裴俊国[1]2010年在《水稻黄单胞菌T3SS效应分子的鉴别和xopQ1-1基因功能研究》文中指出水稻细菌性条斑病(Baterial leaf streak,BLS)和水稻白叶枯病(Bacterial blight, BB)是我国水稻上的两种重要的细菌病害,其病原菌如同其他革兰氏阴性植物病原菌一样,能够通过T3SS系统分泌一些致病性效应分子进入植物细胞中,从而引起寄主植物的产生抗(感)病性。虽然水稻黄单胞菌的全基因组测序已完成,但与水稻互作时T3SS效应分子的种类和数量并不清楚。Tsuge、Schechter等研究证明T3SE一般具有以下特征：基因的启动子区域存在hrp调控基因hrpX的作用位点PIP-Box (TTCGC-N15-TTCGC);N-端前50个特定氨基酸组成具有分泌信号：脯氨酸(P)和色氨酸(S)>20%,第三位和第四位其中之一为亮氨酸(L)或脯氨酸(P),前12位没有天冬氨酸(D)和谷氨酸(Q)。本研究根据这些方法获得了120个候选基因,选取了其中的15个做进一步的验证,以avrXa10为报道基因,结果发现PXO-3819通过T3S装置分泌,是T3SE。PXO2065、PXO2774、PXO3819启动子序列含有PIP-BOX (TTCGC-N15-TTCGC),以gfp为报道基因证明PXO2065、PXO2774、PXO3819受HrpX调控表达,RT-PCR验证也得到一致的结果,这两种报道体系的建立为水稻黄单胞菌新的T3SE的鉴定提供了有效的技术支持。基因组学揭示,Xoo和Xoc中均存在与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst)中通过T3SS分泌的hopQ1-1同源基因xopQ1-1,但其是否为T3SS效应分子以及在病菌致病性中的功能并不清楚。本文通过基因敲除技术,获得了水稻黄单胞病菌xopQ1-1基因的突变体。致病性测定结果发现,xopQ1-1基因突变后,病菌在水稻上的毒性增强,细菌生长能力增强。非常有意义的是,xopQ1-1基因突变体在3×108CFU/mL浓度时仍能在烟草上激发过敏反应,但在104CFU/mL时,8天后可在烟草上产生坏死症状。功能互补结果显示,xopQ1-1基因能够恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力,同样来至野油菜黄单胞菌(X.campestris pv. campestris)、茄青枯病菌(R. solanacearum GMI1000)、丁香假单胞菌(P. syringae pv. tomato DC3000)的同源基因也可以互补恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力。研究发现xopQ1-1的表达受HrpX调控,受hrp诱导培养基和植物细胞来源的信号诱导；蛋白免疫实验揭示XopQ1-1通过T3SS装置进行分泌,能够与HrpF转位蛋白进行互作,转位进入植物细胞中；细胞定位显示,XopQ1-1能够结合在细胞膜和细胞核中。酵母双杂交证明XopQ1-1能够与HpaA.Hpa4.HrpF和HrpB5蛋白互作；以Xoc的xopQ1-1基因为诱饵,从水稻cDNA文库中获得了与xopQ1-1互作的水稻基因,命名OosXopQ1-1；发现OsXopQ1-1受xopQ1-1诱导表达。以上结果表明,Xop1-1是水稻黄单胞菌的T3SE,在革兰氏阴性植物病原细菌中高度保守,具有相同的功能,可能作用于植物的免疫系统,有利于病害的发展。这为进一步揭示水稻-黄单胞菌互作的分子机理提供了科学线索。
张鼎鼎[2]2010年在《水稻条斑病菌hrcQ基因的功能以及hrpG在稻黄单胞菌两个致病变种中的互置性》文中认为水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)属于革兰氏阴性植物病原细菌,侵染水稻引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS),是东南亚国家和中国水稻上的重要细菌病害。水稻条斑病菌的hrcQ基因在动植物病原细菌中高度保守。不同植物病原细菌的HrcQ蛋白因在N端有变化,推测可能与分泌的效应分子特异性有关。