（桂林市妇女儿童医院，桂林，广西，541001）
引起手足口病（Humen Foot Mouth Disease ，简称HFMD）的肠道病毒有20多种，其中以肠道病毒EV71和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最常见，尤其是EV71病毒引起重症HMFD概率较高，李小青[1] 等报道重症HFMD中EV71检出率高达90%，因此，早期、快速、准确地检出HFMD病原学，对正确诊治HFMD及其并发症发生有积极意义。传统的实验室检查一般采用病毒分离培养和血清学方法来确诊HFMB病原体，耗时长，需要4-15d，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）是一种快速高效的扩增技术，具有操作方便、特异性强和灵敏度高等优点。本组研究对桂林市妇女儿童医院儿科门诊和住院的诊断为HFMD的患儿756例进行检测，以评估该检测方法在临床的应用价值[2]
1资料与方法
1.2临床资料 2017年11月-2019年5月本院儿科门诊和住院部诊断为HMFD的患儿756例，其中重症HMFD28例，全部病例符合卫生部颁布的《手足口病诊疗指南（2010年版）》的诊断标准[3]，其中男462例，女294例；年龄6月-1岁264例，1-3岁363例，3-6岁112例，6-12岁17例。28例重症HMFD中，6月-1岁3 例，1-3岁23 例，3-6岁2例。征得家长同意，分别采集入选患儿咽拭子标本249份，粪便标本507份。
1.1方法
1.2.1标本采集 咽拭子采集标准：用消毒棉棒适度用拭抹咽喉壁和两侧扁桃体部位，避免触及舌部，将拭子头放入无菌螺口塑料中，旋紧管盖并密封。粪便标本采集标准：用棉签选取含有粘液、脓血等病变成分的粪便，外观无异常的粪便须从表面、深处及粪端多处取材，其量至少为大拇指末端大小（约5g）。标本可立即检测或2-8ºC保存，24小时内完成检测。
1.2.2 仪器与试剂 PCR核酸扩增检测仪采用上海宏石的SLAN-96型扩增仪，试剂盒由艾康生物技术（杭州）有限公司提供，分别是肠道EV病毒RNA检测试剂盒和柯萨奇A16病毒RNA检测试剂盒。
1.2.3 检测原理 试剂盒选用肠道病毒71型（EV71）/柯萨奇A16病毒(CA16)保守基因片段设计特异引物及特异探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生转异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对肠道病毒71型（EV71）/柯萨奇A16病毒(CA16)核酸的自动化检测。
1.2.4 结果判读方法 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴对照的最高点。阳性对照Ct值小于38，阴性对照Ct无数值；在阈值以上的荧光曲线当是具有明
显的S型曲线，否则该次实验视为无效。检测样本Ct值≤38.0者判为阳性；检
测样本Ct值>38.0的样本建议重做。重做结果Ct值<40者为阳性，否则为阴性。1.3统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，组间比较采用Pearsonх2 检验，P＜0.05判定为差异有统计学意义。
1通迅作者：杨潍嘉，1043863389@qq.com
科研项目：桂林市科学研究与技术开发计划项目 合同编号：20150303-4
2结果
2.1各年龄组构成比（见饼图）
HFMD各个年龄组构成比经统计学分析没有差异（х2 =1.948，p=0.583）
2.2 病原学检出率 756例中EV71检出率42.06%（318/756） ，CoxA16检出率43.92%（332/756），28例重症中EV71检出率85.71%（24/28）。
2.3 FQ-PCR检测的标准曲线 扩增曲线从12个循环开始上扬（即Ct值>12），形状呈标准的“S”形，说明该样本中含有RNA病毒拷贝数很高；曲线从22-26个循环（Ct值在22-26之间）开始上扬形状基本呈“S”形，说明该样本中含有RNA病毒拷贝数较高；图1是从17个循环开始上扬的曲线，呈明显的“S”形。
3 讨论
从2008年5月起我国将手足口病归入丙类传染病[4]，病毒可经胃肠道（粪-口途径）传播，也可经呼吸道（飞沫、喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或粘膜疱疹及被污染的物品传播。早期发现、早期诊治，早期隔离，避免感染和波及更多人群尤为重要。
