罗涛[1]2002年在《腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验研究》文中研究表明目的 动脉粥样硬化常导致心血管和肢体血管狭窄或闭塞，有较高的致死、致残率，严重威胁患者的健康。自体静脉移植，重建动脉循环通路，是经典的治疗手段，可以有效地减轻症状、延长生命。但是静脉移植物在术后易形成新生内膜，使其在术后10年约有40％—60％发生狭窄和堵塞。提高移植静脉术后通畅率成为血管外科亟待解决的问题。目前研究表明，移植静脉狭窄的主要原因是移植静脉内膜增生，内膜增生是血管平滑肌细胞增生迁移的结果。抑制平滑肌细胞增生成为防治移植静脉狭窄的焦点。药物治疗移植静脉狭窄很不理想，往往因为系统给药毒副作用大而在临床上受到限制。现在随着基因技术的发展，基因治疗成为解决这一难题的希望。自杀基因系统最早应用在肿瘤的治疗中，取得了较好的效果。在动脉损伤再狭窄的研究中，转染自杀基因TK可显着地抑制平滑肌细胞增生，减轻新生内膜造成的血管腔狭窄，但纵观文献，自杀基因的在静脉系统中的作用如何，尚未见报导。针对细胞增生为特点的病理改变，本实验拟采用自杀基因系统抑制移植静脉内膜增生。 方法 本实验采用大隐静脉培养和大鼠静脉移植作为实验模型，模拟内膜增生病理变化。实验中首先应用腺病毒载体携带标记基因LacZ，研究大隐静脉和大鼠移植静脉中转基因的效率、靶细胞和表达时效。然后以TK基因为治疗基因，以腺病毒为载体转染人及大鼠的静脉，在培养液或大鼠体内注入丙氧鸟苷，观察静脉内膜是否受到显着的抑制。体外转基因：将静脉剖开，内膜暴露，自然浸入病毒载体溶液中。然后将静脉横断成0.5cm的片断，随机分到各组，将静脉片置于培养皿中培养，隔日换培养液，培养至取材。为提高中膜平滑肌细胞的转染率，本实验探讨了机械牵拉、静脉腔内灌注转基因的方法。在体转基因：Wister大鼠经腹腔麻醉后，取颈部中线切口，暴露颈静脉及其分枝。用显微血管夹钳夹颈静脉的两端，微量注射器从静脉侧枝的横断切口插人。静脉管腔用RPMll640的肝素水轻轻冲洗去残留血。病毒液注人管腔，使其充盈。室温下孵育30分钟后。对照组松钳后恢复静脉的血流。实验组则将颈静脉进行结扎，切除，作为移植物进行颈动脉间位移植术。移植术后 3，14，ZI天取标本。以相同条件在静脉中转染自杀基因TK。标本处理：培养的大隐静脉片或移植的颈静脉，经常规处理后切片，进行苏木素一伊红（HE）染色、Verhoeff弹力纤维染色（VG厂辅以计算机图像分析观察内膜增生程度。进行PCNA免疫组织化学染色，测定平滑肌细胞增生指数。大隐静脉常规石蜡切片，行抗内皮细胞相关见因子及平滑肌细胞a一肌动蛋白免疫组织化学染色，鉴定静脉中细胞成分，以扫描电镜观察静脉的通透性变化。静脉组织经 X－gal染色检测静脉中基因转染及表达效率，并对阳性细胞种类进行鉴别。取3天时的大鼠颈静脉进行ICAM刁，VCAM则免疫组化染色，观察移植静脉炎性改变。测定各时点大鼠转基因静脉中p一半乳糖酶活性。以原位杂交和PCR为手段鉴定转TK基因成功并且表达。测定心、肺和脑等重要脏器的半乳糖酶活性和自杀基因的存在。 结 果 实验中观察到腺病毒载体的靶细胞广泛，大隐静脉的内皮细胞和平滑肌细胞均可被转染。内皮细胞转染率与腺病毒载体作用的时间长短有关，10min即可转染上标记基因，较长的孵育时间可获得较高的转基因效率。中膜的平滑肌细胞也可被腺病毒载体转染，但转染率较低。为提高中膜平滑肌细胞的转基因效率，本实验使用机械牵拉及灌注加压的方法，使中膜平滑肌细胞的转基因效率明显提高，同时实验表明，内皮细胞并未因此而受到损伤。实验中对大鼠移植静脉及正常静脉转染腺病毒介导的p一半乳糖酶基因，然后在3，14和ZI天后测定半乳糖酶的活性。3天后，腺病毒有效地转染内皮细胞及中膜平滑肌细胞。转基因的移植静脉与转基因的正常静脉相比较，移植静脉内皮细胞大量表达VCAM－l，ICAM一八炎性反应明显。 ·二·移植静脉中半乳糖酶的活性为正常静脉的70％，其活性下降明显。第14天时，所有静脉中外源基因表达效率都降低，在移植静脉中更为明显，与正常静脉相比差异显着。在术后ZI天，所有静脉中均无半乳糖酶活性表达。移植静脉中的内皮细胞容易受到动脉血流及炎性反应的影响，阳性细胞损失明显，这是半乳糖酶活性降低的一个重要原因。中膜的平滑肌细胞由于受到解剖屏障的保护，阳性细胞损失率并不显着。中膜平滑肌细胞转基因后可较长时间稳定地表达外源基因。培养静脉及移植静脉14天时，内膜明显增厚，此时平滑肌细胞增殖最为显着。通过PCR及原位杂交证明腺病毒可以将胸昔激酶基因转染人的大隐静脉及大鼠自体移植静脉并能够表达mRNA，在对照组中转半乳糖酶基因的静脉中无TK表达。相同条件下转半乳糖酶基因的静脉内膜与中膜均有较高水平的半乳糖酶的表达，而在转染TK的静脉中无半乳糖酶阳性细胞。转胸着激酶基因并加人前体药GCV，在培养或行静脉移植术后14天时，内膜厚度?
张华锋[2]2016年在《组织蛋白酶S基因敲除在小鼠CABG后静脉桥再狭窄作用机制的研究》文中研究指明目的:冠状动脉旁路移植术(CABG)是治疗冠心病的一种有效方法,但CABG后静脉桥再狭窄发生率高,再狭窄中炎症反应和血管内膜增生为关键过程。有研究称,组织蛋白酶S(Cathepsin S,CatS)在血管再狭窄中起着重要的作用,表达上调。CatS基因敲除以后能否抑制CABG后静脉桥再狭窄,还需进一步深入研究。本研究即验证CatS基因敲除后对静脉桥再狭窄有抑制作用,且这种抑制作用是通过MMP-9含量减少作用的途径,减轻静脉桥血管的再狭窄。方法:本次研究以CatS基因敲除后的小鼠为研究对象,作为实验组,以C57BL/6小鼠为对照组,利用Cuff套管技术建立小鼠下腔静脉-颈动脉移植模型,通过基因敲除鉴定,显微镜观察血管内膜增生来证实CatS基因敲除后对静脉桥的再狭窄有抑制作用,同时通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定MMP-9酶的含量来进一步探讨CatS基因敲除后对CABG静脉桥再狭窄抑制作用的机制,以此为CABG术后静脉桥再狭窄的防治提供新的理论依据。结果:在静脉移植术后不同的时间点(8h、1d、3d、7d、14d、28d),通过对移植静脉取材并处理之后镜下观察发现:术后早期,内膜增生在两组之间无显着差别,随着术后时间的推移,对照组小鼠内膜逐步增生,且变化较为明显,而CatS基因敲除组内膜虽也有增生,但其增生程度较对照组明显减轻;静脉移植术后,随着时间的延长,CatS(-/-)组MMP-9含量表达较C57BL/6组明显减少,尤其是在术后2周,实验组(CatS(-/-)组)和对照组(C57BL/6组)MMP-9含量表达分别为(6.12±0.11)ng/ml和(9.23±0.12)ng/ml,两组比较P<0.05,差异有统计学意义。结论:本课题在顺利完成Cuff套管技术建立小鼠下腔静脉-颈动脉移植模型基础上,通过显微镜观察血管内膜增生证实了Cat S基因敲除后在一定程度上能对静脉桥再狭窄有抑制作用;并且通过MMP-9含量减少作用的途径,证实其可以抑制内皮细胞及血管平滑肌细胞增殖反应,细胞外基质沉积,减轻静脉桥血管的再狭窄。
迟立群[3]2001年在《野生型P53基因转染和低能量激光照射防治移植静态再狭窄的实验研究》文中认为实验目的：应用自体大隐静脉进行冠状动脉旁路移植术，术后远期一 个重要的并发症是由于新生内膜和随之发生的粥样硬化而发生再狭窄，大量 研究认为血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移是血管再狭窄的细胞学基础， 而VSMC增殖与凋亡的失衡导致新生内膜的增生与重构。对于移植静脉远期 再狭窄，目前尚无有效的防治方法。本研究观察转染野生型P53基因及低能 量激光照射对移植静脉VSMC增殖与凋亡的影响，探索转基因疗法和激光疗 法防治移植静脉远期再狭窄的可行性及作用机理，为进一步的实验研究和临 床应用提供新的思路。 实验方法：在293细胞中扩增的携带有人野生型P53基因或报告基因─ 绿色荧光蛋白（GFP）─的腺病毒，经氯化铯密度梯度和连续密度超速离心方 法纯化，获得高纯度、高度浓缩的腺病毒。建立兔颈外静脉颈总动脉移植模 型，按照以下分组进行实验：1、P53基因转染组：血管移植前，利用血 管内注射的方法，在移植静脉血管平滑肌细胞内转染野生型P53基因；2、GFP 基因转染组：血管移植前，利用血管内注射的方法，在移植静脉血管平滑肌 细胞内转染GFP基因；3、低能量激光照射组：血管移植后，应用IECu－1O铜 蒸气激光器，输出波长510．6nm，输出功率500mW/cm~2，于血管外照射静 脉 1000秒，照射能量达 500J／cm~2；4、P53基因转染并低能量激光照射组：联 合血管内注射进行转染野生型P53基因及低能量激光血管外照射两种方法处 理移植静脉。术后4周，免疫组织化学方法检测外源P53基因的表达及增殖 细胞核抗原（PCNA），应用DNA片段末端标记法（TUNEL）标记凋亡细胞。 HE、Masson及Victoria blue染色后，应用计算机图像分析系统检测移植静脉 内膜、中膜增生情况。 2 中国人民解放军军医进修学院 解放军总医院 博士论文 实验结果：l、应用腺病毒载体转染野生型P53基因，可以在移植静脉血 管平滑肌细胞中超表达P53蛋白。术后4周，与对照实验组相比，VSMC细 胞增殖率降低 61％，细胞凋亡率增加 25％，移植静脉内膜和中膜厚度分别减 少60％、33％，内膜厚度／中膜厚度比值（l／M）减少37％。而同样方法转染超 表达GFP基因，术后4周，与对照实验组相比，VSMC细胞增殖率、细胞 凋亡率无显着差异，移植静脉内膜和中膜厚度无明显变化。2、应用低能量激 光进行血管外照射的移植静脉，术后4周，与对照组相比，VSMC增殖率降 低 41．5％，细胞凋亡率增加 40．9％，显着抑制了 VSMC细胞增殖，促进细胞 凋亡，术后 4周，移植静脉内膜和中膜厚度分别减少 58，5％、18％，I／M比值 减少47．2％。3、转染P53基因同时应用低能量激光照射移植静脉，术后斗周， 移植静脉VSMC增殖率较对照组降低61．7％，细胞凋亡率增高47％，移植静 脉内膜和中膜厚度分别减少69厂％、44．4％，I／M比值减少44．5％。 l 结论：转染野生型P53基因和／或低能量激光血管外照射可以抑制移植静 脉血管平滑肌细胞增殖，促进移植静脉血管平滑肌细胞凋亡，使移植静脉内 膜和中膜的增生减轻，具有防治移植静脉远期再狭窄的作用。
