（厦门市第二医院肾内科 361021）
摘要：目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）在缺血再灌注急性肾损伤大鼠肾脏中的表达及EPC移植对其的干预作用。方法 抽取大鼠外周血，采用密度梯度离心的方法分离、培养内皮祖细胞。22头雄性SD大鼠随机分为正常对照组、缺血再灌注（I/R）组、EPCs移植组3组，术后第1天分别收获三组大鼠肾脏和血标本。流式细胞仪及细胞免疫荧光鉴定EPC表面标志（CD34/VEGFR-2）；测定血尿素氮和肌酐；行RT-PCR检测各组TGFβ1的 mRNA表达情况。结果 与正常对照组比较，缺血再灌注组大鼠的尿素氮、肌酐均明显升高，TGFβ1mRNA表达增高（P＜0.05）；给予EPC治疗后，缺血再灌注组大鼠的尿素氮、肌酐较治疗前明显下降，TGFβ1mRNA表达较治疗前明显下降（P＜0.05）。结论 EPC移植减少I/R肾损伤大鼠肾小管上皮细胞的凋亡、坏死、纤维化，改善肾脏血供等机制保护肾脏，有效抑制缺血再灌注急性肾损伤。
关键词：外周血；内皮祖细胞；缺血再灌注损伤；转化生长因子β1
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是临床一种常见的急危重症，尽管血液净化技术和危重医学有了很大的发展，但败血病、休克和严重创伤等所致ARF的病死率并未见减少，仍高达50%以上[1]。内皮损伤是I/R肾损伤致ARF的始动因素，而缺血/再灌注（I/R）肾损伤所致的间质肾小管坏死是ARF最常见的病因。因此如何促进缺血所致的肾脉管系统内皮的再生与修复，减轻肾小球硬化、肾间质纤维化是解决I/R肾损伤所致ARF的关键。Asahara[1]1997年首次发现了骨髓和外周血中内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）的存在，在损伤信号的诱导刺激下募集到血管损伤局部，分化为成熟内皮细胞，参与血管新生（angiogenesis）和内皮修复。因此，向受损的肾脏给予外源性的EPC促进肾脏修复，为治疗急性肾衰竭提供新的思路。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物：SPF级雄性SD大鼠22只，体重220-250g。
1.1.2主要试剂：EBM-2培养基（美国Lonza公司），玻璃粘连蛋白（vitronectin）、
Histopague-1083（Sigma公司）、胎牛血清（Hyclone）、小鼠抗大鼠CD34抗体、小鼠抗大鼠VEGFR-2抗体（美国Santa cruz公司）、羊抗鼠IgG-FITC（武汉博士德）、逆转录及PCR试剂盒（Promega公司）。
1.2方法
1.2.1内皮祖细胞的分离与培养：220-250g雄性SD大鼠常规消毒、腹腔注射10%水合氯醛（每100g给予0.3-0.4ml）麻醉，心脏采血5ml，用Histopaque -1083密度梯度离心分离外周血单个核细胞（2500 r/min，15 min），PBS洗涤细胞（1500 r/min，5min）。以含20%胎牛血清的EBM-2MV培养液重悬，将细胞悬液按5×106/m的密度接种到6孔板，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中孵育。3 d后换液弃去上悬液，已贴壁细胞更换新鲜培养液继续培养。
1.2.2 流式细胞仪检测外周血单个核细胞（MNC）CD34+细胞：设置测定管及同型对照管，分别取肝素抗凝全血50ul加入各管进行流式细胞术分析，测定管加入5ul小鼠抗大鼠CD34抗体，同型对照管加入5ul小鼠同型IgG1后，4℃避光孵育20min，PBS洗涤后，加入FITC标记的二抗4℃避光孵育20min，PBS洗涤后，重悬于500ulPBS，上机检测。
1.2.3 免疫细胞化学：原代细胞爬片，PBS浸洗后，4℃的4%多聚甲醛固定，分别加小鼠抗大鼠CD34抗体、小鼠抗大鼠VEGFR-2抗体，37℃温育细胞60min，PBS冲洗后分别滴加FITC标记的二抗，37℃孵育30min 后，荧光镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗。
