陈祝明 孔俊超 楚佳奇 宗治贤 范旋燕 吕贵何 李华杰 赵名艳（通讯作者）
广东医科大学附属医院 广东湛江 524001
摘要：目的 研究不同浓度JS-K对人骨肉瘤MG63细胞增殖与凋亡的影响。方法 MTS法检测JS-K对MG63细胞抑制率。倒置显微镜及细胞免疫荧光观察细胞形态变化。流式细胞术检测JS-K对MG63细胞凋亡和周期的影响。Western-blot检测PARP、Bcl-2和Bax表达水平。结果 与对照组比较，JS-K处理MG63细胞的抑制率呈浓度依赖性增加（P<0.05）；MG63细胞S期和G2/M期细胞比例以及细胞凋亡率呈浓度依赖性逐渐增加（P<0.05）；WB结果显示Bax表达上调，Bcl-2表达下调，且JS-K在20 μmol/L时出现PARP裂解条带。结论 JS-K可能通过上调Bax表达、下调Bcl-2表达，及阻滞细胞周期进展，促进凋亡。
关键词：MG63细胞；JS-K；凋亡；Bcl-2；Bax
骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨长骨肿瘤，男性和女性的患病率为1：1.4，五年生存率约20%，年发病率是2-3/100万，具有较高的致残率和致死率[1，2]。自推出有效化疗药物以来，这些患者的预后改善显著，且5年生存率相对过去40年来提高了66%-82％，故目前对于骨肉瘤的治疗是以化疗药物为主的综合治疗方式[1]。然而随着治疗周期的延长及耐药情况的出现，极大影响了化疗效果，成为OS治疗过程中的难题。因此寻求一种新型的抗OS的化疗药物成为近几年国内外研究的热点。
一氧化氮（NO）是重要的信号传导分子，参与各种生理和病理过程，且一些NO供体药物可诱导多种类型的癌细胞凋亡[3]。JS-K {O2-（2，4-dinitrophenyl）-1-[（4-ethoxycarbonyl）piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1，2-diolate}，是一种新型的二醇二氮烯翁类NO供体药物。随着对JS-K研究深入，发现JS-K对人多种癌细胞如急性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、恶性胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞等具有选择性表现出抗肿瘤活性及逆转耐药性，而对正常的组织表现出良好的耐受性[4-6]。然而，JS-K能否抑制骨肉瘤细胞生长，且JS-K对骨肉瘤影响及相关机制国内外尚未报道。因此，本实验以人骨肉瘤MG63细胞为体外模型，探讨JS-K对MG63细胞诱导凋亡的作用及潜在机制，为后续应用该药治疗OS提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂与仪器 人骨肉瘤细胞株MG63购于中国科学院上海细胞库，胎牛血清、胰蛋白酶、100×青/链霉素和高糖DMEM培养基（Gbico，美国），JS-K（Santa Cruz，美国），MTS（Promega，美国），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（BD，美国），细胞周期检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，中国），Texas Red™-X Phalloidin试剂（Life Technologies，美国），PRO-PREP Protein Extraction Solution（iNtRON Biotechnology，韩国），一抗稀释液、二抗稀释液（上海碧云天生物技术有限公司，中国），PVDF膜（Millipore，美国）、发光液（Thermo scientific，美国），兔抗PARP、Bax、Bcl-2和鼠抗α-Tubulin单克隆抗体（Cell Signaling Technology，美国），二抗羊抗兔及羊抗鼠（Santa Cruz，美国），BD FACSCanto II流式细胞仪（BD，美国），BX51免疫荧光显微镜（OLYMPUS，日本）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将培养于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素H-DMEM培养基中的MG63细胞接种于10 cm2培养皿，置于37°C、5% CO2环境下培养，每3天换液一次，待细胞融合度达到80%~90%后用含0.25%-EDTA的胰蛋白酶消化、传代备用。
1.2.2 细胞形态学观察 取对数生长期MG63细胞接种于培养皿中，待细胞融合达80%后，用不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）处理细胞24 h后，光学显微镜观察细胞形态学变化。
1.2.3 MTS检测JS-K对人骨肉瘤细胞MG63增殖的影响 取对数生长期的MG63细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，更换含不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，分别处理12、24、48、72 h后，参照MTS试剂盒说明处理细胞，酶标仪测定各孔吸光值（492 nm），每一浓度设置5个复孔。计算细胞增殖抑制率，抑制率（IR）=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值，统计并分析。
1.2.4 流式细胞术PI染色检测细胞周期 取对数生长期的MG63细胞接种于96孔板中，培养24 h后，用不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）处理MG63细胞24 h，消化重悬后，加入75%乙醇，4℃固定过夜。离心收集细胞，用预冷PBS洗涤后离心，200 μL PBS重悬细胞，加入20 μL RNase A Solution，37°C水浴孵育30 min，400目筛网过滤后加入400 μL PI 染色液，轻轻混匀后4°C避光孵育30 min，流式细胞仪检测。