水稻条斑病菌HrcQ蛋白对Ⅲ型分泌装置的(type III secretion system, T3SS)形成以及对效应分子的分泌性影响还不清楚。本研究利用同源重组方式获得了水稻条斑病菌hrcQ基因的敲除突变体,其丧失了在烟草上激发过敏反应(HR)的能力和在水稻上的致病性。hrcQ基因与水稻细胞互作时受诱导表达。蛋白质-蛋白质互作结果显求,HrcQ可分别与Hpa1、HrcN、HrpB5和HrpB2互作。分泌性检测发现,HrcQ不通过T3SS分泌至胞外。hrcQ基因突变,影响Hpal和HrpB2蛋白分泌。这些结果表明,HrcQ蛋白是形成Ⅲ型分泌装置的基本组分,并通过帮助Hpal和HrpB2等T3SS效应因子的分泌,从而影响病菌在非寄主上的HR和在水稻上的致病性。这为进一步分析水稻黄单胞菌T3SS的形成和分泌机制奠定了基础。hrpG和hrpX是水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)主要的hrp调控基因,控制着编码Ⅲ型分泌装置组分蛋白(type III secretion system,T3SS)基因和效应基因的表达,决定于病原菌在寄主植物上的致病性和在非寄主植物上的HR反应(hypersensitive response, HR)本研究对这两个致病变种的hrpG和hrpX进行了功能互置的研究,结果显示Xoc和Xoo的hrpX能够进行功能互置；Xoc的hrpG互补进Xoo的hrpG突变体,能够恢复突变体在寄主水稻上的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力至野生型水平；Xoo的hrpG互补进Xoc的hrpG突变体后,无法恢复其在寄主植物上的致病性和在非寄主烟草上激发HR的能力,但是并不影响下游hrpX, hrcT、hpa2、hrpD6和hpaR基因的转录表达,也不影响胞外蛋白酶的分泌,这些证据暗示：Xoo和Xoc的hrpX具有相同的功能,能够进行互相置换,Xoc的hrpG除具有Xoo hrpG的功能外,还控制另外一些未知基因的表达,且这些基因的表达不受Xoo hrpG的调控,为揭示这两种病原菌组织特异性的侵染机制提供了线索。
李小杰[3]2013年在《水稻黄单胞菌Hpa1与AvrBs2蛋白调控植物生长与抗病性的研究》文中认为革兰氏阴性植物病原细菌Harpin与Avr蛋白代表Ⅲ型泌出蛋白的不同类型,对致病性与植物抗病防卫反应起不同作用。Avr蛋白属于致病效应因子,需要从细菌细胞转移到植物细胞,才能行使致病功能。Harpin蛋白作为转运子起作用,帮助致病效应蛋白转位。同时,无论是Harpin蛋白还是Avr蛋白,对致病性与植物抗病防卫反应都有双重影响,而Harpin蛋白还有促进植物生长的作用。对这种多重功能的分子机制,目前还不完全清楚。本文选用以前了解比较多的Harpin蛋白Hpal,研究其促进植物生长与抗病防卫反应的分子机理,探讨蛋白结构与亚细胞定位对其功能的影响。另外,还研究了水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)AvrBs2的致病作用,为今后探讨Harpin与Avr蛋白之间的功能关系提供基础。1.Hpal利用乙烯和赤霉素信号调控植物生长与生长相关基因表达前人研究表明,Harpin通过乙烯信号及其调控因子EIN5来促进植物生长,这一效应主要涉及植物伸展素蛋白(expansin, EXP)的作用。植物EXP构成一个很大的蛋白家族,其成员受不同激素的调控,松弛细胞壁、促进细胞伸展,影响植物不同器官或组织的生长。EXP蛋白家族何种成员受何种激素信号调控,还不完全清楚。因此,本文研究了水稻白叶枯病菌Hpa1诱导EXP基因表达与促进植物生长的关系,着重探讨乙烯与赤霉素在这个过程中所起的作用。研究结果表明,当用Hpa1分别处理拟南芥、番茄、烟草和水稻时,植物的生长速度加快,同时叶片含氮量、叶绿素含量及叶绿素a和叶绿素b的比率提高。对Hpa1诱导的EXP基因表达分析结果显示：有11个组织特异性的EXP基因被Hpa1诱导表达,其中有4个与Hpa1诱导的信号通路相关,还有4个是最新鉴定的在烟草或水稻叶片中特异表达的基因。Hpa1处理能够诱导乙烯信号通路关键基因的上调表达,而阻断乙烯信号的响应,能够抑制Hpa1诱导的EXP基因表达和植物促生长作用。