1.2.4动物模型分组及处理：随机分为正常对照组（n =6）、缺血再灌注损伤组（IRI，n = 8）和 EPC处理组（n = 8）。IRI组采用右肾摘除左肾蒂夹闭左肾动脉、静脉 40 min 后松开制备缺血再灌注模型；正常对照组除未给予左肾动静脉夹闭外，余操作同 IRI模型组；EPC处理组动物同样制备缺血再灌注模型，夹闭40分钟后从左肾动脉移植EPC（5×106/1 m1）至左肾，缺血再灌注损伤组予注射同等剂量的细胞培养液。分别在灌注后1d 处死动物取肾组织。
1.2.5 尿素氮和肌酐的测定：分别在灌注后1d，采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，每100g给予0.3－0.4ml，从心脏抽取2毫升血液用于检测肌酐、尿素氮等生化指标。
1.2.6 TGFβ1 mRNA检测
1.3统计学分析
所有参数以均数±标准差（means±S）表示，用SPSS13.0统计软件分析。计量资料如符合正态且方差齐采用单因素方差分析和SNK检验，不符合上述要求采用秩和检验，P﹤0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1.内皮祖细胞集落形成
用密度梯度法分离获得的单个核细胞呈小圆形，细胞贴壁后开始生长、变大，3d后贴壁细胞开始增殖，形成“集落”（图1），放大倍数×400。
2.2流式细胞仪、免疫荧光鉴定内皮祖细胞
在FSC－SSC散点图上圈定单个核细胞为A门，用COULER分析系统对CD34+细胞进行分析，结果显示外周血CD34+细胞占MNC百分数（%MNC）为1.29±0.21%，（图2）。免疫细胞化学染色显示，培养细胞CD34和血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）表达阳性（图3）。
2.3 EPC治疗前后血肌酐、尿素氮水平比较
与正常对照组比较，缺血再灌注组大鼠的尿素氮、肌酐均明显升高（P＜0.05），给予EPC治疗后，治疗组大鼠的尿素氮、肌酐较缺血再灌注损伤组下降（P＜0.05）。（见表1）
2.4 各组TGFβ1 mRNA表达
对各组大鼠肾组织进行TGFβ1 mRNA RT-PCR检测。结果表明：与假手术组相比，缺血再灌注组TGFβ1 mRNA的表达明显升高P<0.05），经EPC治疗后，缺血再灌注组TGFβ1 mRNA的表达明显降低（P<0.05）。（见表1，图4）
3 讨论
自从Asahara首次提出EPC以来，有关EPC的研究日益增多。内皮祖细胞与造血干细胞都来源于一个共同的前体-造血母细胞，它们具有相同的细胞表面抗原CD34，CD34单克隆抗体可同时识别造血祖细胞和内皮祖细胞。EPC还表达多种细胞表面抗原，如CD133、VEGFR-2等。此外，外周血来源的EPC集落形成单位，反映的是其干细胞样的特性和集落形成能力[2]，是检测EPC功能的一种重要方法。在本次研究，我们通过检测CD34、VEGFR-2及集落形成来对EPC进行鉴定。
I/R所致的ARF，病理表现主要为肾小管上皮细胞水肿变性、管腔扩张，可见管型及炎性细胞浸润、肾小管的刷状缘不同程度的脱落、坏死过程[3]。I/R时内皮细胞功能障碍和结构受损在继发炎症中具有重要的作用，炎症细胞所介导的组织损伤在缺血再灌注损伤的发病机制中占有重要地位。I/R的损伤打击，导致肾小管间质细胞的活化、炎症细胞浸润，及多种细胞因子、生长因子等过度表达，进而导致肾功能进行性恶化。其中TGFβ1作为最主要的细胞因子，它参与肾小球硬化、肾间质纤维化的各个环节，其表达对小管间质及其内皮损伤有较强的提示作用。而通过对内皮损伤的修复，可预防或减轻上述损伤[4、5]。
EPC移植作为一种新的细胞治疗方法，可促进缺血组织血管新生[6]在国内外均有报道。Patschan[7]观察到I/R肾损伤后3-6小时内，肾缺血快速动员循环中EPC暂时贮存在脾脏，I/R肾损伤后第6天，EPC归巢至肾髓质乳头部。将肾髓质乳头部富集的EPC移植到I/R肾损伤小鼠，肾髓质间质中可见发荧光的移植细胞，且EPC移植改善了肾功能。有关EPC移植对肾脏缺血损伤的修复，赵洪雯[8]将EPC移植到局灶节段性肾小球硬化的大鼠，观察到EPC归巢至肾小球和小管上皮细胞部位，并可减轻肾小球硬化。本次研究中，我们将EPC注射到缺血再灌注损伤大鼠，发现I/R大鼠的血肌酐、尿素氮均较治疗前明显下降，而TGFβ1 mRNA的表达较前明显降低。这提示给予EPC治疗后缺血再灌注大鼠的肾功能明显得到改善，我们的这一研究结果与Patschan等的研究具有一致性。而EPC移植究竟通过什么机制改善缺血再灌注肾损伤大鼠的肾功能？这可能与EPC通过转分化为内皮细胞或旁分泌修复损伤的血管、抑制血管活性物质如TGFβ1等的激活有关，有待我们今后的实验中进一步研究与探索。