陈海金[4]2007年在《慢病毒介导的双自杀基因靶向治疗大肠癌的实验研究》文中认为研究背景我国大肠癌发病率从20年前的十万分之十上升到了今天的十万分之叁十,在大城市恶性肿瘤的排名中大肠癌从第六位上升至第二位。大肠癌发病率正以4%的年增长率迅速上升,但治愈率却没有得到根本改变。传统的治疗方法有其自身的局限性,因此寻找新的疗法迫在眉睫。肿瘤自杀基因疗法是近年来肿瘤基因治疗中一个重要的研究策略,尤其是自杀基因的选择与重组,载体系统的优化,基因的靶向性转移表达,以及自杀基因的联合治疗等均有助于提高自杀基因特异性表达,增强杀伤肿瘤细胞的作用。肿瘤自杀基因治疗是将自杀基因导入肿瘤靶细胞并使之表达,基因编码的酶将无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物,从而诱导靶细胞产生自杀作用,杀伤肿瘤细胞,同时还通过旁观者作用杀伤邻近未转染的肿瘤细胞。目前研究最多的且被美国FDA批准应用于临床试验的自杀基因系统主要有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷系统(HSV-TK/GCV)和胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统(CD/5-FC)。此两系统的抗肿瘤效能已在多种肿瘤的体内外实验中得到证实。日本、荷兰、墨西哥等地的学者已开始进行HSV-TK基因治疗前列腺癌的临床试验。目前的临床试验认为,针对人前列腺癌的原位基因治疗安全而有效,具有良好的抗癌生物学活性。鉴于不同类型肿瘤细胞对自杀基因系统的敏感性不同、单一自杀基因系统治疗时部分肿瘤细胞易产生耐药以及CD/5-FC和HSV-TK/GCV系统的作用机理具有很强的互补性,联合应用此两系统不仅可以提高肿瘤细胞杀伤作用,改善治疗效果,而且可以扩大肿瘤治疗谱,减少耐药现象发生。众所周知,肿瘤的自杀基因治疗虽已成为基因治疗中研究热点之一,但目的基因的靶向性及基因转移的低效率是这一疗法广泛开展的主要障碍。实验研究中大多使用逆转录病毒载体和腺病毒载体进行基因转染治疗,与其它几种常用的病毒载体相比较,逆转录病毒载体病毒滴度低,只能感染分裂期细胞,容纳外源基因的DNA片段长度不超过8 kb。而腺病毒载体感染细胞时,病毒DNA游离在细胞核内,并不整合到染色体上,在体内不能实现稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应,因而在应用上这两种病毒载体都受到一定的限制。慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞,容纳外源性目的基因的片段大,可以在体内长期地表达,免疫反应小,安全性较好,可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒,已成为当前基因治疗中载体研究的热点。同时,如能使自杀基因选择性地作用于目的肿瘤细胞而不在正常细胞中表达,将能使该治疗策略更加完善。既往研究利用肿瘤特异性基因调控元件调控自杀基因表达,如以erbB-2、α-人乳白蛋白(hALA)启动子驱动自杀基因进行乳腺癌基因治疗,甲胎蛋白(AFP)基因启动子用于肝癌自杀基因疗法,癌胚抗原(CEA)基因启动子用于肠道肿瘤自杀基因疗法等。上述治疗方案中,每一特异启动子仅能进行针对某一类型肿瘤细胞靶向基因治疗,而绝大多数恶性实体瘤的生物学特性为生长迅速,致使其滋养血管不能及时供应所有肿瘤细胞,该特点使前体药物难以接近所有肿瘤细胞。选择一合适启动子既靶向肿瘤血管内皮细胞,又靶向肿瘤细胞,如此既可杀伤肿瘤细胞,又可靶向破坏肿瘤滋养血管使得其灌流区大量肿瘤细胞缺血性坏死,这样即高效放大了自杀基因的疗效。大量研究证明,KDR在正常人体组织中呈低水平表达,而在绝大多数肿瘤中呈现高表达,且KDR不仅表达于血管内皮细胞,还表达于肿瘤细胞,其表达水平与血管内皮细胞更新速度及肿瘤恶性程度呈正相关。它不仅促进血管内皮细胞分裂、增殖,且诱导肿瘤血管增生,并促使肿瘤细胞生长转移。在肿瘤组织内KDR表达明显高于正常内皮细胞,血管的发生对于肿瘤的生长和转移起着关键的作用。因此,将KDR作为靶点,可为治疗和诊断肿瘤提供了新的理论依据。国内外众多作者报道,KDR在在胃癌、结肠、直肠、卵巢、乳腺癌等多数肿瘤组织中的表达明显增高,并与其生物学行为相关,并伴随肿瘤分级的上升而表达增强。基于上述研究,为弥补单自杀基因的不足、克服以往启动子仅适用于某一肿瘤细胞的缺点、并利用慢病毒载体的优势,本课题设计思路如下:应用慢病毒载体构建KDR启动子驱动的CD/TK融合基因的重组慢病毒,感染血管内皮细胞ECV304及大肠癌细胞LOVO,观察该治疗系统的体外杀伤作用,为重组慢病毒介导KDR启动子驱动的CD/TK融合基因靶向治疗大肠癌的进一步研究提供依据。注:本课题来源于:广东省自然科学基金重点项目(013072)。目的研究慢病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用,并为进一步研究奠定基础。首先利用FUGW慢病毒载体构建携带KDR启动子调控的双自杀基因重组慢病毒,将所构建的重组慢病毒感染LOVO细胞和ECV304细胞,测定感染效率,检测转基因的表达,对转基因细胞施以前药(5-FC和/或GCV),观察转基因细胞对前药的敏感性。最后,以LOVO细胞株建立裸鼠皮下移植瘤动物模型,观察该治疗体系的体内抑瘤效应。方法一、重组慢病毒的构建将FUGW慢病毒载体酶切去掉Ubiqutin启动子,应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,亚克隆入中间载体pcDNA3,构建pcDNA3-KDRP-CD/TK,然后酶切KDRP-CD/TK片断,插入到FGW中,构建KDR启动子调控下的CD/TK融合基因慢病毒重组质粒FGW-KDRP-CD/TK。重组质粒在2937细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,通过荧光显微镜下293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达观察重组病毒的包装与复制,并以PCR方法鉴定重组慢病毒。二、慢病毒介导的FGW-KDRP-CD/TK融合基因系统对LOVO细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用用重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK感染LOVO细胞、ECV304细胞及LS174T细胞(对照),检测目的基因的表达。在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦(GCV)作用下,测定肿瘤细胞的存活率,观察旁观者效应,并分别通过流式细胞仪、透射电镜观察细胞凋亡与坏死。叁、慢病毒介导FGW-KDRP-CD/TK融合基因系统对大肠癌LOVO细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应采用BALB/C雌性裸鼠,4～6周龄,对数生长期的LOVO细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下,建立大肠癌动物模型,当肿瘤直径达0.5cm时,将荷瘤裸鼠随机分为Ⅰ组:注射重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK与前药5-FC与GCV;Ⅱ组:仅注射前药5-FC与GCV;Ⅲ组:仅注射重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK;Ⅳ组:空白对照,不施加任何处理。每5d测量肿瘤生长状况,估算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,25天治疗结束后处死裸鼠,称瘤重,计算肿瘤生长抑制率并观察该治疗体系的体内抑瘤效应,行组织内CD/TK基因表达的检测、肿瘤组织常规病理检查,并观察重要脏器心、肝、脾、肺、肾有无病理变化。结果一、重组慢病毒质粒的鉴定1.重组慢病毒质粒FGW-KDRP-CD/TK的鉴定在重组慢病毒质粒FGW-KDRP-CD/TK的构建过程中,主要采用酶切和测序的方法进行鉴定。将PCR所得的CD片段、TK片段及KDR分别连于T载体(pMD18-T)送上海申友生物技术有限公司测序,结果正确。