宁夏石嘴山市第二人民医院检验科 753000
【摘 要】病原学诊断不明是造成抗菌药物不合理使用的一个重要原因。微生物室应当与临床密切配合，评估呼吸道标本的质量。微生物检验人员应当加强直接涂片和各种染色等基本功的训练，并开展快速检测手段，提高肺部感染的病原菌诊断水平。
【关键词】肺炎；院外获得性感染；微生物学技术
呼吸道感染（RTI）是一种常见病、多发病，是门诊就诊患者人数的首位。据统计，我国每年有近5亿人感染呼吸系统疾病，7岁以下儿童平均每人每年患急性RTI 3-4次。RTI是抗菌药物使用频率最高、用量最多的疾病。抗菌药物的出现使感染性疾病病死率下降，人类的平均寿命延长。然而，由于滥用抗菌药物，导致菌群失调，耐药菌株逐年增多，耐药菌感染成为除癌症、心脑血管疾病和AIDS外威胁人类健康的第4大医学问题。抗菌药物的不合理使用是一个世界范围的现象，抗菌药物近25% 用在呼吸道感染。
常见的下呼吸道感染有社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）、呼吸机相关肺炎（VAP）、慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）等。对于这些疾病，合理用药，延缓耐药发展的前提条件是病原菌的正确诊断。对于重症肺部感染，只有找到病原菌，才能选择正确的抗菌药物，合理用药，避免耐药的发生。目前临床对病原学诊断的重要性认识不足，常常满足于经验性治疗，经常见到病因模糊的诊断如“慢性肺炎”；临床和微生物检验脱节；临床医师不相信细菌室报告，对合格标本的取材认识不足；微生物室不关心患者情况，回报时间晚，阳性率低；检验设备、科研投入不足。这些均限制了病原学诊断的发展。“不明原因肺炎或肺部感染”的诊断屡见不鲜。提高肺部感染病原学的诊断水平，应当注意以下几个方面。
一、临床医师应当注意标本的正确取材
1.呼吸道标本：最好在应用抗菌药物前采集。可接受的标本包括：痰（以晨起后采集为佳）、气管及支气管抽吸液、支气管肺泡灌洗液、支气管毛刷、支气管活检、肺抽吸液或肺活检。对于肺组织标本，临床常常重视病理检查，而忽略了微生物的检验。对于疑难病例，送病理的同时，应同时送细菌室进行细菌学的涂片、镜检和培养。送检时，将肺组织标本浸在0.2-0.5ml生理盐水中，以防止其干燥。
下呼吸道标本应在采集后立即送至细菌室，并于1h内接种，室温下放置超过2h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率，而定植于上呼吸道的非致病菌则过度生长。特别须注意的是，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛氧菌不喜低温，下呼吸道标本勿冷藏。
不可接受的标本包括唾液样痰、24h收集的痰、试子。临床医师应当督导患者咳出合格的痰标本，而非唾液。
2.血液：对于体温超过38.5℃的患者，应当及时抽血作2-3份血培养。所谓的“份数”是指“穿刺点”的数量，而非瓶子数。对于成人，每瓶血量应为8-10ml。
当怀疑厌氧菌感染或其他特殊细菌感染时，应当及时与细菌室联系，以便细菌室制备相应的新鲜、特殊培养基，并在必要时进行床边接种。
临床医师应及时与细菌室沟通，介绍患者病情，征求细菌室意见。对于肺组织标本，应当展开大撒网式检测。及时的沟通，有助于提醒细菌室在大撒网的同时，有所侧重，以提高检出的阳性率。
二、微生物室应当重视下呼吸道标本的标准化操作
所有痰标本应记录其外观和性状，如脓痰、黏液脓痰、黏痰、水样泡沫、血性等。每份标本必须进行涂片、革兰染色镜检，评价痰标本质量。合格痰标本应当记录所见细菌等病原体情况。记录细菌时要求按革兰阳性或阴性、球菌或杆菌等分别记录平均每油镜视野中细菌的大致数量。对于合格标本，要记录WBC内有无吞噬的细菌，这样的细胞占整个WBC的比例，细胞内细菌的形态等。有文献认为，吞噬有细菌的WBC达到5%以上，对于HAP或VAP的诊断有重要意义。
1.下呼吸道细菌学标本的涂片检查：选择标本的脓性部位或带血部分涂成均匀薄片，做革兰染色镜检。低倍镜下记录细胞数，痰标本显微镜检查的分类见表1.不合格的痰标本，实验室应立即通知临床重新留痰送检。在涂片中如有柱状上皮细胞不应计数于鳞状上皮细胞中，应注明其数量，作为合格标本对待。
