李西平[1]2000年在《人类珠蛋白基因转录水平的定量技术及其初步应用研究》文中认为人类红细胞的血红蛋白是由α-珠蛋白基因簇编码的两条珠蛋白肽链及β-珠蛋白基因簇编码的两条珠蛋白肽链组成的四聚体。α基因簇位于16号染色体，含四个功能基因，依次为5’-ζ-α_1-α_2-θ-3’；β基因簇位于11号染色体，含5’-ε-~Gγ-~Aγ-δ-β-3’五个功能基因。人类各珠蛋白基因表达具有一定的时间性及空间性，对每一类基因，某一阶段仅表达一个或以一个基因表达为主。当某一基因发生突变，其转录效率，mRNA的稳定性，及编码功能等都可能不同程度地发生异常，并可能影响同簇其它基因的表达。地中海贫血即是因珠蛋白基因异常而引起的一种主要在儿童期起病的遗传性溶血性贫血。人们根据突变珠蛋白基因的不同而将其分为α-，β-，δβ-，及γδβ-地贫等四种类型。本病在地中海沿岸，东南亚及我国的广东，广西，四川等地高发，对儿童健康影响很大，目前尚无有效的治疗手段。对突变基因，正常基因的研究，有望为临床治疗疾病提供理论基础。 近年来，随着分子生物学的快速发展，人们在基因水平已对地中海贫血的分子机制进行了深入而广泛的研究。而基因工程技术的日渐完善，亦为人们研究珠蛋白基因调控机制提供了有效的手段，这些均使人们日益注重基因转录表达的研究。为此，一个行之有效的检测珠蛋白基因转录水平的方法迫切需要建立。 国外已往的研究，多采用RT-PCR法，亦有采用探针法对珠蛋白基因转录水平进行定量。但每次仅局限于2-4种珠蛋白基因，在同时研究各种类型地中海贫血甚至复合型地中海贫血的致病机制，及全面系统地研究珠蛋白基因表达切换规律，研究基因调控机制等时，其应用即受到限制。而国内在此领域的研究开展得不多。目前尚未见同时对七种珠蛋白基因转录水平进行监测的报道。 本研究的目的即是建立一个能同时对7种珠蛋白基因（α，β，~Aγ，~Gγ，δ，ε，ζ）转录水平进行定量的方法。由于探针定量法RNA需量大，尤其对儿童不适宜，且RNA易降解，操作时条件要求高，因此我们D 选用盯－pCR t作为定量方汪。Dl 在外周血中含量高，尚含RNA，故被用于珠蛋白某因转录的研究中。在lD 本研冤中我们宜先对外周血网织红细胞的分离方法进行了改良，配制出DD 一种可高产量分离网织红细胞的细胞分离液，并将与常用的淋巴细胞分Dl 离液相比较，证明效果好，产量高。我们又对细胞质 NA提取方法进行 lDJ叹臣，经勺并腑氰限肌活比牧，显不广重同，和盯少，且N＠叮捉脐DD 口＊A，尤耳适用于地窗等需同肘对其某因水平讲行定体研究时。巾干同DD 族坏蚤曰基凶的问源性很局，在拨计引物时，除考虑W密码于的兼Dl 最终自行设计出 13条共七对引物，经基因库拟合，确证特异。且产物片 lD 段众皮与狈朋阴一致。在硼定仅匝怀杀组成过程中，多次对＊才”浓度进DD 行调整，最终确定 17．5－20mM为适宜浓度。在 PCR参数选择上，经多次 Dl＆索条件，当 94’C，50’C及 72’C各 lmin时，即可全部扩增出 7种产物，lD 优化实验条件时。将每个循环的退火时间缩短30s。。，延伸时间缩短D120see，仍可得到特异的产物，但每次循环时间可节约 25分钟。lD 利用新建的方法从脐血，正常婴儿及成人外周血中分离网织红细胞，Dl 提＆ RNA后，进行 RT－PCR 显示随着年龄的增长，胚胎型珠蛋白基因 lIy，。的相对量呈下降趋势，表现为。Iy．mopA从脐血的 0．54，到 61l 月时的 0．87，成人的 1刀5。a／。－mRNA自 1．42，1．76，到 2．36，符合已 lD 知基因表达切换规律，即在个体发牛发育过租中．琳胳型珠蛋R某田优Dl 无农这，随二渐被具他成人型基囚代督。且叶Y－mRNA的变化与HbFl 阴要化一欺。验证了本方法的可信性。进一步又对7例地中海盆血患者llgn＃ffi臼 iRNA作出相对定量，在两例携带 Q．地贫 l＄因的患者中，lD 检测到 g－mRNA RT－PCR产物，同时 a．mANA的 RT－pCR产物量明显下 DD 降，符合缺失型突变的预期的致病机理。旷纯合子较p’双重杂合子的DDa川－mRNA低，而旷杂合子则比其纯合子低．与预湖结讼一＠。以佑DD 外培养的淋巴细胞提取的RNA作空白对照，用RTPCR检测珠番白某田DD 转求水干，5份标本结果全阴，初步显示此方法假阳性率低。Dl 此足重万法侧步叹用显不，结果可靠，省时（较以前方法至少节约ll 三分之二时间），假阳性率低。l1．4．lI 此定量方法除可在各种地中海贫血突变基因的致病机理及人类珠蛋D 白基因表达切换规律的分析中应用外，尚可用于药物调控珠蛋白基因表D 达机理及珠蛋白基因表达调控机制等的实验研究中。由于
卢焯明[2]2012年在《黄芪及其复方治疗小儿β地中海贫血的疗效及分子机制》文中指出研究背景：我国尤其南方各省是p地中海贫血的高发区。p地贫患儿由于p珠蛋白链的合成障碍及α、p链的不平衡导致无效造血、慢性溶血性贫血及多种并发症。重型及部分中间型患儿常常需要依赖终身规律的输血,同时也需要长期的铁螯合治疗以减轻机体铁负荷。输血及铁螯合剂对于我国等发展中国家的患者均是沉重的经济负担,同时也存在输血相关性传染病、血管内皮损伤、骨关节痛等诸多副作用。地贫的基因治疗目前离临床应用还有很长一段距离,而干细胞移植由于干细胞来源、移植风险、费用等因素也很难普及。目前我国很多β地贫患儿均没有得到规律的治疗而长期处于低血红蛋白的状态从而严重影响到生长发育甚至危及到生命。对大量地贫患儿如何进行有效而又副作用小的治疗,是当今医学的难题,也是重要的社会问题。药物基因诱导是p地贫的研究热点。其基本原理是通过药物诱导新生儿期后近乎关闭的γ珠蛋白基因重新高表达,合成胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)以在功能上替代正常的血红蛋白,同时也可结合过剩的α链以减轻红细胞破坏,从而改善贫血及减少并发症。Y珠蛋白基因诱导药物主要包括细胞毒药物、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、雷帕霉素靶点抑制剂、细胞因子等种类。但目前可真正应用于临床的药物还很少,而各种基因诱导的化学药物无论是羟基脲、5-氮胞苷、丁酸盐还是促红细胞生成素等均有各自明显的缺点,或是有骨髓抑制、潜在致癌等副作用,或是药效短暂,或是价格昂贵等,均严重限制了其临床应用。中医药相对副作用较小,目前以中药治疗p地贫的研究多数是个案报道及一般性临床观察,规范深入的课题仅见益髓生血颗粒系列研究。但益髓生血颗粒为大复方,药味众多,难以进一步研究及发现其有效成分,有必要从单味中药或小复方发掘基因诱导药物。本课题组既往及新近的体外实验发现中药龟板、黄芪、党参等能使人类红系K562细胞或p地贫患者红系祖细胞的丫珠蛋白mRNA增加,HbF提升。与丁酸盐比较中药对细胞生长无抑制,诱导维持时间也显著较长。对单味黄芪的深入研究发现,其诱导HbF的主要有效成分在富含多糖的水溶部分,而黄芪多糖有类似作用。基于体外实验研究所显示的效果,结合中医中药理论,本研究首次选用单味黄芪以及由黄芪、党参、龟板组成的小复方中药对p地贫患儿开展随机对照双盲的前瞻性临床研究,以在体内验证中药的效果,客观评价其临床疗效及安全性。本研究同时拟对中药在患者体内起效的分子机制进行探讨,验证本课题的中药在体内是否也能诱导γ珠蛋白基因的表达。p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是与γ珠蛋白的生成关系最为密切的信号分子之一。本课题组既往的研究表明,p38MAPK信号通路的激活是丁酸钠等药物诱导红系细胞γ珠蛋白基因表达的重要机制,涉及对转录因子的影响及表观遗传机制。