FGW-KDRP-CD/TK以HindⅢ和BamHI酶切后电泳出现大小约2.4kb(CDglyTK)片段,结果正确。2.重组慢病毒质粒在293T细胞的包装及滴度测定将10μg的转移载体,7.5μg的CMV△R8.2包装质粒,5μg的VSV-G包膜质粒,加入130μL的2mol/L CaCL_2中,磷酸钙法叁质粒瞬时共转染293T细胞,24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达,72h后收集上清,0.45μm滤器过滤,25000rpm离心90min,沉淀溶于Hanks溶液,-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液,加入293T细胞中,72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,计数发荧光细胞数目,根据病毒用量和稀释度计算滴度。二、慢病毒介导的FGW-KDRP-CD/TK融合基因系统对LOVO细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.重组慢病毒体外感染及鉴定细胞LOVO、ECV304、LS174T分别加入200μl的重组慢病毒悬液(100MOI)培养72小时后,在荧光显微境下观察GFP基因的表达,可见80-90%有绿色荧光存在,叁种细胞具有相似的感染率。通过RT-PCR检测发现,除LS174T细胞外,LOVO、ECV304细胞检测有目的基因的表达。2.重组慢病毒对各细胞的体外抑制效应将200μl的重组慢病毒悬液(100MOI)感染各细胞株,加入不同浓度的前药培养72h后MTT法检测细胞生长抑制率。结果:感染慢病毒FGW-KDRP-CD/TK的LOVO及ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,转基因细胞的存活率随前药浓度的增加而递减。当前药浓度为GCV=100mg/L,5-FC=160mg/L时,LOVO存活率为(5.40±1.85)%,ECV304存活率为(5.26±1.82)%。而感染慢病毒的LS174T细胞对前药不敏感,LS174T存活率仍有(95.02±2.82)%,与其他各组细胞相比差异有显着性意义(F=6567.806,P＜0.001)。感染FGW-KDRP-CD/TK的LOVO、ECV304及LS174T细胞,单用浓度100mg/L的GCV时,生存率分别为(31.96±1.62)%、(29.10±2.86)%、(96.57±1.89)%,单用浓度为160mg/L的5-FC,生存率分别为(29.60±1.91)%、(25.23±2.05)%、(96.20±1.91)%,二者联合时,各细胞生存率分别为(5.40±1.85)%、(5.26±1.82)%、(95.02±2.82)%,提示联合用药比单一用药对LOVO细胞和ECV304细胞均有较强杀伤效应(F=803.123,P＜0.001;F=375.99,P＜0.001;F=1.555,P=0.226)。3、旁观者效应将感染慢病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应,其随转基因细胞所占比例的增加而明显增强。当转基因细胞的比率为40%时,LOVO和ECV304细胞分别有(32.40±1.29)%、(29.95±1.96)%的存活,而LS174T细胞存活率仍在(97.74±1.74)%,叁者比较差异均有显着性意义(F=5180.938,P＜0.001)。4、重组慢病毒对LOVO细胞及ECV304细胞凋亡的影响转基因LOVO细胞给以前药(GCV:1mg/L;5-FC:40mg/L)处理24h后,流式细胞仪检测发现:治疗组LOVO细胞加药24h后凋亡率为27.09±1.45%,明显高于对照组凋亡率2.96±0.34%(P=0.007)。转基因ECV304细胞给以前药(GCV:1mg/L;5-FC:40mg/L)处理24h后,流式细胞仪检测发现:治疗组ECV304细胞加药24h后凋亡率为10.85±1.50%,明显高于对照组凋亡率2.25±0.55%(P=0.035)。5、前药处理前后LOVO细胞的电镜观察透射电镜下见部分细胞出现细胞体收缩、染色质边聚,有的胞核形态不规则,核发生碎裂,胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片,有的可见凋亡小体、(或整个凋亡细胞)被吞噬和降解的现象。部分细胞出现细胞器溶解等坏死征象。叁、慢病毒介导的FGW-KDRP-CD/TK自杀基因系统对大肠癌LOVO细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应1.荷瘤裸鼠肿瘤生长情况接种肿瘤细胞后10d左右,出现皮下肿瘤结节。裸鼠成瘤达0.5cm后开始治疗,治疗结束时肿瘤标本的称重结果及抑瘤率:Ⅰ组:(21.34±5.72)mg,95.59%:Ⅱ组:(466.61±67.89)mg,3。58%;Ⅲ组:(451.91±48.29)mg,6.61%;Ⅳ组:空白对照组(483.91±51.60)mg。可见,组间瘤重有显着性差异(F=165.805,P＜0.001),Ⅰ组明显缩小,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长情况无统计学意义。2.肿瘤病理变化及肿瘤组织目的基因表达的检测前药加慢病毒治疗组肿瘤组织切片中可见片状坏死区,而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。RT-PCR检测发现重组慢病毒转基因荷瘤动物肿瘤组织内有CD/TK融合基因表达。3.治疗后裸鼠重要脏器的组织学观察为了解该治疗系统对裸鼠有无毒副作用,取治疗组小裸鼠心、肝、脾、肺、肾行常规病理检查未见明显异常。4.裸鼠可视化大肠癌动物模型成功的建立了大肠癌裸鼠皮下移植瘤可视化动物模型,LT-9MACIMSYSPULS整体荧光成像系统下,可满意观察到GFP绿色荧光,其优点:①早期发现肿瘤形成;②动态观察肿瘤生长及转移情况等。结论1.本实验首先以慢病毒为载体,成功地构建含KDR启动子驱动的CD/TK自杀基因系统的重组慢病毒,重组慢病毒的滴度达6×10~(10)pfu/ml;2.重组慢病毒对LOVO细胞、ECV304细胞及LS174T细胞均具有较高的转染率,且对叁者转染率相似;3.重组慢病毒能将KDR启动子驱动的CD/TK融合基因转入LOVO细胞及ECV304细胞中并进行有效表达,使该系统对LOVO细胞及ECV304细胞具有满意的靶向杀伤作用,这种杀伤作用具有浓度依赖性,并且联合应用两种前药较单用一种前药更为有效;4.该治疗体系的作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应,表现为处理后靶细胞的凋亡及坏死;5.应用LOVO细胞可成功建立大肠癌移植瘤裸鼠普通动物模型及可视化动物模型,并能方便地检测肿瘤的生长、转移;6.重组慢病毒转基因荷瘤动物肿瘤组织内可表达CD/TK融合基因产物,使该治疗体系具有满意的体内抑瘤效应,表现为肿瘤的生长抑制及肿瘤组织坏死;7.KDR启动子驱动的CD/TK融合基因系统治疗后,荷瘤裸鼠心、脾、肝、肺、肾等器官无明显组织学变化,提示该系统对荷瘤裸鼠无系统毒副作用。
李留霞[5]2008年在《基因调控溶血磷脂酸作用通路抑制卵巢癌细胞生长的实验研究》文中研究说明研究背景和目的卵巢癌由于深居盆底,缺乏早期症状体征和有效的诊治方法,5年生存率一直徘徊在30%左右,是死亡率最高、危害最大的妇科恶性肿瘤。但是,如果卵巢癌能得到早期诊治,Ⅰ期患者5年生存率可达90%以上。因此,研究卵巢癌的早期诊断方法和除手术、化疗及放疗以外的其它有效新疗法是卵巢癌研究的热点和关键。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是具有细胞间信号转导作用的脂类小分子物质,主要通过G蛋白受体介导的信号转导通路发挥多种生物学效应。近年来研究发现卵巢癌细胞能分泌LPA使患者血浆和腹水中LPA水平明显升高,90%以上Ⅰ期卵巢癌患者血浆中LPA明显高于健康人群,Ⅱ-Ⅳ期患者诊断敏感性达100%,其敏感性和特异性均明显高于目前临床常用的肿瘤标志物CA125,LPA被认为是一个非常有价值的用于卵巢癌诊断、病情检测及预后判断的生物标志物。LPA有3个特异性受体,分别是Edg2、Edg4和Edg7,属于内皮分化基因家族(endothelial differentiation gene family,Edgs)成员。Edg2主要在正常卵巢组织中表达,与卵巢癌关系不大。Edg4和Edg7在卵巢癌细胞中表达水平明显升高,认为与卵巢癌发生发展有关。LPA与受体结合后可活化四条细胞信号转导通路,促进卵巢癌细胞的增殖、生存、迁移和血管生成,抑制细胞凋亡,与卵巢癌的发生、发展、浸润、转移等密切相关。LPA的代谢主要通过人磷脂磷酸水解酶-3(human lipid phosphate phosphohydrolase-3,hLPP3)的降解而失活,增强hLPP3基因表达可以降低细胞外LPA水平,降低卵巢癌细胞克隆形成及抑制癌细胞在动物体内的生长。因此,有理由推测通过影响LPA代谢、封闭LPA受体或干扰LPA信号传导系统及阻断LPA的一系列级联反应有可能成为卵巢癌治疗的新途径。