本实验通过对EPC移植治疗的研究，为今后ARF的治疗、防治提供新的思路和理论依据，为开辟新的ARF防治途径提供新方向。
参考文献
p1]Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science，1997，275（14）：964-967.
[2]Dimmeler S，Aicher A，Vasa M，et al.HMG-CoA reductase inhibitors（statins）increase endothelial progenitor cells via the PI3-kinase/Akt pathway.J Clin Invest，2001，108：391-397.
[3]Reinders ME，Rabelink TJ，Briscoe DM. Angiogenesis and endothelial cell repair in renal disease and allograft rejection. J Am Soc Nephrol，2006，17（4）：932-42.
[4]Basile DP. The endothelial cell in ischemic acute kidney injury：implications for acute and chronic function. Kidney Int，2007，72（2）：151-6.
[5]Li XQ，Meng QY，Wu HR. Effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation on vein microenvironment in a rat model of chronic thrombosis. Chin Med J（中华医学杂志英文版），2007，120（24）：2245-2249
[6]Uchimura H，Marumo T，Takase O，Kawachi H，Shimizu F，Hayashi M，Saruta T，Hishikawa K，Fujita T. Intrarenal injection of bone marrow-derived angiogenic cells reduces endothelial injury and mesangial cell activation in experimental glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol，2005，16（4）：997-1004.
[7]Patschan D，Krupincza K，Patschan S，Zhang Z，Hamby C，Goligorsky MS. Dynamics of mobilization and homing of endothelial progenitor cells after acute renal ischemia：modulation by ischemic preconditioning. Am J Physiol Renal Physiol，2006，291（1）：F176-85.
[8]赵洪雯，余荣杰，刘宏，彭侃夫，吴雄飞. 内皮祖细胞移植对延缓大鼠进展性局灶节段性肾小球硬化的实验研究. 第三军医大学学报，2007，29（21）：2044-2048.
论文作者:武挺1,王玉新（通信作者）,周丽娜,张以勤
论文发表刊物:《航空军医》2017年第13期
论文发表时间:2017/8/28
标签：细胞论文; 损伤论文; 内皮论文; 大鼠论文; 小鼠论文; 肾脏论文; 肾小球论文; 《航空军医》2017年第13期论文;