本课题组其它博士生新近的研究也表明,龟板、黄芪在体外诱导γ基因也与p38MAPK的磷酸化有关。因而本研究也对患儿用药后体内p38MAPK的变化进行探讨,以从细胞信号通路角度分析中药的体内起效机制。方法：1.患者分组与治疗方案：本课题为随机对照双盲的前瞻性临床试验。两家研究中心共有57例β地中海贫血患儿纳入研究,按中间型及重型随机分配进入复方组、黄芪组、安慰剂对照组。复方组患儿口服黄芪、党参及龟板颗粒,其中2-6岁患儿每日三种中药颗粒各1袋,6-12岁患儿每日各2袋,12-18岁患儿每日各3袋。黄芪组口服单味黄芪颗粒,其中2-6岁患儿每日3袋,6～12岁患儿每日6袋,12～18岁患儿每日9袋。对照组口服安慰剂颗粒,其中2-6岁患儿每日3袋,6-12岁患儿每日6袋,12～18岁患儿每日9袋。疗程均为12周。重型患儿在以上治疗基础上加用输血治疗,每隔4周输血一次。2.评价疗效的指标：(1)治疗开始前及治疗满4周、8周、12周分别取患儿的手指末梢血检测血常规,观察血红蛋白(hemoglobin, Hb)、红细胞总数(redblood cell, RBC)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume, MC V)、平均红细胞血红蛋白量(1mean corpuscular hemoglobin, MCH)、红细胞体积分布宽度(redblood cell volume distribution width, RDW)、(2)治疗开始前及治疗满12周后分别抽取患儿静脉血以碱性血红蛋白电泳检测HbF比例；采用碱性血红蛋白电泳结合比色法检测HbF含量。(3)治疗开始前及治疗满12周后分别抽取患儿静脉血计数外周血网织红细胞；采用比色法检测红细胞孵育渗透脆性。(4)对中间型患儿在治疗开始前及治疗满12周后腹部触诊检查肝肋下及脾肋下的大小。(5)在治疗开始前及治疗满4周、8周、12周分别测量体重、心率及血压一次。(6)参照中医证候分型标准,统计各组患儿气血两虚与肝肾亏虚四诊症状的改善率。3.疗效标准：(1)显效：治疗后Hb上升≥3g/dL,同时伴有不同程度的HbF升高；(2)有效：治疗后Hb上升≥0.5g/dL但<3g/dL,同时伴有不同程度的HbF升高；(3)无效：治疗后Hb上升<0.5g/dL。疗程结束后统计各组的显效、有效及无效人数,计算显效率及总有效率。4.安全性指标：如前述检测血常规,观察白细胞总数(White blood cell, WBC)、中性粒细胞总数(neutrophil, NEU)、血小板总数(platelet, PLT)。治疗开始前及治疗满12周分别检测肝肾功能指标,包括血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸酰基转移酶、尿素氮、肌酐。疗程结束后统计各组患儿各项不良反应症状发生率及各项评价安全性的实验室指标。5.分子生物学实验：课题同时以实时荧光定量RT-PCR、Western Blot方法研究患儿治疗前后α,β,Gγ和Aγ珠蛋白基因的表达水平以及p38MAPK细胞信号通路的激活。在治疗前及治疗满12周后,抽取中间型各组患儿外周血,采用不连续密度梯度离心法分离包含有核红细胞在内的单个核细胞。从Genbank查得各基因序列,设计并合成引物。用Trizol提取总RNA后进行逆转录反应,随后进行实时荧光定量PCR反应。根据标准曲线、各样本的Ct值并以内参照基因矫正得出各目的基因mRNA水平相对的拷贝数。另外提取蛋白,SDS-PAGE分离蛋白,蛋白质转膜,用p38MAPK和磷酸化p38MAPK抗体与蛋白质杂交,通过图像分析系统分析每个样p38MAPK磷酸化p38MAPK条带与内参照条带的积分光密度值比值。6.统计学分析：以原始数据录入SPSS13.0软件建立数据库并进行统计学处理,对各指标进行组间比较及治疗前后比较.o P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.血常规指标：经黄芪及其复方中药颗粒12周的治疗,中间型p地贫患儿的Hb水平有显著提升,其中复方组Hb提升值为1.21±1.12g/dL,黄芪组为1.05±0.80g/dL,而安慰剂对照组则轻微下降了0.28±0.51g/dL,3组比较差异有统计学意义(F=10.209, P<0.001)。中间型复方组12周的Hb水平为8.91±1.07g/dL,黄芪组Hb水平为8.40±1.06g/dL,均显著高于对照组的7.30±1.07g/dL(分别P=0.001,P=0.017)。中间型复方组Hb在治疗前后不同时间水平间的差异具有显著性(F=8.773,P<0.001),黄芪组Hb前后差异也具有显著性(F=20.940, P<0.001),而对照组Hb在治疗前后则无显著性差异(P>0.05)。12周的治疗后,重型地贫患儿复方组Hb提升值为0.46±0.61g/dL,显著高于对照组的-0.55±0.66g/dL(P=0.033)。重型复方组12周的Hb水平为7.91±0.49/dL黄芪组Hb水平为7.74±1.15g/dL,均显著高于对照组的6.65±1.10g/dL(分别P=0.024,P=0.043)。中药治疗也能在一定程度上改善患儿的其他血常规指标包括RBC及MCH。2.HbF水平：中间型复方组治疗后HbF比例较治疗前有显著提升(62.80%±22,85%vs.54.00%±20.63%,t=-2.910,P=0.016):黄芪组治疗后HbF比例也较治疗前显著提升(68.10%±16.63%vs.60.06%±16.29%,t=-4.103,P=0.001)。两组HbF含量在治疗后较治疗前也有显著增加(分别t=-3.896,P=0.003；t=-4.616,P=0.001)。中间型复方组、黄芪组治疗后HbF含量均显著高于对照组(分别P=0.001,P<0.001)。重型复方组治疗后HbF比例较治疗前也有显著提升(22.75±6.97%vs.20.23±7.06%,t=-3.424,P=0.014):黄芪组治疗后HbF比例同样比治疗前显著提升(29.01±12.50%vs.22.46±12.25%,t=-3.215,P=0.015)。两组HbF含量也有显著性增加(分别t=-3.156,P=0.020；t=-3.491,P=0.010)。无论在中间型患儿还是重型患儿中,安慰剂对照组的HbF比例及含量在治疗前后的差异均无统计学意义(P>0.05)。以上结果提示黄芪及其复方均能显著提升患儿的HbF水平。3.其他临床研究指标：中间型黄芪组、重型复方组治疗后的网织红细胞比治疗前均有显著性升高(分别t=-5.790,P<0.001；t=-3.195,P=0.019),中间型复方组治疗后的红细胞孵育渗透脆性也较治疗前有显著性改善(t=-2.331,P=0.042)。各组肝脾肋下大小在治疗前后无显著性差异。中间型黄芪组的体重、重型复方组的收缩压治疗后比治疗前均有显著性提升(分别F=5.330,P=0.017；F=8.551,P=0.001)。另外中药治疗对中医气血两虚症状及肝肾亏虚症状的改善均优于安慰剂。4.临床疗效判定：中间型复方组患儿的总有效率为63.6%,黄芪组患儿的总有效率为61.5%,而对照组为9.1%,三者有显著性差异(x2=8.681,P=0.013)。重型复方组患儿的总有效率为42.9%,黄芪组患儿的总有效率为50.0%,而对照组为0%,三者也有显著性差异(x2=6.871,P=0.032)。综合以上结果,提示黄芪及其复方中药治疗小儿β地贫是具有一定疗效的,可基本排除安慰剂效应。