【摘要】 目的：探讨PLAC4基因用于21三体综合征无创性产前诊断的可行性及SNP候选位点。方法：选择在潍坊市人民医院产前检查的7～16周正常单胎妊娠妇女30例为孕妇组，健康查体非妊娠女性30例为对照组，采用荧光定量PCR技术检测PLAC4基因mRNA的表达水平，用PCR和DNA测序技术检测PLAC4基因候选SNP位点的杂合度。结果：PLAC4基因mRNA仅在正常妊娠妇女外周血中检测到，浓度中位数为7.862×103copy/ml，对照组中未检测到，两组差异有明显统计学意义(P＜0.01)；PLAC4基因上3个SNP位点(rs4818219，rs8130833和rs59066201)的杂合度高于20%，分别为33.9%，25.5%，42%。结论：PLAC4基因mRNA是21三体综合征产前诊断的生物学标志物，PLAC4基因上3个SNP位点(rs4818219，rs8130833和rs59066201)可作为21三体综合征无创性产前诊断的候选位点。
【关键词】 PLAC4基因；杂合度；21三体综合征；无创性产前诊断
【中图分类号】R714.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）34-0155-03
21-三体综合征(Trisomy 21syndrome)，又称唐氏综合征(Down's syndrome)，是新生儿最常见的非整倍体染色体疾病[1-3]。主要临床特征是智力低下，特殊面容和多器官发育迟缓，对人类伤害极大且无有效的治疗方法。因此产前筛查和产期诊断是预防该疾病的重要手段[4]。目前临床常用的染色体核型分析需要依赖有创性手段获取胎儿细胞，对母胎均有一定的风险[5]，因此无创性产前诊断为近年来的研究热点。
2007年，Lo等[6]发现21号染色体上的胎盘特异性表达（Placental Specific Expression Gene,PLAC4）基因仅在胎盘表达，具有胎儿特异性。这个发现为应用胎儿游离核酸进行21三体综合征无创性产前诊断提供了科学依据。随着基因组技术在产前诊断临床应用方面取得的最新进展[9,10]，有研究者提出母体血浆中PLAC4基因mRNA的定量分析将会有助于胎儿21三体综合征的诊断[7,8]。
本研究通过检测妊娠妇女和非妊娠妇女外周血中PLAC4基因mRNA表达水平差异以及计算分析健康人群PLAC4基因多态性位点杂合度，来探讨PLAC4基因在21三体综合征无创性产前诊断中应用的可行性，为其临床应用奠定理论基础。
1.材料与方法
1.1 研究对象
选择2016年10月—2017年11月在潍坊市人民医院进行产前检查的7～16周正常单胎妊娠妇女30例为孕妇组，同期进行健康查体非妊娠妇女30例为对照组，均无内外科疾病和吸烟史。签署知情同意书后。抽取外周静脉血5ml，置于乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝管中，并于低温冰箱保存。
1.2 方法
1.2.1外周血PLAC4基因mRNA的表达水平检测
1.2.1.1全血RNA的提取 常规提取两组妇女样本的总RNA，终产物溶于20μl DEPC-ddH2O中，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，将提取的总RNA进行标记并保存于-80℃冰箱。
1.2.1.2 PLAC4基因mRNA表达水平的检测 抽取总RNA 10μl，荧光定量PCR技术检测两组PLAC4基因mRNA的表达水平，PLAC4基因PCR引物和探针序列如下：
PLAC4引物上游为5’-AAATGCAGATTCTCAGGTCCTAGTG-3’，下游为5’-TGCCGATGGTTCCTGGAA-3’；
PLAC4 Taqman探针为5’-CTGCAAGGTATTCCTG-3’。反应总体系为25μl，其中cDNA 5μl，2×Premix缓冲液12.5μl，上下游引物各0.2μl，Taqman探针0.2μl。为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照组和4个标准品，每个样本都平行做3个复孔。
PLAC4基因的PCR反应条件：94℃预变性2min，93℃变性45s，60℃退火15s。循环10次，最后93℃变性30s，59℃退火45s，30个循环。
1.2.2 PLAC4基因SNP位点杂合度检测
1.2.2.1外周血基因组DNA的提取 使用DNA抽提试剂盒（中量血液基因组DNA提取试剂盒-离心柱型，北京天根公司）提取基因组DNA。操作步骤严格按照说明书进行。紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，OD值介于1.8和2.0之间的留用。将提取的基因组DNA进行标记并冷冻于-80℃冰箱。