LPA及其受体与卵巢癌发生发展关系的研究是近年来妇科肿瘤领域的新课题,还有许多未知的问题需要进一步的研究和阐明。比如LPA作为卵巢癌诊断指标尚未被公认和用于临床,LPA及其受体促使卵巢癌发生发展的机制还不十分清楚,阻断LPA信号通路是否能抑制卵巢癌细胞生长的研究还没见报道。本研究拟通过测定LPA及其受体在卵巢癌患者血清和组织中的表达,探讨LPA作为卵巢癌早期诊断指标的可行性,验证LPA及其受体在卵巢癌发生发展中的重要作用;采用基因导入增强卵巢癌细胞中hLPP3基因表达,通过体内外实验探讨hLPP3对LPA的调节及对卵巢癌细胞生长的抑制效应;利用RNAi技术沉默LPA受体Edg4和Edg7基因表达,探讨阻断LPA信号转导通路对卵巢癌细胞生长的抑制作用。本实验通过不同途径调控LPA的作用通路,研究LPA及其受体在卵巢癌的发生发展进程中的作用及机制,为卵巢癌基因治疗寻找有效的方法和治疗靶点。第一部分LPA及其受体在卵巢癌患者血清和组织中的表达及意义材料和方法1.血清LPA测定1.1研究对象:研究组:卵巢上皮性性癌患者50例,包括原发性卵巢癌患者30例(Ⅰ期10例、中晚期即Ⅱ～Ⅳ期20例)和复发性卵巢癌患者20例,组织学类型为浆液性囊腺癌37例,粘液性囊腺癌13例;良性对照组:良性卵巢上皮性肿瘤20例(浆液性囊腺瘤13例、粘液性囊腺瘤6例、子宫内膜样肿瘤1例);正常对照组:20例正常妇女。所有病例均经术后病理确诊。1.2研究方法:采用生化法检测各组患者血清中LPA水平,同时用放射免疫方法测定血清中CA125水平,并将两者进行比较,探讨LPA对卵巢上皮性癌早期诊断的意义。2.卵巢癌组织中Edg4和Edg7蛋白检测2.1标本来源:为郑州大学第一附属医院病理科的存档腊块。研究组:上皮性癌组织48例(浆液性囊腺癌30例,粘液性囊腺癌11例,子宫内膜样癌7例)。临床分期为Ⅰ期12例,Ⅱ期16例,Ⅲ期18例,Ⅳ期2例;组织学分级为:G_1级14例,G_2级16例,G_3级18例。其中有淋巴结转移者22例,无淋巴结转移者26例;腹水≥500ml的30例,腹水＜500ml的18例。对照组:交界性上皮性肿瘤10例,良性上皮性肿瘤10例,正常卵巢组织12例。所有研究对象术前均未接受放疗或化疗,临床及病理资料完整。2.2研究方法:采用免疫组化SP法检测卵巢上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织中Edg4和Edg7蛋白的表达情况,并探讨这两种蛋白的表达与卵巢上皮性癌临床分期、组织学分级、淋巴转移及腹水量等临床和病理参数的关系。3.统计学处理计量资料采用单因素方差分析、最小显着差(LSD)检验;分类资料采用x~2检验和Kruskal-Wallis法秩和检验;相关性分析采用Spearman等级相关分析,以α=0.05为检验水准,在SPSS13.0上完成。结果1.各期卵巢上皮性癌患者血清LPA水平均明显升高,与正常妇女和良性卵巢上皮性肿瘤患者相比,其差异均有统计学意义(P＜0.001);Ⅰ期卵巢上皮性癌患者血清LPA水平也明显升高,与正常妇女和良性卵巢上皮性肿瘤患者相比差异有显着性(P＜0.001),其水平接近中晚期患者(P＞0.05);良性卵巢上皮性肿瘤患者血清中LPA表达水平较正常妇女略高,但差别无统计学意义(P＞0.05)。原发性卵巢癌Ⅱ～Ⅳ期组和复发组患者血清CA125水平明显高于正常妇女组和良性卵巢上皮性肿瘤组,其差别有统计学意义(P＜0.001);Ⅰ期卵巢上皮性癌患者血清CA125水平轻度升高,与良性卵巢上皮性肿瘤患者和正常妇女相比无明显差异(P＞0.05)。2.血清LPA水平升高用于检测卵巢上皮性癌的敏感性为96%、特异性为90%、假阳性率10%、假阴性率4%,阳性预测值96%、阴性预测值90%,血清CA125分别为72%、80%、20%、28%、90%、53.3%,与CA125相比LPA有较高的敏感性、较低的假阴性率及较高的阴性预测值(P＜0.05)。LPA用于检测Ⅰ期卵巢上皮性癌的敏感性为90%、特异性90%、假阳性率10%、假阴性率10%、阳性预测值81.8%,阴性预测值94.7%,而CA125分别为30%、80%、20%、70%、42.9%和69.6%,LPA对Ⅰ期上皮性卵巢癌检测的敏感性、阳性预测值及阴性预测值高于CA125,假阴性率低于CA125(P＜0.05)。LPA检测原发性卵巢上皮性癌Ⅰ期、Ⅱ～Ⅳ期、复发性卵巢癌患者的约登指数分别为:0.8、0.85和0.9,而CA125检测的约登指数分别为:0.1、0.6和0.65,提示LPA是检测早期上皮性卵巢癌的良好指标。3.溶血磷脂酸受体Edg4、Edg7蛋白在卵巢上皮性肿瘤组织中的阳性表达率分别为恶性91.7%和95.8%、交界性80%和70%、良性20%和30%,而在正常卵巢组织中阳性表达率仅为16.7%和16.7%,提示Edg4、Edg7在正常卵巢组织中呈低表达状态;在良性卵巢上皮性肿瘤组织中的表达较正常组织中稍高,但其差异无统计学意义(P＞0.05),而在交界性卵巢上皮性肿瘤和卵巢上皮性癌组织中Edg4、Edg7的表达均显着高于正常卵巢组织及良性上皮性肿瘤组织(P＜0.001),多数上皮癌组织中着色呈“+++”,提示两种受体蛋白在卵巢上皮性癌组织中呈高表达状态。4.卵巢上皮性癌组织中Edg4和Edg7蛋白在Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期;G_2、G_3级组织中两种蛋白的表达明显高于G_1级组织;有淋巴结转移的癌组织中两种蛋白的表达明显高于无淋巴结转移的癌组织;腹水＞500ml的癌组织中两种蛋白的表达明显高于腹水＜500ml的癌组织,比较结果差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示在卵巢上皮性癌组织中,Edg4和Edg7的高表达与癌组织学分级、临床分期、淋巴结转移及腹水量增加有关。5.Edg7蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达阳性率略高于Edg4蛋白,但无统计学差异(P＞0.05);Edg4和Edg7蛋白的表达状态趋势一致,经相关性分析两者的表达呈正相关(P＜0.05)。小结1.卵巢上皮性癌患者血清中LPA水平明显升高,其敏感性高于血清CA125,假阴性率低于CA125,尤其是在早期卵巢癌患者更明显。提示LPA有望成为卵巢癌早期诊断新的敏感标记物。2.溶血磷脂酸受体蛋白Edg4与Edg7在卵巢上皮性癌组织中的表达水平明显升高,并与上皮性癌的临床分期、组织学分级、淋巴转移和腹水量呈正相关。提示Edg4和Edg7可能在卵巢上皮性癌的发生发展、浸润和转移中具有重要作用。3.Edg4和Edg7受体蛋白在卵巢上皮性癌组织中表达程度呈正相关,推测二者在卵巢上皮性癌的发生发展中具有协同作用。4.LPA及其受体Edg4和Edg7在卵巢癌患者血清及组织中的高表达等上述结果为下一步的研究即基因调控LPA作用通路抑制卵巢癌细胞生长的研究提供了理论和实验依据。第二部分增强人磷脂磷酸水解酶-3基因表达对卵巢癌细胞生长的抑制作用材料和方法1.从胎盘组织中逆转录扩增目的基因以人胎盘组织总RNA为模板,根据GenBank上的hLPP3基因cDNA编码序列(BC009196)设计引物:上游引物LPP3-1 5'TGGATCCTCCACCATGCAAAACT ACAAGTACGAC 3'(372-392);下游引物LPP3-2 5'CCTCGAGCTACATCAT GTTGTGGTGAT 3'(1288-1307)。采用RT-PCR技术扩增合成的双链DNA,凝胶电泳回收鉴定。2.将目的基因克隆入克隆及表达质粒载体将目的基因hLPP3克隆入pGEM-T easy质粒载体,利用α互补和T7/SP6 PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-hLPP3;用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组子pGEM-T-hLPP3和真核表达载体pLenExpress质粒;将双粘的hLPP3片段亚克隆入表达载体pLenExpress中;利用PCR扩增及BamHⅠ和XhoⅠ双酶切筛选鉴定重组子pLenExpress-hLPP3;对插入序列进行DNA序列分析。3.包装产生表达目的基因的慢病毒将表达hLPP3基因的表达载体及辅助包装载体应用脂质体协助转染293FT细胞包装病毒,产生带有绿色荧光蛋白(GFP)并表达hLPP3基因的慢病毒颗粒(lentivires),测定病毒滴度。4.表达目的基因慢病毒体外细胞转染实验用表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3细胞(实验组),用空载体包装的慢病毒转染细胞及未转染细胞作为对照组。利用荧光显微镜观察转染阳性率,加入G418筛选稳定表达hLPP3的细胞株;生化法测定转染前后细胞培养上清液中LPA含量变化;采用实时荧光定量PCR测定各组细胞中hLPP3mRNA表达水平;流式细胞仪检测各组卵巢癌细胞的细胞周期和凋亡率改变。5.裸鼠体内移植瘤实验用SKOV3和OVCAR3细胞及稳定表达hLPP3基因的SKOV3和OVCAR3细胞接种裸鼠,构建卵巢癌裸鼠移植瘤动物模型,观察移植瘤生长情况,并测量移植瘤大小;将移植瘤作病理切片检查,实时荧光定量PCR测定移植瘤组织中hLPP3mRNA表达,流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化和细胞的凋亡率。