5.不同药物及不同类型患儿的疗效：对于以上大多数指标,复方组及黄芪组的差异无统计学意义,提示两种药物的疗效接近。中间型患儿的总有效率虽高于重型患儿,但按目前的样本量未发现两者有显著性差异。中药对不同表型、不同基因型、不同中医证候类型患儿的疗效虽有差别,但均未达到统计学意义。6.安全性评价：服用单味黄芪的患儿鼻衄症状发生率相对较高(x2=7.697,P=0.021),其他可能与药物不良反应相关的症状发生率在中药与安慰剂之间无显著性差异。各组患儿的WBC、NEU、PLT及肝肾功能指标在疗程结束后的组间差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗前后的差异也无统计学意义(P>0.05)。无一例患儿因不良反应而需要停药。7.随访期指标：中间型及重型复方组及黄芪组患儿在随访期内输血次数均少于对照组,但差异未达到显著性(P>0.05)。8.分子生物学实验结果：实时荧光定量RT-PCR结果显示,复方组、黄芪组治疗后的Gγ珠蛋白基因mRNA均显著高于治疗前水平(分别F=14.152,P=0.004:F=14.854,P=0.002),两组分别提升了1.65倍及1.53倍,同时也显著高于对照组(分别P=0.010,P=0.036),提示中药可在体内诱导患儿Gγ珠蛋白基因的转录表达。中药对患儿αβΑγ珠蛋白基因以及p38MAPK基因的IRNA水平无显著性影响。Western Blot结果显示,复方组、黄芪组的磷酸化p38MAPK蛋白水平在治疗后均显著高于治疗前(分别t=-4.234,P=0.002:t=-3.953,P=0.002),两组分别提升了2.3倍及2.21倍,同时也显著高于对照组(分别P=0.006,P=0.019)；而p38MAPK蛋白水平的前后差异与组间差异则无统计学意义。以上结果提示中药可在体内促进p38MAPK的磷酸化激活。结论与展望：综合以上各部分结果,本研究的结论如下：1.单味黄芪及黄芪、党参、龟板组成的小复方中药口服能显著提升β地中海贫血患儿的总血红蛋白水平及HbF水平,并能一定程度上改善患儿的RBC、MCH、网织红细胞等血液学指标及中医四诊症状。2.本随机对照双盲的前瞻性临床研究表明,中间型患儿复方组及黄芪组的总有效率分别为63.6%及61.5%,重型患儿复方组及黄芪组的总有效率分别为42.9%及50.0%,均显著高于安慰剂对照组；中药对WBC、NEU、PLT及各项肝肾功能指标均无显著影响,提示黄芪及其复方中药治疗小儿β地贫是具有一定疗效且比较安全的。3.黄芪及其复方中药口服均可在体内诱导G平珠蛋白基因的表达,Gγ基因mRNA水平分别提升1.53倍及1.65倍,是中药提升患儿HbF水平以及总血红蛋白水平的重要机制。4.黄芪及其复方中药口服可以增强p地贫患儿体内p38MAPK的磷酸化,p-p38MAPK蛋白水平分别提升2.21倍及2.3倍,提示p38MAK信号通路的激活可能是中药在体内诱导γ珠蛋白基因表达的机制之一。本研究对于开拓p地贫的临床治疗新手段具有重要的意义。我国是地贫的高发区,目前各种治疗方法如输血、铁螯合治疗、干细胞移植、基因治疗等均有明显的缺点。而各种珠蛋白基因诱导的化学药物在疗效与安全性方面也不尽如人意。本研究及课题组系列研究表明,黄芪及其复方治疗小儿p地贫不仅具有良好疗效,也无细胞毒性、肝肾毒性及骨髓抑制的副作用,颗粒剂型服用也比较方便,患者耐受性及依从性均较佳。可以预期,黄芪及其复方中药在今后p地贫的临床治疗上具有良好的应用前景。中药大多存在多环节、多靶点的作用机制。本研究中药是否还有基因诱导或者改善贫血的其他机制,另外对地贫并发症如肝脾肿大、心衰、生长发育落后以及体内铁负荷水平的影响如何,还有其远期疗效、长期安全性、最佳疗程与用量等等,均需要今后更长期更多指标的研究来证实。本研究选用单味中药及小复方,有利于进一步研究与分离出有效成分,也有利于挖掘出传统中医治法理论的科学性。本研究及后续研究对于开发地贫新药以及研究人类血红蛋白的转换与诱导均有较强的科学价值,对我国南方各省等地贫高发区来讲具有重要的社会意义及广阔的应用前景。
严忠海[3]2008年在《DNA甲基化修饰与内源性miRNA对珠蛋白基因表达调控的研究》文中提出珠蛋白基因簇在个体发育中表现为依次表达,并具有高度的组织特异性和发育阶段特异性。珠蛋白基因的转录受染色质结构、编码基因与其旁侧序列甲基化程度、顺式调节元件及细胞内反式作用因子的调节控制。Locus control regiongs (LCRs,基因座控制区)在功能上被定义为一类发育中的哺乳动物红细胞α珠蛋白和β珠蛋白基因表达所必需的上游调控序列。LCR可提高与其相衔接的基因的表达并具有组织特异型和拷贝数依赖的功能元件,是最重要调节珠蛋白基因表达的一类顺式作用元件。有关珠蛋白基因组织特异性表达的各种研究和理论模型中,都暗示了珠蛋白表观遗传修饰在调控珠蛋白基因的特异性表达中的重要功能。由于缺乏合适的实验模型,以往有关组蛋白修饰与珠蛋白基因表达关心的研究大多在细胞系中进行,因而无法重现珠蛋白基因的组织特异性表达。本论文利用先前构建的由LCR的HS3-2元件和β-珠蛋白基因启动子驱动表达EGFP报告基因的小鼠模型,对DNA的差异性甲基化修饰和内源性的miRNA在珠蛋白基因的特异性表达中的作用进行了研究。首先我们运用定量RT-PCR的技术检测了报告基因在不同组织中的表达水平;在该模型小鼠呈现良好的组织特异性表达的基础上,应用DNA亚硫酸盐修饰的方法,测定了人LCR和β-珠蛋白启动子区域在转基因小鼠各组织中的甲基化水平差异,以揭示DNA的甲基化修饰在组织特异性表达中的作用。这部分工作获得的主要进展是:1.以人珠蛋白基因的LCR和启动子驱动表达EGFP的转基因小鼠在红系组织中高效表达人珠蛋白基因,是在活体水平研究珠蛋白基因表达调控的良好模型;2.运用亚硫酸盐测序的方法,对转基因小鼠不同组织中珠蛋白基因的LCR和启动子区的CpG的甲基化状态进行了检测和比较。结果证实,对应的CpG位点在6种红系组织和非红系组织中的甲基化程度和模式有显著差异。对于区域的甲基化程度,红系组织中较非红系组织中低,而这种较低的甲基化修饰与报告基因EGFP的活跃转录对应;3.运用定量RT-PCR技术,对三种DNA甲基化酶在转基因小鼠各组织内的表达进行了比较分析。结果显示,“起始性”(de novo)的Dnmt3a和Dnmt3b在红系组织和非红系组织中的表达模式有显著差异,而“维持性”(maintenance)的甲基化酶Dnmt1的表达则没有明显的红系特异性。这不仅是DNA甲基化修饰影响珠蛋白基因的表达的直接证据,也说明珠蛋白基因的甲基化修饰是Dnmt3a和Dnmt3b作用的结果;4珠蛋白基因的启动子甲基化存在偏爱性,有若干个甲基化化敏感位点。这些位点是一些转录因子的调节区域。表观遗传修饰可能是作用于转录因子和DNA的结合来调节珠蛋白基因的表达。为了探讨转基因小鼠报告基因EGFP组织特异性表达是否与内源性miRNA的功能相关,本研究对靶向作用于人珠蛋白基因的内源性的miRNA进行了初步研究。应用生物信息学和实验验证的方法,找到了针对珠蛋白基因3’UTR区的25个小鼠内源性miRNA,并对其中5个miRNA进行了较深入的分析。结果显示,miR-34c和miR-379与组织中EGFP mRNA及Dnmt3a和Dnmt3b转录本的水平密切相关。由于转基因小鼠各组织中EGFP的表达水平与该组织中的甲基化状态相关,因此推论组织特异性表达的转基因可能被内源性的miRNA所诱发,进而发生转录本的抑制和甲基化修饰,导致其表达水平呈现红系特异性的特征。