1.2.2.2引物设计 查找NCBI数据库，筛选PLAC4基因上杂合度较高的4个SNP位点，候选位点为rs8130833，rs9977003，rs4818219和rs59066201。依据NCBI数据库上PLAC4基因序列信息，合成引物序列。
1.2.2.3检测SNP位点杂合度 PCR成份组成：10XBuffer 2μl，Template 1μl，Primer F 0.5μl，Primer R 0.5μl，dNTP 0.5μl，TransStart Taq Polymerase 0.2μl，加ddH2O补至 20μl。
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃ 终延伸5min，变性、退火和延伸进行35个循环。
4个位点(rs8130833，rs9977003，rs4818219和rs59066201)的扩增片段长度分别为492bp，487bp，576bp和474bp。
PCR产物经虾酶消化后，去除部分残留二聚体和杂质对测序的影响，将样本送去金唯智公司测序。
2.结果
2.1 外周血中PLAC4基因mRNA的表达水平
两组妇女外周血PLAC4 mRNA水平比较见表1。孕妇组PLAC4 mRNA表达水平的最小值为3.221×103copy/ml，最大值为13.657×103copy/ml，中位数为7.862×103copy/ml，对照组中均未检测到PLAC4 mRNA的存在。两组比较，差异有明显统计学意义（P＜0.01）。因此，PLAC4mRNA可作为21三体综合征的无创性产前诊断的生物学标志物。
表1 两组标本PLAC4 mRNA 水平比较
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。
2.2 PLAC4基因SNP位点杂合度分析
PLAC4基因4个SNP位点PCR产物扩增结果见图1，4个位点的原始碱基均为A，rs4818219，rs8130833，rs59066201和rs9977003 原始位点A的基因频率分别为0.7833，0.850，0.700和0.0167，可以计算得出PLAC4基因上3个位点（rs4818219，rs8130833和rs59066201）的杂合度较高，分别为0.339，0.255和0.420（表2），可作为本地人群21三体综合征无创性产前诊断的候选位点。
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图1 PCR产物电泳结果
（自左至右分别为rs8130833，rs9977003，rs 4818219，rs59066201，Marker）
表2 SNP位点杂合度分析
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3.讨论
21三体综合征是最常见的染色体病之一。近年来，染色体核型分析一直是临床上21三体综合征产前诊断的金标准[11, 12]。由于该方法是使用有创性手段获取胎儿细胞，有一定的风险，故不能在孕妇中广泛开展。因此无创性产前诊断已被大量倡导。近年来学者们致力于探讨应用母血中胎儿游离核酸无创性产前诊断21三体综合征的可行性。
本研究中，我们分别检测了孕妇组和非孕妇对照组外周血中PLAC4基因mRNA的表达水平，结果显示，孕妇组PLAC4基因mRNA浓度中位数为7.862×103copy/ml，而非孕妇组中均未检测到PLAC4基因mRNA的存在，因此PLAC4基因mRNA在两组妇女外周血中的表达水平存在明显差异，具有妊娠特异性，可视为21三体综合征产前诊断的生物学标志物。而且我们利用PCR和DNA测序技术对PLAC4基因上4个SNP位点的杂合度进行了分析。结果显示其中3个位点，即rs4818219，rs8130833和rs59066201的杂合度高于20%，可作为PLAC4基因21三体综合征无创性产前诊断的候选位点。
孕妇外周血中胎儿特异性mRNA的发现为无创性产前诊断的研究开辟了新的篇章，从母血中寻找母体不表达的胎儿特异性mRNA，即不存在胎儿有核红细胞微量的缺点，又成功避开了庞大的母体背景，实为从母血中无创性获取胎儿遗传物质的最佳途径。
【参考文献】
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论文作者:胡春风,王翠艳,刘红英（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年34期
论文发表时间:2018/12/13
标签：基因论文; 产前诊断论文; 综合征论文; 位点论文; 胎儿论文; 合度论文; 引物论文; 《医药前沿》2018年34期论文;