结果1.成功扩增出目的基因利用RT-PCR从胎盘组织中扩增出目的基因hLPP3,电泳条带约在936bp。2.成功构建表达目的基因的重组真核表达载体PCR产物与pGEM-Teasy载体连接后,转化JM109大肠杆菌,筛选鉴定得到正确重组子pGEM-T-hLPP3。进行亚克隆后,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切对重组质粒进行鉴定,得到pLenExpress-hLPP3重组真核表达载体。对重组子pLenExpress-hLPP3插入片段DNA序列测序,结果与设计完全一致。3.获得高浓度的表达目的基因的慢病毒并对卵巢癌细胞系具有高转染效率。用重组表达载体和包装载体包装慢病毒,其滴度分别如下:表达hLPP3基因的慢病毒:3.1×10~4 IU/ml;空载体包装的慢病毒:2.7×10~7 IU/ml。表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌SKOV3细胞阳性率为92%,高于转染OVCAR3细胞的阳性率(76%)。4.实验组细胞中hLPP3mRNA表达水平明显增加表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌细胞系后,经实时荧光定量PCR检测实验组卵巢癌细胞的hLPP3 mRNA相对表达量比空载体组及无转染对照组明显增加(P＜0.05);而无转染对照组与空载体组比较无统计学意义(P＞0.05)。SKOV3与OVCAR3之间hLPP3 mRNA相对表达量比较无统计差异(P＞0.05)。5.实验组卵巢癌细胞培养上清液中LPA含量明显降低慢病毒转染细胞后不同时间测定上清液中LPA水平,结果显示实验组LPA水平较对照组明显下降,且随着转染时间延长,LPA含量有进一步下降趋势(P＜0.05),存在时间-效应关系。两种卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3之间LPA水平比较无统计学差异(P＞0.05)。6.实验组细胞凋亡率明显增加实验组卵巢癌细胞凋亡率明显增加,由转染前0.1±0.034%到转染后增加为30.50±2.12%,两者比较有统计学意义(P＜0.05)。实验组细胞凋亡率明显高于两个对照组(P＜0.05)。实验组卵巢癌细胞周期改变不明显(P＞0.05)。7.成功构建卵巢癌及转基因卵巢癌裸鼠移植瘤模型用卵巢癌细胞系及表达目的基因的卵巢癌细胞株皮下注射局部生长成瘤,实验组移植瘤体积及重量均小于空载体组和无转染对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。SKOV3细胞形成的移植瘤生长情况与OVCAR3细胞的相似,两者比较无统计学意义(P＞0.05)。8.体内移植瘤实验结果实验组裸鼠移植瘤组织中hLPP3 mRNA的相对表达量明显高于空载体组和无转染对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);而对照组与空载体组比较无统计学意义(P＞0.05)。SKOV3与OVCAR3之间hLPP3 mRNA相对表达量比较无统计学意义(P＞0.05)。实验组裸鼠移植瘤细胞的凋亡率为16.5%,而空载体组细胞凋亡率为1.26%,无转染对照组细胞凋亡率则为0.10%,实验组细胞的凋亡率明显高于两个对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。各组细胞周期无明显变化(P＞0.05)。小结1.成功构建并产生出表达hLPP3的真核表达载体及慢病毒颗粒,并对卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3细胞转染效率高且容易鉴定,获得了稳定表达hLPP3基因的卵巢癌细胞株。2.体外实验,表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌细胞后,细胞内hLPP3 mRNA水平明显升高,细胞上清液的LPA水平明显降低,细胞凋亡率明显增加。提示增强hLPP3基因表达能有效降低LPA水平,促进细胞凋亡,其机制可能通过水解胞外的LPA或/和减少细胞LPA释放,抑制LPA的促肿瘤效应。3.成功建立了卵巢癌裸鼠移植瘤模型及稳定高表达hLPP3基因的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,后者体内移植瘤细胞生长速度明显减慢,hLPP3 mRNA水平和细胞凋亡率增加。提示增强hLPP3基因表达在体内也能有效抑制卵巢癌细胞生长,促进细胞凋亡,其机制可能与体外一样通过降低LPA水平发挥抑瘤效应。4.体内外实验均证明增强hLPP3基因表达能抑制卵巢癌细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,提示调控hLPP3基因可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。第叁部分RNA干扰沉默溶血磷脂磷酸受体Edg4和Edg7基因表达对卵巢癌生长的抑制效应材料和方法1.设计合成Edg4和Edg7siRNA序列及发夹样DNA寡核苷酸单链依据GenBank中Edg4基因(NM_004720)和Edg7基因(NM_012152)的序列,遵循siRNA设计原则进行设计及筛选,选择确定19个碱基的siRNA靶序列。各设计2对包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的靶向Edg4和Edg7发夹样DNA寡核苷酸,并合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链。设计合成无关序列DNA链作为对照。2.构建目的基因的克隆载体和真核表达载体将发夹样DNA序列退火成双链DNA,克隆入pGEM-T Easy载体,利用α互补和T7/SP6引物经PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-siEdg4和pGEM-T-siEdg7;用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切重组子和siRNA真核表达载体pRNAT-U6.1/lenti;将双粘发夹样siRNA片段亚克隆入pRNAT-U6.1/lenti中;利用通用引物PCR筛选及双酶切鉴定重组子;对插入序列进行DNA序列分析。3.包装产生表达目的基因的慢病毒将测序正确的siRNA表达载体和辅助包装载体应用脂质体包裹转染293FT细胞包装病毒,产生表达不同siRNA序列的慢病毒颗粒,并测定病毒滴度。4.体外细胞转染实验用表达不同目的基因的慢病毒转染入卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用G418筛选稳定表达siRNA的细胞株。体外实验分为叁个对照组和四个实验组,分别为未转染对照组C1,转染空载体包装的病毒对照组(C2),转染无关序列siRNA包装的病毒对照组(C3),转染siEdg4病毒组(T1),转染siEdg7病毒组(T2),共转染siEdg4病毒和siEdg7病毒组(T3),以及共转染siEdg7病毒和表达hLPP3的病毒组(T4)。利用荧光显微镜观察SKOV3细胞中的转染率;用生化法测定细胞培养上清液中LPA含量变化;用实时荧光定量PCR方法检测细胞Edg4和Edg7mRNA表达水平;用Western Blot测定Edg4和Edg7蛋白表达情况;用流式细胞仪检测转染细胞的细胞周期和凋亡率变化。5.裸鼠体内移植瘤实验用SKOV3细胞及稳定表达不同siRNA的SKOV3细胞接种裸鼠,构建表达不同基因的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,在体内研究沉默Edg4和Edg7基因表达对卵巢癌细胞生长的影响及其作用机制。测量移植瘤大小和重量,比较各组移植瘤生长情况;实时荧光定量PCR测定瘤细胞中两种受体mRNA表达情况;免疫组化SP法检测移植瘤中Edg4和Edg7蛋白表达情况;流式细胞仪测定移植瘤细胞周期及细胞凋亡率变化。结果1.Edg4和Edg7siRNA靶序列筛选及发夹DNA单链设计合成对候选序列通过同源序列检索和进一步优选,最后确定212-230位(GACCATCGGCTTCTTCTAT)和323-341位(GACCAATCTGCTGGTCATA)为Edg4-siRNA靶序列;277-295位(GCTGGAATTGCCTATGTAT)和697-715位(GTCTTGTCTCCGCATACAA)为Edg7-siRNA靶序列;(TACGCTGACTTGATTGTTC)为无关对照序列。