杜梅君[4]2006年在《转录因子NF-E2在β-珠蛋白基因簇表达调控中作用机制的研究》文中研究说明基因的成簇分布是真核基因在细胞核内分布的一种普遍形式。许多成簇分布的基因以转录后共调控的方式进行调控。基因簇是真核基因成簇分布的方式之一。基因簇的表达通常受共同的调控元件调控。如位点控制区(LCR)、激素应答元件(HRE)等。真核基因的表达是一个高度复杂的过程,是遗传调控和表观遗传调控综合作用的结果。真核基因的表达调控可以分为三个层次:DNA水平、染色质水平和核水平。DNA水平主要通过DNA与蛋白质以及蛋白质与蛋白质相互作用实现。DNA主要指结构基因以及调节基因转录的顺式作用元件,蛋白质主要指RNA聚合酶以及转录调节蛋白(反式作用因子)。其中远距离调控元件是重要的顺式作用元件,在高等真核生物中广泛存在,对于生物体的分化和发育具有重要的作用。β-珠蛋白基因簇是研究远距离调控元件对于基因簇调控作用机制的良好模型,小鼠β-珠蛋白基因簇包括四个结构基因(Ey,βH1,β-major,和β-minor),和上游的由一系列核酸酶Ⅰ高敏位点组成的远距离调控元件LCR。LCR对β-珠蛋白基因簇调控的作用机制长久以来一直是研究珠蛋白基因表达调控的热点。最近,新出现的两项技术RNA-TRAP(Tagging and Recovery of AssociatedProteins)和3C(Chromosome Conformation Capture,3C)对β-珠蛋白基因簇染色质空间构象的研究结果第一次直接证实了β-珠蛋白基因簇远距离增强元件LCR的成环(looping)作用机制。在此基础上Grosveld等提出了活性染色质中心(Active chromatin hub-ACH)的模型。LCR通过成环机制调控下游基因表达的作用方式被证实以后,成环过程的作用机制立即引起了研究者的极大兴趣。研究集中在顺式作用元件和反式作用因子在成环过程中的作用。GATA-1和EKLF是其中两个重要的参与珠蛋白基因激活的因子。EKLF(erythroidKruppel-like factor)结合在CACCC保守序列上,主要调控成年期珠蛋白基因的表达(Marini,Asunis et al.2004)。GATA-1广泛分布在整个珠蛋白基因簇LCR区的高敏位点和下游基因的启动子上,在红系分化和珠蛋白基因的表达调控中起重要作用(Im,Grass et al.2005)。在转录因子EKLF敲除的小鼠中,发现ACH结构的形成依赖于转录因子EKLF的结合。同时,在GATA-1缺失的细胞系GIE中对LCR与珠蛋白结构基因空间距离关系的研究也证实了GATA-1参与成环过程。NF-E2是另一个在红系分化和珠蛋白基因表达调控中起作用的关键因子。NF-E2由大亚基p45和小亚基p18组成,大亚基p45含有反式激活结构域,小亚基p18含有DNA结合结构域。在红系分化过程中,小亚基p18与大亚基p45结合形成NF-E2异源二聚体激活珠蛋白基因的表达。鼠NF-E2异源二聚体的结合位点主要在HS2的AP1/NF-E2序列上。在红系分化过程中,除了LCR区的高敏位点,在β-珠蛋白基因簇的β-maj,β-min的启动子区也有NF-E2的结合。同时,β-maj珠蛋白基因启动子区组蛋白的修饰及RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)从LCR向β-maj珠蛋白基因启动子的转移也与NF-E2在该区域的结合有密切关系。因此,阐明NF-E2在珠蛋白基因表达调控中的作用机理及其在Looping和ACH形成中的作用是一个亟待研究的重要课题。本研究的目的在于探讨NF-E2在珠蛋白基因表达调控中的作用机制。首先利用逆转录病毒介导的RNA干扰技术在鼠红白血病细胞MEL的亚型DS19细胞系中沉默NF-E2p18小亚基,建立一个NF-E2二聚体功能下降的细胞系。然后运用该细胞克降,研究NF-E2在成环过程中的作用,探讨该因子与RNA PolⅡ在珠蛋白基因簇上结合的关系。研究发现:当NF-E2p18亚基被沉默后,在β-珠蛋白基因簇的LCR高敏位点HS2,HS3及β-maj的启动子区NF-E2 p18,p45两个亚基的结合均明显下降,表明NF-E2异源二聚体的DNA结合活力下降,该下降直接引起β-珠蛋白基因表达的明显下调。此外,CHIP分析发现:RNA聚合酶Ⅱ在HS2,HS3及β-maj启动子区的结合下降,这表明RNA PolⅡ在β-珠蛋白基因簇上的结合是NF E2依赖的。运用3C技术,以HS2为引领引物,与含有Ey,βh1,β-maj,β-min基因片段的引物相匹配,对NF-E2在成环过程中的作用机制进行了探讨。结果表明:NF-E2p18的沉默引起β-maj,β-min珠蛋白基因表达下降的同时,表现为HS2与β-maj,β-min之间交联频率的下降,即:空间接近性下降。而HS2与不表达的基因Ey,βH1之间的交联频率无明显变化。Tolhuis等人认为:珠蛋白基因簇在不同的发育阶段,由不同的基因以成环的方式进入到ACH中开始表达,成年期主要为β-maj和β-min珠蛋白基因参与到ACH中,3C结果证实这两个位点与高敏位点HS2间的交联频率提高,而干扰NF-E2p18亚基后,这两个位点与HS2之间的交联频率下降,可见NF-E2可调节LCR中高敏位点与各个基因之间的接近性,上述结果提示:NF-E2是参与成环过程的转录因子之一。综合NF-E2在细胞核内不同区域的分布对B珠蛋白基因表达激活的影响,NF-E2在β珠蛋白基因簇LCR及结构基因启动子区结合状况及机制的研究,以及我们关于NF-E2参与成环过程的实验结果,我们提出:NF-E2参与珠蛋白基因表达调控的可能机理为:(1).在细胞分化以前,NF-E2p18小亚基与NF-E2p45大亚基分别位于不同的细胞核区域,在一定信号的刺激下,NF-E2 p18小亚基从异染色质区转移到常染色质区,与NF-E2p45大亚基结合,形成有激活功能的NF-E2异源二聚体。(2).NF-E2异源二聚体通过NF-E2/AP1位点结合在LCR区的高敏位点HS2上,同时通过蛋白质与蛋白质相互作用结合到LCR区的其它高敏位点及下游结构基因的启动子上。然后,NF-E2和其它蛋白质因子一起招募RNAPolⅡ,染色质重塑复合物及其它转录起始复合物,分别在LCR与下游基因的启动子上形成不同的蛋白质复合物。(3).转录因子及其它蛋白质复合物的结合引起β珠蛋白基因簇局部区域染色质结构的变化,从而导致成环结构的形成。在成环结构形成的过程中,RNA PolⅡ从LCR被转移到表达基因的启动子区,激活珠蛋白基因的表达。
宋崴[5]2007年在《SIRT1通过在α/β珠蛋白基因簇远端调控区（MRE/LCR）特异位点的募集改变组蛋白修饰状态调节珠蛋白基因表达》文中指出真核基因表达是一个复杂而精细的过程,是遗传调控和表观遗传调控综合作用的结果。作为基因表达调控的中心坏节,真核基因的转录调控可以分为三个层次:DNA水平、染色质水平和核水平。染色质水平作为调控真核基因表达的一种独特方式,日益受到人们重视。真核生物染色质的基本单位是核小体,它由146bp DNA和一个核心组蛋白八聚体组成。核心组蛋白的N-端可以发生乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等多种共价修饰。组蛋白修饰可以独自发挥作用,也可以相互组合形成“组蛋白密码”,共同调节基因表达,而组蛋白乙酰化可能在调节染色体结构和功能上起核心作用。组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶具有相反的活性,它们的作用共同维持着核小体组蛋白上赖氨酸乙酰化水平的动态平衡。目前发现至少有三组蛋白具有组蛋白去乙酰化酶活性。Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶不同于Ⅰ类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶,它们是酵母Sir2(silent information regulator 2)的同系物,是NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶,从细菌到人类都具有高度保守性。哺乳动物的SIRT1是Sirtuins家族中与Sir2同源性最高的一个成员,在许多生命过程,如细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤修复、重组、长寿和基因沉默中都发挥了重要的作用。最近的研究表明,SIRT1可以与多种的转录因子,如p53,FOXO家族和MyoD相互作用,调节特异基因表达,从而参与凋亡、分化和发育等重要的生命过程。珠蛋白基因簇是研究染色质结构和基因表达关系的经典模型,它分为α-和β-两个基因簇。人α-珠蛋白基因簇只有两组功能基因(ζ,α2-α1),在个体发育过程中只有一个基因开关。人β-珠蛋白基因簇有三组功能基因(ε,~Gγ-~Aγ,δ-β),在个体发育过程中存在两个基因开关。此外,由一系列高敏位点(HSs)组成的主调控区(majorregulatory elements,MRE)和基因座控制区(locus control region,LCR)作为最主要的远端调控元件,分别调控α-和β-两类珠蛋白基因的表达。本实验中,我们首先用SIRT1干扰和SIRT1HY质粒稳定转染K562细胞,筛选后得到稳定的单克隆细胞株。然后分别在SIRT1干扰及过表达SIRT1HY突变体的K562细胞中,用MTT技术检测细胞增殖的变化;联苯胺染色结合半定量RT-PCR分析血红蛋白生成和珠蛋白基因表达的改变。为了进一步阐述SIRT1调节珠蛋白基因表达的分子机制,我们通过ChIP实验检测了SIRT1在α-和β-珠蛋白基因簇上的募集,并通过ChIP实验分别检测了α-珠蛋白基因簇MRE区(HS40、HS33、HS10),ζ-和α2-,α1-珠蛋白基因启动子区,以及β-珠蛋白基因簇LCR区(HS1-5),ε-、γ-和β-珠蛋白基因启动子区的H3乙酰化、H4乙酰化与H3-K4双甲基化修饰的变化。最后,检测了SIRT1对参与调控珠蛋白基因表达的红系相关转录因子表达的影响,并检测SIRT1对GATA-1乙酰化修饰的影响,通过ChIP实验检测SIRT1对GATA-1和NF-E2/P45在β-珠蛋白基因簇上募集情况的影响。结果显示:(1)在K562细胞中干扰SIRT1表达后抑制细胞增殖。(2)在K562细胞中干扰SIRT1表达促进血红蛋白的生成并伴随着珠蛋白基因mRNA的上调,并且在hemin诱导后仍保持这种上调趋势。(3)在K562细胞中过表达SIRT1HY抑制细胞增殖。(4)在K562细胞中过表达SIRT1HY促进血红蛋白的生成并伴随着珠蛋白基因mRNA的上调,并且在hemin诱导后仍保持这种上调趋势。(5)ChIP实验可检测到SIRT1在α-珠蛋白基因簇MRE区HS40和HS10的募集,以及在β-珠蛋白基因簇LCR区HS4和HS2的募集。(6)在K562细胞中抑制SIRT1表达和过表达SIRT1HY后,α珠蛋白基因簇MRE上的高敏位点HS40和HS10的组蛋白H3和H4乙酰化修饰水平明显增加,ζ-、α2-和α1-珠蛋白基因启动子区的H3和H4乙酰化修饰水平没有明显变化;而H3-K4双甲基化修饰水平在MRE区HS40、HS33和HS10,以及ζ-和α2-珠蛋白基因启动子区均有一定的上调,α1-珠蛋白基因启动子区没有明显变化。(7)在K562细胞中抑制SIRT1表达和过表达SIRT1HY后,β-珠蛋白基因簇LCR上的高敏位点HS5、HS4和HS2的组蛋白H3和H4乙酰化修饰水平明显增加,ε-、γ-和β-珠蛋白基因启动子区的H3和H4乙酰化修饰水平也有增加;而H3-K4双甲基化修饰水平在LCR和ε-、γ-和β-珠蛋白基因启动子区均有一定的上调。(8)在K562细胞中抑制SIRT1表达和过表达SIRT1HY,均未在mRNA水平和蛋白水平影响主要的红系相关转录因子的表达、乙酰化修饰和在珠蛋白基因簇上的募集。结果表明:(1)在K562细胞中,SIRT1可以调节珠蛋白基因的表达。(2)SIRT1调节珠蛋白基因的表达是去乙酰化酶活性依赖的。(3)在α-珠蛋白基因簇MRE区的HS40和HS10,以及β-珠蛋白基因簇LCR区的HS4和HS2上均可检测到SIRT1的募集。(4)SIRT1影响α-和β-珠蛋白基因簇的组蛋白修饰水平。(5)SIRT1可能不影响主要的红系相关转录因子的表达、乙酰化修饰以及在珠蛋白基因簇上的募集。综合以上结果,SIRT1可能通过募集到α/β珠蛋白基因簇远端调控区(MRE/LCR)的特定高敏位点,影响组蛋白修饰状态,并最终调节珠蛋白基因表达。
张昕[6]2005年在《红系分化发育过程中珠蛋白基因表达开关进程的分析及相关调控因子基因探寻》文中研究说明在人类个体发育过程中存在ε(胚胎型)→γ(胎儿型)→β(成人型)珠蛋白基因表达开关过程。在成人骨髓造血干细胞向红系分化发育过程中也存在γ→β基因表达的“压缩性”开关过程。虽然对于珠蛋白基因表达调控及开关的研究已取得许多进展，但至今对于调节这些开关的决定性调节因子仍不明确。这些因子的确定对于揭示珠蛋白基因开关机制具有决定性意义，本课题的目的就是希望能向此目标迈进。 本研究首先利用密度梯度离心方法，从正常成人和异细胞型遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合症(HPFH)家系患者的骨髓组织(Bone Marrow)、健康足月正常分娩胎儿脐带血(Umbilical Cord Blood)中分离得到了含有造血干／祖细胞的单个核细胞(Mono-Nuclear Cell，MNC)，进行初步纯化及体外(in vitro)扩增后，组合使用Epo、IL-3、GM-CSF等细胞因子，将造血干／祖细胞向红系方向进行诱导培养。鉴于在以往报告中使用的红细胞体外培养方法往往由于添加胎牛血清及诸如c-kit配体、Tpo等促生长添加剂而使得成人外周血或骨髓来源的红细胞内胎儿型γ-珠蛋白基因的表达水平升高，不能真正模拟体内成人红系分化发育的过程，无法满足研究珠蛋白表达及开关调节的需要，我们针对成人骨髓来源的红细胞尝试使用了无血清培养方法，针对人脐带血来源的红细胞则使用了含脐带血清的培养方法，并且尽量去除其他影响珠蛋白表达的添加剂，希望能够找到并建立尽可能模拟生理情况的培养条件与方法，并以此为基础，为研究珠蛋白基因表达调控及开关机制提供适当的实验材料。 在向红系诱导过程中，我们在不同的时间点收集了红细胞培养物，提取总RNA，进行逆转录合成cDNA，通过实时荧光定量PCR(Real time PCR)技术详细检测了细胞分化成熟不同时间点的红细胞内α-类与β-类珠蛋白基因的表达水平。结果显示：在使用无血清培养基诱导培养的成人骨髓红细胞内，其α-、β-及γ-珠蛋白基因的表达水平及变化趋势同正常生理情况下的表达过程即所谓的“压缩性开关”非常相似，其中的β-珠蛋白基因的表达同γ-珠蛋白基因相比占明显优势，胚胎型ε-珠蛋白基因表达水平极低，而胚胎型ζ-珠蛋白基因的表达则未能检测到；在使用含人脐带血清的培养基诱导培养的脐带血红细胞内检测到了包括α-、β-、γ-、ε-及ζ-等在内的所有珠蛋白基因的表达，其中的β-珠蛋白基因表达变化趋势同无血清诱导培养的正常成人骨髓红系细胞相似，而与前者不同的是在整个成熟过程中γ-珠蛋白基因同β-珠蛋白基因的表达相比占