1.2.5 AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡 取对数生长期的MG63细胞接种于96孔板中，培养细胞贴壁后，用不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）处理MG63细胞24 h后，收集各组细胞上清液，贴壁细胞用胰酶消化后，室温2000 rpm离心10 min，用预冷PBS漂洗一次。Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×106 个/mL，取100 µL细胞悬液转移至流式管中，各加入FITC-Annexin V和PI溶液，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测。
1.2.6 细胞免疫荧光染色 将MG63细胞接种于预置盖玻片的12孔板中制作细胞爬片（7.0×104个/孔），待细胞完全贴壁后，用不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）处理MG63细胞24 h后收集爬片，固定后用0.1% Triton X-100/PBS摇床透化10 min，滴加X-phalloidin覆盖爬片，避光孵育30 min。DAPI复染细胞核并封片，倒置荧光显微镜采集图像。
1.2.7 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白表达 取对数生长期的MG63细胞接种于培养皿中，细胞贴壁后，用不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）处理MG63细胞24 h后，收集贴壁和悬浮细胞，Proprep蛋白裂解液提取细胞蛋白，进行SDS-PAG凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭液孵育2 h，一抗孵育过夜，二抗室温孵育2 h。曝光后扫描保存图像，利用image J软件分析蛋白条带灰度值，统计分析。
1.2.8 统计学处理 采用Graphpad Prism 7.0软件进行数据分析，原始数据采用均值±标准差（x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及Dunnett检验，当P < 0.05时差异有统计学意义。
2 结果
2.1 JS-K对MG63的形态学变化
不同浓度JS-K（0、5、10、20 μmol/L）处理MG63细胞24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。由图1可见，与0 μmol/L组比较，实验组细胞形态出现皱缩，部分细胞变圆，体积缩小、成团、漂浮，折光性增强，贴壁细胞间隙变大，且随JS-K剂量增加，变化越明显。
3讨论
OS是一种罕见的高度异质性骨癌，且侵袭力强、预后差等特点[7]。目前，临床上治疗OS的方式主要以化疗为主和其他综合治疗为辅。在OS化疗过程中使用的化疗药物大多具有一定毒副作用，并且化疗周期较长，容易导致细胞耐药性增加，使疾病治愈率降低[2，7]。因此，研究具有高效且低毒的药物是治疗OS的有效途径之一。近年来，有研究证实JS-K作为一种新型的NO供体药物，可抑制多种肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡，但对于骨肉瘤的研究国内外尚未有报道。由于各系统肿瘤组织学来源的差异，JS-K发挥抗肿瘤的机制及其其中涉及的信号通路的传导途径也不尽相同。本实验中我们结果表明JS-K对人骨肉瘤细胞株MG63增殖和凋亡有明显的影响作用。
细胞周期中的每一时相顺利转变是细胞进行有丝分裂的关键。有相关研究报道，JS-K剂量依赖性通过细胞G2/M期阻滞抑制HepG2、Jurkat细胞的增殖活性[8，9]。本研究中我们发现随JS-K浓度升高，MG63细胞G2/M期和S期细胞比例明显增加，并且细胞凋亡率呈递增趋势，表明JS-K可通过阻滞MG63细胞S期和G2/M期进展来抑制细胞增殖。细胞凋亡是由基因控制的细胞有序、自主性死亡，主要表现在细胞染色质凝集并边缘化、细胞固缩、凋亡小体产生等[10]{Liu, 2017 #18;Wu, 2016 #7}。我们通过细胞免疫荧光染色发现JS-K可导致MG63细胞核、胞质发生团块样碎裂、固缩，染色质皱缩发亮，提示JS-K可诱导MG63细胞凋亡，且呈浓度依赖性变化。
细胞凋亡是细胞发育的重要调控机制，主要通过外在和内在的细胞凋亡两条途径进行。第一种途径是内源性或线粒体途径，主要通过促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的Bcl-2家族介导[11]；第二种途径是通过FAS死亡受体介导的外在细胞凋亡途径或细胞质途径[9，12]。在调控凋亡基因中，Bcl-2家族主要以发起内在细胞凋亡的靶向抗凋亡，与凋亡发生、发展最为密切[13]。有研究表明JS-K通过Bcl-2家族蛋白调控诱导肝癌细胞HepG2、人前列腺细胞癌LNCaP细胞凋亡[13，14]。舒洋等[15]通过研究白藜芦醇能下调Bcl-2蛋白的表达，使Bax蛋白激活表达，进而导致骨肿瘤MG63细胞的抑制和凋亡。本研究中我们通过蛋白质印迹法证实JS-K可通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达促进MG63细胞凋亡，这些结果进一步支持了JS-K通过Bcl-2家族蛋白调控诱导细胞凋亡。
综上所述，本研究在细胞层面证实了JS-K对人骨肉瘤细胞MG63增殖具有明显的抑制作用，同时JS-K通过切割的PARP蛋白，以及调控MG63细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的平衡来阻滞细胞周期进展，导致细胞凋亡。此实验结果将为JS-K在抗骨肉瘤的临床应用提供新的理论基础。而JS-K在临床上有望作为安全有效的治疗OS疾病的抗癌药物。
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通讯作者简介：赵名艳（1985－），博士，干细胞研发与临床转化中心，硕士研究生导师。
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：31600772）；广东省自然科学基金（编号：2017A030313176）；广东省医学科研基金项目（编号：A2016180）；广东医科大学附属医院博士启动（编号：BJ201501）；广 东医科大学大学生创新实验项目立项资金（编号：2017FZZY001）
论文作者:陈祝明,孔俊超,楚佳奇,宗治贤,范旋燕,吕贵何,
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年6月18期
论文发表时间:2018/8/23
标签：细胞论文; 凋亡论文; 浓度论文; 蛋白论文; 美国论文; 骨肉瘤论文; 对人论文; 《中国误诊学杂志》2018年6月18期论文;