Edg4发夹样siRNA寡核苷酸序列Position in gene sequence:212-230BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIAl 11 5'-GGATCC GACCATCGGCTTCTTCTAT TTCAAGAGA ATAGAAGAAGCCGATGGTC TTTTTT CTCGAGA -3'Al 12 3'-ACCTAGG CTGGTAGCCGAAGAAGATA AAGTTCTCT TATCTTCTTCGGCTACCAG AAAAAA GAGCRC-5'BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIAl 21 5'-GGATCC GACCAATCTGCTGGTCATA TTCAAGAGA TATGACCAGCAGATTGGTC TTTTTT CTCGAGA -3'Al 22 3'- ACCTAGG CTGGTTAGACGACCAGTAT AAGTTCTTCT ATACTGGTCGTCTAACCAG AAAAAA GAGCTC -5'Position in gene sequence:323-341Edg7发夹样siRNA寡核苷酸序列Position in gene sequence:697-715BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIA211 5'-GGATCC GTCTTGTCTCCGCATACAA TTCAAGAGA TTGTATGCGGAGACAAGAC TTTTTT CTCGAGA-3'A212 3'-ACCTAGGCAGAACAGAGGCGTATGTT AAGTTCTCT AACATACGCCTCTGTTCTG AAAAAA GAGCTC-5'BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIA221 5'-GGATCC GCTGGAATTGCCTATGTAT TTCAAGAGA ATACATAGGCAATTCCAGC TTTTTT CTCGAGA-3'A222 3'-ACCTAGGCGACCTTAACGGATACATA AAGTTCTCT TATGTATCCGTTAAGGTCG AAAAAA GAGCTC -5'Position in gene sequence:277-295无关序列对照发夹样siRNA寡核苷酸序列BamHI位点Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoI位点C1 5'- GGATCC TACGCTGACTTGATTGTTC TTCAAGAGA GAACAATCAAGTCAGCGTA TTTTTT CTCGAGA-3'C2 3'-ACCTAGG ATGCGACTGAACTCAAG AAGTTCICT CTTGTTAGTTCAGTCGCAT AAAAAA GAGCTC-5'2.成功克隆表达目的siRNA的克隆载体和真核表达载体不同序列的发夹DNA退火产物与pGEM-T Easy连接后,转化JM109,筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-siEdg4、pGEM-T-siEdg7和pGEM-T-siC。亚克隆入表达质粒pRNAT-U6.1/lenti后,用通用引物对重组表达质粒进行鉴定,得到真核表达载体pRNAT-U6.1/lenti-siEdg4、pRNAT-U6.1/lenti-siEdg7和pRNAT-U6.1/lenti-siC。对重组子进行测序,结果与设计完全一致。3.表达不同目的基因慢病毒滴度采用脂质体Lipofectaminc~(TM) 2000包裹构建的siRNA表达载体及包装载体,转染293FT细胞,产生表达不同siRNA的慢病毒颗粒(Lentivirus),测定其滴度如下:针对Edg4基因的siRNA Lentivirus—siEdg4/lenti病毒3.2×10~7 IU/ml;针对Edg7基因的siRNA Lentivirus—siEdg7/lenti病毒4.1×10~7 IU/ml;无关对照的siRNA Lentivirus—siC/lenti病毒4.3×10~7 IU/ml;空载体包装的Lentivirus—pRNAT-U6.1/Lenti病毒2.7×10~7 IU/ml。4.重组慢病毒能高效转染卵巢癌细胞系含有不同siRNA的病毒转染卵巢癌SKOV3细胞,培养48h后采用荧光显微镜观察,结果显示除了未转染组细胞,其余各组SKOV3细胞的胞核和胞浆内均有大量绿色荧光信号,细胞转染阳性率均在90%以上(92%～95%),说明重组慢病毒可以高效转染卵巢癌SKOV3细胞,而且目的siRNA的插入不影响慢病毒对细胞的转染力。5.慢病毒体外细胞转染结果5.1实时荧光定量PCR方法分别测定各组细胞中Edg4和Edg7 mRNA的表达水平,结果显示:转染siEdg4和siEdg7慢病毒的T1组和T2组卵巢癌SKOV3细胞中Edg4和Edg7的mRNA表达水平明显降低,与对照组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。而3个对照组卵巢癌细胞中Edg4和Edg7 mRNA表达均较高,相互之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。2个共转染实验组mRNA表达更低,与其它单独转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。5.2 Western Blot检测结果显示3个对照组细胞中Edg4和Edg7两种蛋白表达水平较高,分子量约40KD,而实验组中相应Edg4和Edg7蛋白表达水平明显降低。提示siRNA良好的靶向性。5.3各实验组转染后细胞上清液中LPA含量明显下降,且随着转染时间的延长,细胞上清液中的LPA含量降低更明显(P＜0.05)。而3个对照组转染前后LPA含量变化不明显(P＞0.05),实验组与对照组相比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。5.4转染siRNA慢病毒对卵巢癌细胞SKOV3细胞周期影响主要表现为实验组的细胞S期比例降低,G_2期比例升高,差异有显着性(P＜0.05),而3个对照组的细胞周期无明显变化(P＞0.05)。转染后实验组细胞凋亡率明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);其中两个共转染实验组较单独转染实验组细胞凋亡率更高,3个对照组细胞凋亡率无明显变化(P＞0.05)。6.裸鼠体内移植瘤实验结果6.1实验组裸鼠移植瘤生长缓慢:各组卵巢癌细胞接种入裸鼠皮下后生长成瘤。各实验组移植瘤体积小于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),两个共转染组移植瘤体积明显小于单转染组(P＜0.05),但两个共转染组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。处死裸鼠后的移植瘤重量实验组明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。6.2对裸鼠皮下移植瘤组织进行Edg4和Edg7蛋白的免疫组化SP法染色,阳性表达主要表现为胞膜和胞浆着色,实验1、3组Edg4蛋白表达水平明显降低,实验2、3、4组Edg7蛋白表达明显降低,与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。而对照组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。6.3实验组移植瘤组织中两种受体mRNA的相对表达量明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而对照组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。6.4实验组裸鼠移植瘤细胞的凋亡率分别为(16.75±1.24)%、(15.80±1.35)%、(25.42±3.24)%和(24.63±2.76)%,3个对照组细胞凋亡率分别为(1.68±0.03)%、(1.76±0.04)%和(0.67±0.002),各实验组细胞的凋亡率明显高于3个对照组细胞,比较结果有统计学意义(P＜0.05)。小结1.成功设计并构建了真对Edg4和Edg7的真核表达载体pRNAT-U6.1/lenti-siEdg4和pRNA-U6.1/lenti-siEdg7,并包装生产出表达Edg4和Edg7siRNA序列的慢病毒颗粒,两种病毒均能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞并持久表达,获得了稳定表达siEdg4和siEdg7的SKOV3细胞株。2.体外实验表明,RNAi沉默Edg4或Edg7基因表达能靶向抑制卵巢癌细胞内相应的Edg4或Edg7 mRNA及蛋白表达,降低细胞培养上清液中LPA水平,阻滞细胞周期进程,增加癌细胞的凋亡率,同时沉默两个受体作用更明显。提示封闭Edg4或/和Edg7基因表达均能有效抑制LPA的促肿瘤作用,Edg4和Edg7在卵巢癌的发生发展中具有协同作用。3.沉默Edg7基因表达和增强hLPP3基因表达能更明显的降低细胞外LPA水平,增加肿瘤细胞凋亡,hLPP3对Edg7mRNA表达及细胞周期无明显影响。提示封闭Edg7和增强hLPP3基因表达对降低细胞外LPA水平和促进肿瘤细胞凋亡有协同作用,hLPP3主要通过降低LPA水平发挥作用。4.