【摘要】目的：探讨原发性肝癌中Prox1蛋白的表达。方法：选择2016年3月至2017年6月苏州大学附属第一人民医院普外科手术切除的肝癌组织及癌旁正常组织标本54例，术前均未行放化疗，术后经病理标本明确诊断。收集13例同时期因其他肝脏疾病接受肝脏手术的患者标本作为正常对照组。采用免疫组织化学方法检测肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中Prox1的表达。结果：1）Prox1蛋白在肝癌组织与癌旁组织中表达低于正常肝组织（P＜0.05），肝癌组织与癌旁组织，肝癌组织与正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。2）Proxl蛋白表达与肝癌组织分化程度(r=0.930，P<0.01)呈正相关。结论：肝癌组织中Prox1表达低于正常肝组织，同时Prox1表达与肿瘤分化程度有关，分化程度越高，表达越高。可能与原发性肝癌的发生、发展有关，但其是否为原发性肝癌抑癌基因仍需进一步研究。
关键词：Prox1蛋白，原发性肝癌，免疫组织化学法
肝细胞肝癌（HCC）是世界常见恶性肿瘤，其发病机制以及病因是目前医学界研究的一个热点，特别是HCC增殖分化的调控机理，是众多学者关注的焦点。Prox1为果蝇的同源异型盒基因prospero在哺乳动物中的同源框基因转录因子，是哺乳动物前肠内胚层肝脏形成过程中早期表达的特殊标记物。研究表明，Prox-1基因在肝胚细胞及成熟肝细胞中有表达，但其具体功能尚未完全了解。研究Prox-1与原发性肝癌的关系，可为有效阻断原发性肝癌的发生发展提供潜在的治疗靶点，同时也将为原发性肝癌的靶向性治疗提供新的思路。
本实验通过免疫组织化学法检测Prox1蛋白在肝癌中的表达情况，旨在探讨Prox1蛋白表达与肝癌的关系。
材料与方法
一、一般资料
收集2016年3月至2017年6月苏州大学附属第一人民医院普外科手术切除的54例肝癌组织及癌旁组织标本，所选患者术前均未行放化疗治疗，术后经病理标本明确诊断。收集13例同时期因其他肝脏疾病接受肝脏手术的患者标本作为正常对照组。
二、实验方法
1.标本的采集、处理和保存
在无菌条件下快速采集手术中切除的无电凝损伤的新鲜肿瘤标本，于10%的福尔马林中保存，石蜡包埋，制成切片。
2. 免疫组织化学步骤（SP法，DAB显色）
脱蜡与水化→抗原修复→免疫组织化学染色→显色
免疫组织化学Prox1阳性结果判断标准
在免疫组织化学中Prox1免疫反应阳性物质分别位于细胞浆或胞膜、胞核，DAB显色呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。按染色强度及阳性细胞率来计算评分。染色强度：阴性为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分。阳性细胞率：无阳性细胞为0分，阳性细胞率<25％为1分，25％～50％为2分，>50％为3分。染色强度及阳性细胞率得分之和为最后得分，3—6分为免疫组化染色阳性，<3分为染色阴性。
3. 统计学分析
所有资料输入Microsoft excel 2010中建立数据库，采用SPSS13.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差（?x±S）表示， 两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用One-Way ANOVA ，采用Spearman等级相关分析法进行相关分析。P＜0.05即有统计学意义。检验水准a=0.05。
结 果
一、Prox1在肝癌组织、癌旁组织以及正常肝组织中的表达结果
表1 Prox1在肝癌组织、癌旁组织以及正常肝组织中免疫组化表达半定量评分结果
Prox1表达量在不同分化程度(F=86.13，P<0.01)肝癌组织中的差异均有统计学意义。相关性分析表明，随着肝癌组织的分化程度增高，Proxl蛋白的表达相对量升高，即Proxl蛋白表达与肝癌组织分化程度(r=0.930，P<0.01)呈正相关。
讨 论
Proxl可以表达于多种组织的非内皮细胞，肝脏，成人正常和肿瘤组织内的淋巴管[1] 。Papoutsi等[2]研究发现Prox-1基因是一个多功能基因调节因子，对肝脏形态和功能发育有明显影响，Prox-1基因缺失的小鼠肝脏发育严重不良。但目前仍不清楚Prox1在肝脏细胞以及肝癌组织中的具体功能以及调节机制。
本实验中我们发现Prox1蛋白在肝癌组织以及癌旁组织中的表达明显低于正常组织，与杨春红等[3]研究类同，但他们研究发现肝癌组织中的Prox-1 mRNA表达量明显低于癌旁组织(P<0.05)。本实验未得出此结论，这可能与留取的标本癌组织与癌旁组织界定有关。同时我们还发现Prox1蛋白的表达与肿瘤分化程度有关，分化程度越高，表达就越高。这与Shimoda等[1]的研究结果相似，其研究表明Prox-1基因的表达与肝细胞癌（HCC）的分化程度及预后相关，高分化细胞系的Proxl mRNA表达水平比低分化的高，同时证实了经RNA干扰方法降低Prox-1基因表达可明显加速培养的肿瘤细胞的增长速度，而Prox-1基因过度表达可明显抑制其生长。由此可以推测Prox1的缺失可能导致肝脏肿瘤由良性向恶性进展。Proxl mRNA差异表达部分受MAZ(癌相关锌指蛋白)调控，并且其突变可能导致HCC发生[4]。Proxl的基因缺失以及超甲基化可能使胆道系统发生肿瘤[5]。Nagai等[6]发现，血液系统恶性肿瘤中由于Prox-1基因沉默或基因突变导致Prox-1基因表达下调，可能与Prox-1基因的启动子甲基化有关，同时提出Prox-1基因可能是血液系统恶性肿瘤的抑癌基因。此观点较为支持本研究结果，但Proxl基因是否为原发性肝癌的抑癌基因还需进一步研究证实。
参考文献
[1]Shimoda M, Takahashi M, Yoshimoto T, Kono T, Ikai I, Kubo H. A homeobox protein, prox1, is involved in the differentiation, proliferation, and prognosis in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2006. 12(20 Pt 1): 6005-11.
[2]Papoutsi M, Dudas J, Becker J, et al. Gene regulation by homeobox transcription factor Prox1 in murine hepatoblasts. Cell Tissue Res. 2007. 330(2): 209-20.
[3]杨红春, 马海, 王宇, 陈运龙, 李永. Prox1基因在原发性肝细胞癌中的表达及其与病理学分级及临床分期的相关性研究. 中国普外基础与临床杂志. 2011. 18(7): 737-740.
[4]Achen MG, McColl BK, Stacker SA. Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis. Cancer Cell. 2005. 7(2): 121-7.
[5]Laerm A, Helmbold P, Goldberg M, et al. Prospero-related homeobox 1 (PROX1) is frequently inactivated by genomic deletions and epigenetic silencing in carcinomas of the bilary system. J Hepatol, 2007,46(1):89-97.
[6]Nagai H, Li Y, Hatano S, et al. Mutations and aberrant DNA methylation of the PROX1 gene in hematologic malignancies. Genes Chromosomes Cancer, 2003,38(1):13-21.
论文作者:任雷 赵卫峰
论文发表刊物:《医师在线》2018年2月上第3期
论文发表时间:2018/5/2
标签：肝癌论文; 组织论文; 基因论文; 阳性论文; 原发性论文; 肝脏论文; 蛋白论文; 《医师在线》2018年2月上第3期论文;