鞠君毅[7]2013年在《LYAR转录调控γ-globin基因表达及NATD调控Slug基因表达的表观遗传机制》文中指出血红蛋白是动物体内一类至关重要的蛋白质,主要负责体内氧气的运输。人体内的血红蛋白由四个亚基组成,分别是两个α-珠蛋白亚基和两个β-珠蛋白亚基。β3-珠蛋白基因的突变会导致β-地中海贫血症和镰刀状贫血症。患者体内血红蛋白结构的变化,导致其携氧能力急剧降低,严重危害身体健康甚至生命。因此,研究β-珠蛋白基因的表达调控机制对于这类贫血症的治疗有着重要的意义。其中通过提高γ-珠蛋白的表达,一定程度上取代β-珠蛋白的作用被认为是一种有效的治疗策略。临床上也证实使用提高γ-珠蛋白基因表达的相关药物可以有效缓解这些病人的症状。本论文的第一部分主要阐述了核蛋白LYAR在γ-珠蛋白基因的表达调控过程中的作用及其机理,从而为此类贫血病药物的研发提供理论依据。人胎儿期γ-珠蛋白基因的表达在胎儿出生后不久会发生转换,被成人的β-珠蛋白基因表达所取代。至今,珠蛋白表达转换的分子机制还不清楚。在先前的研究中我们发现了蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT5可以催化组蛋白H4R3位点发生对称性双甲基化从而导致γ-珠蛋白基因的沉默。在本课题研究中,我们发现了核蛋白LYAR与PRMT5之间存在相互作用,并且PRMT5与γ-珠蛋白启动子的结合依赖 LYAR 蛋白的存在。通过 CASTing(Cyclic Amplification and Selection of Targets)实验,我们确定了 LYAR的DNA特异结合序列为GGTTAT。而在γ-珠蛋白基因的5' UTR区域恰好存在该序列。EMSA和ChIP实验证实LYAR确实可以结合到γ-珠蛋白基因5' UTR对应区域的GGTTAT位点。在此基础上,我们在人红系细胞K562和人原代红系祖细胞中证实了 LYAR可以抑制γ-珠蛋白基因的表达。因此,LYAR作为一个新发现的转录因子,可以结合到γ-珠蛋白基因上并且参与了γ-珠蛋白基因表达的直接调控。基因表达除了受到传统的转录因子调控外,也受到表观遗传机制的调节。表观遗传是指在DNA序列不改变的情况下,基因的表达发生了可遗传的变化。近十几年来表观遗传学的迅速发展揭示了包括癌症在内的诸多疾病的分子发生机制,从而为这些疾病的治疗打下了良好的理论基础。癌症是当今社会对人类健康和生命威胁的重大疾病之一。而绝大部分癌症病人的死亡都是由于肿瘤细胞的转移扩散所导致的。癌细胞在人体内的转移是一个非常复杂的生理学过程,机制还不是很清楚。上皮向间充质转化过程(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在癌细胞的转移过程中扮演了重要的角色。因此,EMT过程的基因调控研究对于癌症的发生机制及临床治疗具有重大意义。在本论文的第二部分主要阐述了蛋白质N末端乙酰基转移酶NATD对EMT过程中的重要转录因子Slug调节的表观遗传机制。NATD是蛋白质N末端乙酰基转移酶家族成员之一,可以催化组蛋白H4发生N末端乙酰化。但是NATD在细胞内的生物学作用及功能研究并不多。在本论文研究中,我们发现NATD在肺癌病人的肿瘤组织中高水平表达。NATD下调后,H1299肺癌细胞的迁移能力显著降低;同时EMT过程相关的转录因子和标记分子(Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的显著变化表明 NATD 的下调抑制了 EMT过程。ChIP实验表明NATD的下调导致Slug启动子区域上的组蛋白标记发生了相关变化,抑制了 Slug的表达,从而影响了 EMT过程。总之,NATD可以催化组蛋白H4发生N末端乙酰化,通过激活Slug的表达促进EMT过程。该研究为今后肺癌的靶向治疗提供了潜在的新的策略。
左杨瑾[8]2016年在《β-珠蛋白基因簇潜在功能性rSNP的系统扫描：评价一个HBG1 5'UTR变异对β-地中海贫血的遗传修饰作用》文中认为背景与目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质,由两条α类珠蛋白链和两条β类珠蛋白链组成。人类p-珠蛋白基因簇长约70kb,依时在胚胎期表达ε-珠蛋白、在胎儿期表达~Gγ-及~Aγ-珠蛋白、在成人期表达δ-及p-珠蛋白。p-地中海贫血作为世界上最常见的常染色体隐性遗传病之一,是由于p-珠蛋白基因突变使受累个体β~-珠蛋白肽链严重不足或完全缺乏而引起。p-地中海贫血突变类型以点突变为主,导致中国南方人群β~-地中海贫血的点突变分布在p-珠蛋白基因开放阅读框及启动子区,不同突变根据其功能影响表现为β++突变(沉默型)、β+突变(轻型)或p0突变(重型)。由于在胎儿发育直至出生时,p-珠蛋白基因基本处于关闭状态,使得β~-地中海贫血基因突变对珠蛋白表达的抑制作用在出生时难以显现,重型β~-地中海贫血患儿在出生后HbF表达关闭时才会表现出严重贫血的临床症状。由于存在不同遗传修饰因素,相同致病基因型p-地中海贫血患者可呈现差异明显的临床表型,中国重型β~-地中海贫血纯合子或双重杂合子患者主要因下列2种能减少α/β链比例失衡程度的遗传修饰因素而减轻：合并能引起Hb F升高的p-地中海贫血修饰基因型,如δβ~-地中海贫血/~Aγδp-地中海贫血大片段缺失、γ-珠蛋白启动子突变导致的遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症以及BCL11A、MYB-HBS1L基因间区或KLFl等Hb F修饰基因的单核苷酸多态性或基因突变；或合并α-地中海贫血。Hb F的高表达对缓解重型p-地中海贫血症状至关重要,对γ-珠蛋白基因成人阶段重新激活的分子机制一直是研究热点。γ-珠蛋白基因5'UTR上游约300bp的启动子范围已被广泛研究,大约20个转录调节因子的结合位点被发现。许多产生遗传性持续性胎儿血红蛋白升高综合征的点突变发生在Y-珠蛋白基因启动子区,大多数在转录因子的结合位点内。这些点突变的发现,使基因多态性与Hb F表达的数量性状位点学说成为了阐述胎儿血红蛋白在成人阶段持续性增高机制的重要理论。此外通过全基因组关联分析、遗传家系和基因功能研究,某些γ-珠蛋白基因负调控转录因子被发现,如BCL11A、MYB、HBS1L、KLF1等,位于这些负调控因子中的单核苷酸变异或基因突变导致的Hb F增高从而缓解p-地中海贫血临床表型严重性的分子机制也逐渐被揭示。2014年,一种广谱转录因子LYAR被发现能与γ-珠蛋白基因5'UTR上的GGTTAT序列结合,同时,它能募集组蛋白甲基转移酶PRMT5及甲基转移酶DNMT3A,推动Y-珠蛋白基因沉默。本课题前期通过靶向捕获二代测序技术对1142例中重型β~-地中海贫血患者的β~-珠蛋白基因簇进行测序,鉴定了271个常见SNP,并对这些SNP的潜在地贫表型改善作用进行评估,发现~Aγ-珠蛋白基因上有一个突变率相当高的变异~Aγ+25(G>A,rs368698783)处于LYAR结合序列GGTTAT上并与~Gγ-158(C>T,XmnI多态性)几乎完全连锁。我们猜想~Aγ+25变异会使LYAR结合程度减弱而使其抑制γ-珠蛋白基因作用减弱而在红系压力下开放γ-珠蛋白基因表达。本课题将针对中国南方正常人群、p-地中海贫血基因携带者、β~-地中海贫血纯合子或双重杂合子患者及泰国东南部HbE纯合突变患者共2738例进行系统性的基因型-表型分析,并从mRNA表达方面对~Aγ+25变异的影响进行精细定位。