成功构建了稳定表达siEdg4和siEdg7的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,体内实验表明封闭Edg4或/和Edg7及增强hLPP3基因在体内也能明显抑制两种受体的mRNA和蛋白表达,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长,发挥和体外相似的抑制肿瘤效应。5.沉默Edg4或/和Edg7基因表达及增强hLPP3基因表达在体内外均能有效抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞中LPA的促肿瘤作用,提示对LPA受体及hLPP3基因的调控可能成为卵巢癌的基因治疗的有效靶点和新方法。该研究为验证LPA及其受体与卵巢癌发生、发展的关系提供了实验和理论依据,也为利用RNAi技术进行卵巢癌基因治疗研究奠定了基础并提供了新思路。全文结论1.卵巢上皮性癌息者血清中LPA水平明显升高,其敏感性高于血清CA125,尤其是在早期卵巢癌患者更明显。提示LPA有望成为新的敏感的卵巢上皮性癌早期诊断的生物学标记物。2.溶血磷脂酸受体蛋白Edg4与Edg7在卵巢上皮性癌组织中的表达明显升高,并与上皮性癌的临床分期、组织学分级、淋巴结转移和腹水量呈正相关。提示LPA及其受体Edg4和Edg7可能在卵巢上皮性癌的发生发展、浸润和转移中具有重要作用。3.成功包装出表达hLPP3的慢病毒对卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3细胞转染效率高,转染后在体内外均能增强hLPP3基因表达,有效降低LPA水平,促进细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞生长。其机制可能通过水解胞外的LPA或/和减少细胞LPA释放,抑制LPA的促肿瘤效应。4.成功设计并构建了表达Edg4和Edg7siRNA的慢病毒,能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞并持久表达。体内外实验表明,RNA干扰沉默Edg4或Edg7基因表达均能明显抑制癌细胞内相应的Edg4和Edg7 mRNA及蛋白表达,降低细胞培养上清液中LPA水平,阻滞细胞周期进程,增加癌细胞的凋亡率,抑制细胞生长,同时沉默Edg4和Edg7具有协同作用。5.同时沉默Edg7基因表达及增强hLPP3基因表达在体内外均能有效抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞中LPA的促肿瘤作用,二者具有协同作用。6.该研究为验证LPA及其受体与卵巢癌发生、发展的关系提供了实验和理论依据,也为利用RNAi技术进行卵巢癌基因治疗研究奠定了基础并提供了新思路。对LPA受体Edg4、Edg7及hLPP3基因的调控可能成为卵巢癌的基因治疗的有效靶点和新方法。7.有关表达hLPP3基因慢病毒的构建和体内外转染实验、利用RNA干扰技术沉默LPA受体Edg4、Edg7抑制卵巢癌细胞生长实验以及同时沉默Edg7及增强hLPP3基因表达抑制卵巢癌细胞生长的研究内容,国内外未见类似报道。
陈泓[6]2008年在《乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究》文中研究表明卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第叁位,死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处,在发病早期缺乏特异性症状和体征,很难在早期发现和诊断,约60%-70%的卵巢癌患者确诊时己属于晚期。近30年来,虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,不断改进手术方式,发现更新更好的化疗药物,增加新的化疗方案,但是5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。所以,寻找新的诊断方法和新的治疗手段是目前卵巢癌研究的重点。作为一种与粘附和渗出等肿瘤浸润转移必须过程密切相关的物质,乙酰肝素酶(HPSE)在卵巢癌的浸润转移中起着举足轻重的作用。本课题通过一系列体外实验,对HPSE在卵巢癌浸润转移过程中的作用及其机制做了深入的研究,并且构建了HPSE基因慢病毒表达和RNAi载体,为今后的基因靶向治疗奠定了基础。乙酰肝素酶基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究目的:了解乙酰肝素酶对卵巢癌细胞功能的影响,分析HPSE在卵巢癌浸润转移过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建HPSE基因真核表达载体后,将其转染无HPSE基因表达的卵巢癌细胞株A2780,G418筛选后经RT-PCR及western-blot鉴定确认获得稳定转染的HPSE/A2780细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、黏附能力、细胞侵袭转移能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达HPSE蛋白的卵巢癌细胞株。流式细胞仪对细胞检测结果显示A2780-HPSE组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为46.5%,G1期为53.5%,对照组则相应为54.5%和45.6%,其处于增殖周期的细胞有减少的趋势。HPSE组和对照组的生长曲线几近重合。两组的克隆形成率差异无统计学意义。A2780细胞在转染前后粘附率分别为0.5183±0.0796和0.7283±0.08931,比较有统计学意义(p=0.002)。Transwell小室实验发现转染HPSE基因后的A2780细胞的侵袭能力明显提高,与对照组比较有统计学意义(p=0.003)。而其迁移能力未受影响(p=0.618)。结论:细胞功能实验结果表明,HPSE能够增强卵巢癌A2780细胞的侵袭能力,降低其黏附能力;对增殖能力和迁移能力均无影响。RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外体实验研究目的:通过构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞,检测其对HPSE基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,反面验证HPSE基因的功能。方法:针对HPSE mRNA的不同区域构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳转细胞株,western-blot检验HPSE蛋白受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同shRNA干扰载体的干扰效果进行检测结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达株western-blot检验其HPSE蛋白表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,p=0.059,比较无统计学意义。侵袭能力实验中,干扰组吸光值为0.5697±0.106,对照组为0.8097±0.333,干扰组与对照组相比无统计学意义(p=0.233)。细胞粘附能力检测,干扰组0.7533±0.07685,对照组0.5833±0.11994,两者相比有统计学意义(p=0.015)。侵袭能力实验干扰组为0.69±0.085,对照组为1.091±0.277,两者相比有统计学意义(p=0.015)。结论:采用构建shRNA干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,使卵巢癌细胞侵袭和黏附能力降低。HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建目的:采用第二代和第叁代慢病毒载体,分别构建HPSE基因的慢病毒表达载体和shRNA慢病毒干扰载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法:首先扩增HPSE全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序BLAST检索,并将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48小时后提取mRNA,RT-PCR检验HPSE基因表达情况。其次,选取干扰效果最佳的siRNA,设计shRNA结构,退火反应形成双链后与慢病毒载体pSico连接并送测序。结果:重组慢病毒质粒HPSE-pWPI测序结果经BLAST,与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。重组慢病毒干扰载体pSico/HPSE测序结果与设计的shRNA序列完全一致。结论:成功的构建了HPSE基因的重组慢病毒系统和慢病毒干扰系统。为今后的HPSE靶向治疗奠定了基础。