3.1 HFMD各年龄组构成比分析 本组研究提示各年龄组HFMD构成比没有差异，与崔鹏等[5]报道的各年龄组病原学分析相一致，特别是学龄前期的6月-1岁组，1-3岁组的患儿，绝大部分没有去幼儿园（散发人群），但有80%以上HFMD病例集中在这两个年龄段。提示有新初生婴儿的这部分家庭都是重要的宣传对象，还有公共游乐场所也要做好消毒等预防措施。本组研究28例重症HMFD中，3岁以下占92.9%（26/28）,与李小青等[1]报道的一组重症HFMD 1-3 岁占84.6%（22/26）相当，提示低年龄组发生重症HFMD比例高，因此3岁以下年龄组是防控HFMD重中之重。
3.2 EV71和CoxA16检出分析
3.2.1 756例中EV71检出率42.06%（318/756） ，CoxA16检出率43.92%（332/756），而多数学者[2] 报道EV71检出率高于CoxA16检出率，可能与不同地域，不同季节流行有一定关系，也有学者[4]认为HFMD流行的主要病原体处于不断变化中，一些非EV71和非CoxA16型肠道病毒引起的HFMD在不断增加，因此有条件要增加对HFMD病原学检测，掌握多种病原学特点，才能更好地防控。
3.2.2 本组资料EV71和CoxA16检出率略低于其他学者[2] ，分析是否与标本取材方式有一定关系，本组资料507例来自粪便，249例来自咽拭子，粪便约占2/3，吴烨等报道410份标本中，EV71疱疹液检出率77.42%（48/62），咽拭子检出率41.18%（35/85），粪便检出率39.32%（105/263），疱疹液检出率是最高的。赵凯丽等[2]也报道疱疹液检出率最高72%（18/25），咽拭子检出率60.0%（51/85）。笔者认为取疱疹液是有创操作，对婴幼儿及其家长来说依从性不一定好，是否值得推广有待进一步探讨。但粪便取材最方便，在起病第1周检出率是最高的，滕淑等报道EV71感染患者第1、4、6、10周粪便检出率分别为100%、48.1%、17.2%、0；CoxA16感染患者第1、4、6周粪便检出率分别为95.5%、53.8%、0。由此看来粪便检测不但适于早发现，也适于感染患儿临床症状体征消失后需要隔离的时间做参考。
3.3.3 EV71和重症HMFD 28例重症中EV71检出率85.71%（24/28），EV71是重症HFMD最主要病原体，EV71是高度嗜神经病毒，不及时控制易并发神经源性肺水肿和脑干脑炎而危及生命。因此检出EV71阳性需高度警惕，密切监测并发症。
3.4 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测技术 总体来说，HFMD肠道病毒细胞培养分离是金标准，但耗时1周左右且阳性率低；传统的血清学检测（中和实验）难以区分近期感染和既往感染；FQ-PCR检测技术，要求样本取材简单，不易污染。操作简单、快速（约3小时出报告），检出率较高，费用不贵，值得推广。李莎等建立的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）快速检测方法检测EV71，与RT-PCR 方法检出率和敏感度相同，无需PCR 仪，在普通恒温水箱内恒温120分钟即可完成核酸扩增，除了方便快捷的优点，将更经济，是否适合临床普遍推广有待于更多样本更多次探索。
参考文献
[1] 李小青，闫晓莉，史艳萍，等.陕西省26例危重型手足口病的病原学特点及临床分析[J].中国小儿急救医学，2011，18（6）:521-524.
[2] 赵凯丽，王芳，林牧，等.实时荧光定量PCR技术在手足口病病原体检测中的临床应用[J].现代医药卫生，2016,32（15）:2310-2314.
[3] 中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南（2010年版）[J].国际呼吸杂志，2010,30（24）:1473-1475.
[4] 芦红萍，孟一星，庞琳，等.2013至2014年首度医科大学附属北京地坛医院手足口病住院患儿的病原学检测分析[J].中华实验和临床感染病杂志（电子版）2015，9（6）:5-8.
论文作者:梁丽明，杨潍嘉1 ，匡小凤，陈智，申琰军， 巫玉峰,
论文发表刊物:《健康世界》2019年第07期
论文发表时间:2019/7/31
标签：检出论文; 粪便论文; 病毒论文; 病原学论文; 年龄组论文; 重症论文; 手足论文; 《健康世界》2019年第07期论文;