分一致[5]。与此同时，将三种药物进行比较，结果表明RES-BSANP组对胆囊癌GBC-SD的抑制作用与5-Fu近似（P＞0.05），较RES明显增强（P＜0.05）。
4结论
本文以RES为模型药物，通过体外抗肿瘤实验表明，RES-BSANP对胆囊癌细胞株增殖有明显的抑制作用，其原因可能与上调凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的表达有关，且该种抑制作用近似于5-Fu，相较RES更强。
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论文作者:杨建波1,李嘉懿1,丁丹1,张文兴1
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第15期
论文发表时间:2017/11/13
标签：细胞论文; 纳米论文; 白蛋白论文; 药物论文; 浓度论文; 抑制论文; 作用论文; 《中国误诊学杂志》2017年第15期论文;