徐晓红[7]2010年在《抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用》文中研究表明由抗体介导的免疫靶向治疗是肿瘤生物治疗的主要组成部分,但其发展仍面临诸多挑战,如作为靶向工具的抗体分子量比较大、侵透性差、稳定性弱；所应用抗体多为鼠源抗体,免疫原性较高；所应用抑癌分子特异性较低,存在损伤正常细胞的隐患等。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种广泛存在于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞表面的高度糖基化癌胚蛋白。人源化的抗CEA单链抗体(single chain Fv fragment, scFv) T84.66对CEA具有较高特异性,已普遍应用于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的诊断和免疫治疗,其疗效已为临床Ⅰ期试验所证实。且scFv T84.66具有结合活性高、侵透性强、免疫原性低和廓清快等优点。scFv T84.66同其它单链抗体一样具有先天缺陷,如较亲本抗体亲合力有所下降；在体温条件下稳定差较差；特定情况下会出现聚集倾向等,这可能与scFv的轻、重链可变区存在非共价键有关,但这种现象会通过引入链间二硫键而有所改观,即将scFv改构为稳定性较高的二硫键稳定型单链抗体(disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv)。Apoptin基因来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV),能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无细胞毒作用。另外,肿瘤的放射治疗和多数化学治疗药物通过p53发挥作用,一旦p53突变即会形成耐药,而Apoptin的凋亡诱导作用不依赖p53,也不受凋亡抑制分子bcl-2等因素的影响,bcl-2分子的存在反而能够增强其作用。因此,Apoptin基因已广泛应用于肿瘤基因治疗研究领域。本研究通过生物信息学方法设计scdsFv T84.66,并利用人工合成方法,将Apoptin基因通过柔性肽序列连接至scdsFv T84.66下游,构建并表达了具有特异性识别／结合CEA功能和特异性杀伤肿瘤细胞功能的抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin,并在体内、外对其抑瘤作用进行了分析。
王建杰[8]2011年在《重组人乳铁蛋白抗乳腺癌作用及其机制研究》文中研究指明乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在发达国家占女性恶性肿瘤的第一位。乳腺癌的基因治疗是除了外科手术、化疗和放疗的另一个很有前景的治疗方式，它能将肿瘤抑制基因、抑癌因子或其他抗癌药物直接送达肿瘤部位靶向杀伤肿瘤细胞，因而备受学者关注。乳铁蛋白(Lactoferrin，LTF)具有抗肿瘤作用，能明显抑制多种器官肿瘤的发生、生长和转移，被广泛认为是一种新型的抗癌药物。在前期的研究工作中，我们构建了含有人乳铁蛋白cDNA和绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因的重组人乳铁蛋白腺病毒载体(ad-rhLTF)，并证明ad-rhLTF在羊乳汁和兔乳汁中均获得人LTF(hLTF)的高表达。然而，有关ad-rhLTF的其他生物学活性尤其对乳腺癌的作用及机制仍然不十分清楚。因此，本研究采用体内、体外试验，较系统地研究了ad-rhLTF对乳腺癌的作用及其抑癌机制。在体内试验中，首先建立小鼠EMT6乳腺癌移植瘤模型，并随机分为阴性对照组、环磷酰胺阳性药物对照组、ad-rhLTF低剂量组(108pfu/mL)和ad-rhLTF高剂量组(5×10~8pfu/mL)。采用免疫组织化学法、ELISA、流式细胞技术、RT-PCR、Western blot方法等，对ad-rhLTF可能的抗乳腺癌作用及机制从调节免疫功能、干扰肿瘤细胞周期以及诱导肿瘤细胞凋亡等方面进行了系统地研究。获得如下结果：Ad-rhLTF不同剂量肿瘤注射14d后，发现hLTF在小鼠肿瘤组织中出现高表达,以高剂量组更为明显。Ad-rhLTF低、高剂量均能明显地抑制小鼠肿瘤的生长(p<0.01)，肿瘤抑制率分别为42.80%和52.64%。并证明ad-rhLTF减少了肿瘤组织中突变型p53、CerbB-2和Ki-67蛋白的阳性细胞百分率(p<0.01)，且肝脏、肾脏组织形态及功能均未见异常。通过对肿瘤细胞周期分析，ad-rhLTF能增加肿瘤细胞在G0/G1期的数目(p<0.01)，减少S期和G2/M期的百分数(p<0.01)，并出现Sub-G1期凋亡峰，凋亡百分数达到19.58%(ad-rhLTF高剂量组)，证明ad-rhLTF通过干扰细胞周期发挥抗肿瘤作用。同时，小鼠肿瘤组织中Bcl-2mRNA和蛋白表达均减少(p<0.01)，而Bax、Fas、Caspse3mRNA和蛋白表达均明显增加(p<0.01)，证明ad-rhLTF诱导凋亡是通过启动了凋亡的线粒体途径和死亡受体途径进而引起caspase3的活化。试验也发现，ad-rhLTF处理组肿瘤组织中p53mRNA表达增加，PKB和PKC蛋白表达减少(p<0.01)，证明p53、PKB和PKC参与调节凋亡过程。通过对小鼠免疫功能的研究发现，ad-rhLTF高剂量明显地提高了荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数(p<0.05)，而ad-rhLTF低剂量对胸腺指数和脾指数无显着影响(p＞0.05)。Ad-rhLTF增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力和NK细胞的杀伤活性(p<0.05，p<0.01)，刺激小鼠脾细胞增殖(p<0.01)，增加了外周血CD4+T细胞的比例(p<0.05)，有效地纠正了肿瘤发生时CD4+T与CD8+T细胞比例的倒置。刺激小鼠脾细胞分泌IL-2、腹腔巨噬细胞分泌TNF-α (p<0.05)。外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-2、TNF-α的mRNA表达水平上升(p<0.01)，血清中的IL-2和TNF-α表达增加(p<0.05)，从而发挥细胞因子的抗肿瘤作用。此外，ad-rhLTF处理组PBMC中B7-1和B7-2分子mRNA表达上调(p<0.01)，脾细胞核转录因子NF-κB和AP-1高表达(p<0.01)，则促进T细胞克隆增殖，增强了抗肿瘤免疫。在MCF-7细胞体外培养试验中，ad-rhLTF作用于MCF-7细胞72h的IC50为100pfu/cell。Ad-rhLTF转染MCF-7细胞72h后, ad-rhLTF对MCF-7细胞具有明显的细胞毒作用，抑制了MCF-7细胞的增殖，并且经光镜、荧光染色和电镜观察MCF-7细胞出现了典型的凋亡形态学特征。经过Annexin V-FITC流式检测，ad-rhLTF明显增加MCF-7的凋亡细胞数，凋亡率达到31.92%(100pfu/cell)。细胞经琼脂糖凝胶电泳出现DNA“梯状”条带，细胞线粒体膜电位显着下降。Ad-rhLTF阻滞MCF-7细胞周期在G0/G1期。Ad-rhLTF也导致了Bcl-2mRNA的减少和Bax mRNA表达的增加(p<0.01)，从而证明ad-rhLTF诱导MCF-7的凋亡机制与线粒体途径有关。本文通过体内、外试验对ad-rhLTF的抗乳腺癌的作用及相关机制进行了较深入地研究，为ad-rhLTF在肿瘤靶向治疗领域的应用提供了理论基础。
佚名[9]2004年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2004年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中研究说明项 目 名 称申请者姓名单 位 名 称1 微生物学学科 (104项)粘细菌的种属分子分类及菌株分子鉴别技术吴志红山东大学野生稻内生固氮菌系统发育及分子遗传研究谭志远华南农业大学中国鸡皮衣科地衣分类学研究赵遵田山东师范大学拟盘多毛孢属及邻近属分子系统学研究
参考文献：
[1]. 腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验研究[D]. 罗涛. 中国医科大学. 2002
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[3]. 野生型P53基因转染和低能量激光照射防治移植静态再狭窄的实验研究[D]. 迟立群. 军医进修学院. 2001
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[6]. 乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究[D]. 陈泓. 广西医科大学. 2008
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[9]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2004年度资助自由申请科学基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2004