设计与方法一、队列设计及表型分析(1) 队列设计本课题连续随机收集样本2738例,按照HBB基因型分为4个队列。1)队列A：中国南方人群,513例非地中海贫血样本(αα/αα, βN/βN);2)队列B：中国南方人群,512例p-地中海贫血携带者(αα/αα, βM/βN);3)队列C：中国南方人群,1142例中重型p-地中海贫血患者(未排除α-地贫,βM/βM)；4)队列D：泰国东南地区人群,568例HbE纯合突变样本(未排除α-地贫,βE/βE)。(2) 表型分析主要检测指标如下：血红蛋白含量,红细胞比容,平均红细胞体积,平均红细胞血红蛋白量,平均红细胞血红蛋白浓度,红细胞分布宽度,Hb F,Hb A2。并按照血红蛋白量、发病年龄、4岁前输血频率以及并发症对β~-地中海贫血患者进行临床分类：重型p-地中海贫血或中间型β~-地中海贫血。二、分子遗传检测(1)HBA及HBB基因型检测多重Gap-PCR检测中国人群3种常见缺失型α-地中海贫血；PCR结合RDB技术检测点突变型α-地中海贫血及β~-地中海贫血。(2) 靶向捕获二代测序对β~-珠蛋白基因簇的SNP分型使用Agilent SureDesign平台对β~-珠蛋白基因簇80kb的序列进行高密度探针设计并定制芯片,使用HiSeq 2000进行定制化芯片测序及生物信息学分析。(3)HBG启动子遗传变异检测限制性内切酶法鉴别~Gγ-158(rs7482144,XmnI)基因型；Sanger测序法鉴别-+25(rs368698783)基因型。(4) ~Gγ/~Aγ mRNA表达分析我们使用Bioedit软件对cDNA扩增的γ-珠蛋白转录本sanger测序峰图进行分析,得到~Gγ/~Aγ mRNA表达的比值,以~Gγ/~Aγ,表达量比值来反映~Gγ-158突变与~Aγ+25突变连锁及不连锁时带来的功能影响。三、统计分析使用Haploview软件对SNP进行连锁平衡分析；使用其Tagger模块进行标签SNP的选择及其连锁SNP的捕获。使用PLINK软件SNP进行Hb F关联分析及conditional分析以评估SNP对Hb F的调控作用。使用逐步回归的Cox比例风险模型以中重型β~-地中海贫血患者的无输血生存时间为评价标准对潜在β~-地中海贫血调节因素进行多因素分析。使用Mann-Whitney U检验(两组间)或Kruskal-Wallis检验(多组间)对队列A-D不同基因型的血液学指标及临床表现进行比较。使用卡方检验对样本性别等构成比资料进行比较。生存曲线使用Kaplan-Meier方法进行绘制,其统计学差异使用对数秩和检验进行。研究结果一、对β~-珠蛋白基因簇中表型调控SNP的系统扫描鉴定~Aγ+25变异我们使用目标序列靶向捕获二代测序对队列C中1142例中重型β~-地中海贫血患者的β~-珠蛋白基因簇进行测序,鉴定了β~-珠蛋白基因簇上MAF>0.01的271个常见SNP,以SNP之间连锁程度r2>0.8为标准将271个SNP捕获分布于162个LD区间中。我们对单个SNP进行Hb F关联分析(Association study)作为初步筛选,得到153个显著关联SNP(P<0.05)分布于53个LD中；以P值最显著的SNP作为每个LD的标签SNP (tag-SNP),纳入逐步回归的Cox比例风险模型,并同时纳入10个已知 β~-地贫疾病风险因子,模型得到7个LD包括66个SNP对患者无输血生存时间具有显著贡献度；我们在7个LD中共鉴定出了3个潜在功能性rSNP位于红系转录因子结合序列内(rs10768737-NFIC, rs368698783-LYAR及rs5010981-KLF10)。我们注意到rs368698783(G>A,~Aγ+25),位于γ-珠蛋白基因抑制因子LYAR的保守结合序列(GGTTAT)内,在上述分析中都显示了其对β~-地中海贫血表型及Hb F水平的强修饰效应,在与其几乎完全连锁的~Gγ-158变异的比较中也显示出更强的修饰效应(HR=0.570,P=2.178×10-12),并通过conditional分析鉴定了~Aγ+25变异能独立于其他2个潜在功能性rSNP调控Hb F水平,为其对β~-地中海贫血表型的独立修饰作用提供了依据。二、~Aγ+25变异在中国南方及泰国HbEE人群中具有广泛突变谱我们在2170例连续随机中国南方人群样本(队列A、B、C)中鉴定了388个突变的A等位基因(DAF=0.089),其中杂合突变338例,纯合突变25例。在568例泰国东南部地区HbEE患者(队列D)中,鉴定896个突变的A等位基因(DAF=0.789),其中杂合突变180例,纯合突变358例；鉴定~Aγ+25变异与HbE突变(HBB:c.79G>A)具有连锁不平衡关系(D’=0.715,R2=0.210)。三、~Aγ+25变异可调控Hb F的表达以减轻p-地中海贫血表型严重性我们对2738例人群样本的Hb F表达水平进行了检测,结果显示携带~Aγ+25突变等位基因的个体Hb F均有不同程度的Hb F升高,在红系压力存在的情况下,~Aγ+25变异带来的Hb F表达量上升更为显著。我们将队列C与队列D中的中重型p-地中海贫血与HbEE患者统一遗传背景后针对其血液学及临床表型进行单因素分析,排除了其他强修饰效应对β~-地中海贫血表型的改善作用,这种情况下,队列C中499例-+25野生型与81例突变等位基因携带样本相比,~Aγ+25突变使Hb F上升了1倍,发病年龄推迟了6个月,不依赖于系统性输血的病人增加了约17%,临床表型为中间型的地中海贫血患者比例增加了1半。队列D中,24例~Aγ+25野生型与362例突变等位基因携带样本相比,在Hb F本底值较高的情况下,~Aγ+25突变仍使Hb F上升了约1倍。四、~Aγ+25变异可影响~Gγ/~Aγ的相对表达量我们对队列A、B、C中59例随机样本进行了mRNA分析,对25例随机样本进行了肽链分析,鉴定了~Aγ+25的突变等位基因能导致~Gγ/~Aγ再转录与翻译水平的表达比值上升,且每种基因型间均产生显著差异,鉴定了2例~Gγ-158杂合突变~Aγ+25野生型样本-γ/~Aγ表达比值不改变,并鉴定了~Aγ+25变异在红系压力下可造成~Aγ-珠蛋白基因偏向于突变等位基因表达。主要结论1.我们通过p-珠蛋白基因簇的271个常见SNP对β~-地中海贫血表型修饰作用的评估,鉴定了位于~Aγ-珠蛋白基因(HBG1) 5'UTR上的+25位变异(rs368698783)作为β~-地中海贫血表型遗传性修饰基因,可代表与其高度连锁的单核苷酸变异区间独立或主要作用于调节Hb F表达水平与改善β~-地中海贫血严重性,且在红系压力的作用下更为有效。2.我们在两大人群中验证了~Aγ+25变异对β~-地中海贫血表型的改善作用,~Aγ+25突变在中国南方人群中具有广泛的突变谱,其纯合突变能极大概率地提升重型p-地中海贫血患者的生存质量；泰国HbEE患者与~Aγ+25突变存在着连锁不平衡效应,约80%患者携带~Aγ+25变异,对减轻患者表型起了极大的作用。3. 我们鉴定了~Aγ+25变异对~Gγ/AY相对表达量的影响,并伴有等位基因表达偏移的现象,为~Aγ+25变异带来的潜在功能性改变提供了一定的依据。