2.下呼吸道标本的细菌培养：（1）标本培养前的处理：不含或含黏液很少的合格标本，可直接接种。遇有含大量黏液的标本，应加入等量液化剂sputosol（一种商品化的痰液溶解剂），作用20min溶解黏痰，使痰液均质化后接种。（2）分离培养：将处理后的痰液接种于血琼脂平板、含抗生素的巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板或中国蓝平板，接种后置于5%~10%CO2中，35℃培养18~24h，并根据菌落及形态特点做出初步判断并进行纯分离及生化鉴定。如24h无细菌生长应再放置24h，再观察菌落生长情况，如仍无生长则定为阴性。（3）痰半定量：即用接种环将痰液在血平板和巧克力平板上按规定的划线要求作三区划线方式接种标本进行培养；三区划线方法：首先用棉签蘸取经sputosol溶解的痰液（或将接种环通过火焰灭菌，冷却后挑取少许标本，尽量取有脓或血的部位），然后将其涂布在平板第一区，并作数次划线，再在二、三区依次用接种环划线，每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。半定量痰培养的临床意义见表2。
3.肺组织标本的微生物学检验：介入操作获得的肺组织标本非常珍贵，细菌室应当对其进行大撒网式检验，即同时进行细菌、真菌、分枝杆菌的涂片和培养。穿刺获得的肺组织常常很少，要提高检验的阳性率，首先应当对组织标本进行研磨。对于标本量少的组织，建议采用小号的研磨器，研磨时加少许脑心浸液肉汤。最好涂3张片，即使标本量少，也要至少涂1张片。涂片可以先进行革兰染色，如结果阴性，可以用95%的酒精脱色后再按照程序分别进行抗酸染色或六胺银染色（检查真菌或卡式肺孢子菌）。
注：分类中1~3类不做培养，要求重新留取标本；4、5类为合格标本；6类为气管穿刺液时，如未见白细胞，而鳞状上皮细胞＞10个/每低倍镜，亦应重新留取标本
4.重视直接涂片，开展多种染色技术：临床微生物室应当加强直接涂片镜检的力度，由具有微生物培养经验的镜检人员负责把关，并应根据临床的需求，不断开展新的涂片染色技术，建立系统的多种染色技术，特别是对组织标本，应当至少包括以下涂片染色技术：革兰染色、10%的KOH压片（检查孢子和菌丝）、抗酸染色、弱抗酸染色（检查奴卡菌）、六胺银染色（检查真菌和卡氏肺孢子菌），必要时，进行Warthin-Starry染色（检查巴尔通体、螺旋体、军团菌等）。
直接涂片镜检的优势在于：（1）简单快速，通常2~4h可以报告结果。而普通细菌培养鉴定的时间至少2~3d，真菌和分枝杆菌的时间更长。因此，直接涂片可以快速指导临床选药。（2）对于某些难生长的菌，直接涂片可能是惟一的诊断手段。如肺毛霉菌病，因为毛霉菌“怕”冷，组织匀浆可能会破坏毛霉菌，因此真菌培养的阳性率不高，造成“假阴性”。而卡氏肺孢子菌，因为无法体外培养，诊断只能靠直接涂片或PCR技术。（3）直接涂片可以为组织培养提供方向。肺组织标本常常很少，简单的涂片可以让我们把握培养的重心。（4）呼吸道标本，如痰标本，杂菌相对比较多，特别是一些快生长的菌因生长较快，会掩盖慢生长的菌而导致培养阴性，但涂片可以发现这些慢生长的菌。某肺部空洞患者的黄脓痰标本革兰染色发现：低倍镜下可见大量WBC，上皮＜10个/低倍镜，油镜下发现较多的假菌丝和孢子，以及一些着色不均的革兰阳性长丝状菌。24h培养发现白念珠菌遍布整个平皿。此患者口服200mg氟康唑后，再次进行培养，平皿放置48h培养出奴卡菌。
细菌室应努力开展新的涂片染色技术以满足临床的需要。列如弱抗酸染色、六胺银染色、Warthin-Starry染色等，以检测特殊的病原菌。
5未来的发展方向：快速检测和分子检测技术。为了提高肺部感染诊断的阳性率，目前许多快速检测技术如军团菌抗原检测、肺炎链球菌抗原检测、曲霉菌半乳甘露聚糖实验、隐球菌抗原检测等已在临床开展和应用。以多重PCR为基础的分子检测技术可以检测10多种呼吸道病原菌，包括病毒和非典型分枝杆菌，随着这些分子技术的标准化，未来也会在临床得到应用。
参考文献：
[1]王辉，陈民钧。《中华检验医学杂志》，2009年3月 第32卷 第3期 32：245-248
论文作者:卫娟,张彩霞
论文发表刊物:《航空军医》2015年17期
论文发表时间:2016/4/26
标签：标本论文; 涂片论文; 细菌论文; 呼吸道论文; 微生物论文; 组织论文; 肺部论文; 《航空军医》2015年17期论文;