马艳妮[9]2008年在《ε-及γ-珠蛋白基因活化相关因子的鉴别和功能机制研究》文中进行了进一步梳理人出生前后发生造血位点由胎肝向成人骨髓的转移,并同时发生胎儿血红蛋白(HbF,α2γ2)向成人血红蛋白(HbA,α2β2)的表达转换(或开关)。研究表明,如果在成人期已经关闭的γ-珠蛋白基因能够重新活化,表达的γ-珠蛋白能够代偿镰刀形细胞贫血症(SCD)及β-地中海贫血患者中β-珠蛋白的不足,改善贫血症状,达到有效的治疗效果。本课题的目的就是希望寻找和确定能够特异活化γ-珠蛋白基因的因子或相关因子,为治疗镰刀形细胞贫血症和重型β-地中海贫血症提供新方法奠定基础。我们首先分析了人脐带血、正常成人骨髓和异细胞型胎儿血红蛋白持续存在综合症(HPFH)患者骨髓来源的红系细胞培养物中的基因表达情况,检测到了大量差异表达的基因,并通过实时定量PCR的方法验证了部分基因差异表达的真实性。我们共获得了1271条差异表达序列标签(ESTs),对其中的200多条进行了克隆和测序。序列比较发现这些基因包括信号转导分子、转录翻译相关因子、代谢相关的酶类、癌症或其他疾病相关因子、看家基因等,涉及到转录及翻译水平的基因表达调控、信号传导、细胞代谢、细胞分裂与凋亡及细胞分化等各种生命活动过程。这些资料为γ-珠蛋白活化因子以及珠蛋白开关的研究提供了有意义的线索。进而我们对于一个在脐带血中表达高于正常成人骨髓中的基因-CTDSPL2基因进行了深入研究。该基因编码一个小分子CTD磷酸酶类似物,在脐带血中的表达为正常成人骨髓中的2.5倍,在K562细胞hemin诱导向红系分化以及CD34+造血干/祖细胞EPO诱导向红系分化过程中表达均明显上调。这些均提示其可能参与γ-珠蛋白基因的表达增加。CTDSPL2-GFP融合蛋白细胞定位显示其主要集中于细胞核,提示其可能在细胞核中参与基因的转录调控。我们实验了CTDSPL2基因在K562细胞中对于珠蛋白基因表达的调控作用。通过G418筛选获得了6株CTDSPL2过表达的稳定K562细胞株。联苯胺染色检测了这些细胞在红系分化过程中的血红蛋白水平,说明CTDSPL2的过表达非常明显地促进了K562细胞中的血红蛋白水平。进一步实时定量PCR和RNase保护实验检测了过表达细胞在红系分化前后各个珠蛋白(包括α-、ξ-、ε-、γ-、β-珠蛋白)mRNA的表达变化,结果显示CTDSPL2的过表达对ε-及γ-珠蛋白基因的表达具有明显的促进作用,对α-、ξ-及β-珠蛋白基因作用微弱,在hemin诱导K562细胞向红系分化后对于各珠蛋白基因的作用与分化前基本一致。同时,我们确定了CTDSPL2有效的RNAi靶点,通过慢病毒介导的基因转移获得了稳定的CTDSPL2表达抑制K562细胞株。通过联苯胺染色和实时定量PCR方法检测了稳定细胞株中的血红蛋白以及各珠蛋白mRNA的表达变化情况,结果显示CTDSPL2的表达抑制降低了K562细胞中各个珠蛋白尤其是ε-珠蛋白基因的表达,但不能抑制hemin诱导的红系分化过程中各珠蛋白基因的表达上调。这些结果均说明CTDSPL2基因在K562细胞中确实具有促进ε-及γ-珠蛋白基因表达的功能,对ε-珠蛋白基因的促进作用更为明显。在确定了CTDSPL2基因在K562细胞中对于ε-及γ-.珠蛋白基因表达的促进作用后,我们进一步实验了该基因在造血干/祖细胞红系分化过程中对于珠蛋白表达的调控作用。通过体外构建载体、293T细胞包装,我们获得了较高滴度的CTDSPL2过表达以及表达抑制慢病毒颗粒,并从脐带血中分离纯化CD34+造血干/祖细胞,通过慢病毒颗粒感染CD34+造血干/祖细胞分别实现了CTDSPL2基因在脐带血来源的造血干/祖细胞中的稳定过表达和表达抑制。利用实时定量PCR方法检测了CD34+细胞在EPO诱导的红系分化前后各珠蛋白基因的表达情况,结果显示CTDSPL2在CD34+细胞中的过表达可以促进各个珠蛋白的表达上调,并更为明显地促进ε-和ξ-珠蛋白基因的表达,而在EPO诱导CD34+细胞红系分化后则显示出对ε-珠蛋白基因更为强烈的促进作用。且CTDSPL2基因在CD34+细胞中的表达抑制也部分降低了各珠蛋白基因的表达量,对ε-珠蛋白基因的抑制作用最为明显。这些结果充分说明CTDSPL2基因在脐带血来源的造血干/祖细胞红系分化过程中具有促进ε-珠蛋白基因表达的作用,这与在K562细胞中的结果基本一致。通过以上研究,基本确定了CTDSPL2基因在K562细胞以及脐带血来源的造血干/祖细胞中对于ε-及γ-珠蛋白基因的活化作用。我们进一步对其调节ε-及γ-珠蛋白基因表达的机制进行了初步研究。检测了K562细胞红系分化过程中ERK磷酸化水平的变化,发现在CTDSPL2过表达的K562细胞中ERK磷酸化水平均比对照细胞要高,但在U0126(一种ERK磷酸化抑制剂)抑制了细胞中的ERK磷酸化水平后,该基因对于珠蛋白的促进作用仍然存在,初步说明该基因促进ε-及γ-珠蛋白基因表达涉及ERK磷酸化水平的升高但不依赖于ERK的磷酸化。用实时定量PCR以及Western blot方法检测了过表达稳定细胞株中9种与珠蛋白基因调节相关的转录因子的表达,结果显示该基因在一定程度上可能通过促进FKLF、GATAl、NF-E4等转录因子的表达来促进ε-及γ-珠蛋白基因表达。我们还通过免疫共沉淀的方法分离了可能与CTDSPL2相互作用的蛋白,并进行了质谱鉴定分析,获得了CTDSPL2可能相互作用蛋白的初步线索。我们的结果鉴别和初步确定了CTDSPL2是一个新的能够活化ε-及γ-珠蛋白基因的蛋白因子,并初步实验了这一因子的作用机制。这些为珠蛋白基因表达调控及开关机制的揭示奠定了一定基础,为通过活化ε-或γ-珠蛋白治疗镰刀形细胞贫血症和重型β-地中海贫血症提供了新的候选基因和初步的实验依据。
辛立[10]2004年在《远距离调控元件对α珠蛋白基因簇调控作用机制的研究》文中研究说明远距离调控元件在高等真核生物中广泛存在，对于生物体的分化和发育具有重要的作用。它们主要包括：增强子、基因座位控制区(Lous control region，LCR)、泛控制区(Global control region，GCR)和隔离子／边界元件(Insulator／Boundary elements)。其中增强子、基因座位控制区和泛控制区位于距启动子数百bp至数百数千kb范围内对靶基因发挥转录增强作用。 远距离调控元件对于基因簇调控的作用机制一直是分子生物学转录调控领域的重要的基本问题之一。多年来一直有两种理论模型：接触模型(Cont act Mode 1)和非接触模型(Non-contact Mode 1)。接触模型中的一个基本模型是成环模型(Looping Model)。它认为：远距离增强元件上结合的反式因子通过形成环状结构克服漫长的空间间隔直接与靶基因的启动子发生接触形成复合物。非接触模型主要是链接模型(Linkage Model)，它认为：LCR并不直接与各基因的启动子相互作用，仅指导转录因子和增强子辅助因子(Enhancer facilitator)等蛋白因子沿基因座顺序的、发育阶段特异的与之结合形成染色质元件的阵列从而确定将要转录的结构域。 在远距离增强元件作用机制的研究中，两类珠蛋白基因簇是一种理想的模型。小鼠α-和β-珠蛋白基因簇分别位于第11和7号染色体上(图7)。它们与人珠蛋白基因在结构与功能上都高度同源。小鼠α-珠蛋白基因簇包括三个结构基因(ζ，α1，和α2)，其表达受到主要调节元件-αMRE的控制。αMRE由一系列远端红系特异的核酸酶Ⅰ高敏位点组成。小鼠β-珠蛋白基因簇包括四个结构基因(εy，βH1，β-major，和β-minor)，其表达受到基因座位控制区LCR的调节。LCR
参考文献：
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[9]. ε-及γ-珠蛋白基因活化相关因子的鉴别和功能机制研究[D]. 马艳妮. 中国协和医科大学. 2008
[10]. 远距离调控元件对α珠蛋白基因簇调控作用机制的研究[D]. 辛立. 中国协和医科大学. 2004
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