在水稻中,Hpa1诱导EXP基因表达和促生长效应与GA3作用类似,而阻断赤霉素的生物合成,Hpa1诱导的EXP基因表达和促进植物生长的作用也会被抑制。由此说明,Hpa1诱导EXP基因表达和促进植物生长需要ET和GA信号的参与。2.Hpa1蛋白生物学功能行使与促进植物生长的作用必需其N-端序列水稻黄单胞菌的Hpa1蛋白,能够促进植物生长,增强植物防卫反应与抗逆性,但机制还没研究清楚。已有研究表明,Hpal N-端氨基酸对其在非寄主烟草上产生HR是必需的。为了研究Hpa1N-端氨基酸对其生物学功能及植物生长的影响,我们分别构建了全长Hpal和Hpal N-端缺失突变体的原核表达载体,得到了全长Hpa1蛋白和缺失N端的Hpa1蛋白(Hpa1ΔNT).分别用Hpa1和Hpa1ΔNT处理植物,发现HpalΔNT丧失了激发烟草产生HR的能力,同时也大大减弱了植物的抗病防卫反应及抗逆性。对植物生长能力的测定结果表明,Hpa1能够促进植物的营养生长,但不影响生殖生长；Hpa1处理能增强植物生长相关基因的表达和植物叶片细胞的伸长生长；Hpa1处理能促进植物叶片叶的CO2的传导及光合作用,而HpalΔNT则大大削弱了Hpa1所诱导的促生长效应。由此说明,Hpal N-端对其生物学功能的行使及促进植物生长是必需的。3.质外体和细胞质Hpal对H2O2的产生与抗病性发挥不同作用革兰氏阴性植物病原细菌分泌的Harpin蛋白能够激活植物防卫反应信号通路,诱导植物产生抗病性,其中包括Harpin诱导的活性氧爆发,尤其是质外体中H2O2的产生。但是,Harpin蛋白在防卫反应信号通路中是如何被识别的以及产生于植物细胞质外体中的H2O2是如何参与防卫反应的,目前还不是很清楚。本研究以水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1为研究对象,解析其亚细胞定位是否影响了H2O2的产生以及H2O2是如何参与调控植物抗病性的。分别把Hpal和融合了质外体定位信号基因(S)的Hpal(SHpa1)转入拟南芥,产生了转基因拟南芥植株HETAt (Hpal-expressing transgenic Arabidopsis thaliana)&SHETAt (SHpal-expressing transgenic Arabidopsis thaliana)。研究发现,转基因拟南芥对丁香假单胞菌Pst DC3000和大白菜软腐病菌Pcc RL4具有抗性。亚细胞定位显示,Hpa1定位于HETAt的细胞质及SHETAt的质外体和细胞膜。通过对植物中H2O2的检测发现,H2O2主要积累于HETAt的细胞质及SHETA的质外体和细胞质。药理学试验结果表明,H2O产生于HETAt的细胞质和SHETAt的质外体,并且产生于质外体的H2O2依赖于NOX。外源喷施Hpa1处理野生型拟南芥时,其主要定位于细胞质外体并能诱导H2O2在质外体产生,且质外体H2O2能转运至细胞质。用DPI处理喷施Hpa1的野生型拟南芥和SHETAt植物后,抑制了质外体H202的产生,且细胞质中H2O2的积累也大大减少,同时也削弱了植物的抗病能力。以上结果表明,受Hpa1诱导且在质外体产生的H2O2需要从质外体运转到细胞质中才能参与植物防卫反应过程。4.水稻条斑病菌Ⅲ型效应因子AvrBs2的病理功能研究水稻黄单胞菌通过Ⅲ型分泌系统将大量的效应因子注入寄主细胞,使寄主产生抗(感)病性。虽然越来越多的Ⅲ型效应蛋白包括Avr蛋白被鉴定出来,但是关于其蛋白结构与生物学功能的研究目前还不是很多。AvrBs2是第一个被证明能够增强病原细菌在寄主植物中繁殖的Ⅲ型效应蛋白,能够增强野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv. vesicatoria(Xcv)的毒性,但是高度保守的AvrBs2效应因子在其它黄单胞菌中的生物学功能目前研究的还不是很清楚,尤其是水稻黄单胞菌。本文拟研究Xoc菌株RS105的AvrBs2效应因子的蛋白结构与生物学功能。通过同源交换,我们获得了avrBs2xoc基因插入突变体。接种试验结果表明,avrBs2突变体和野生型虽然在烟草上引起过敏反应的能力没有明显差异,但突变体却显著降低了病原菌在水稻IR24上的致病性,同时增强了植物病程相关蛋白基因PR-laΔPR-1b的表达。由此我们判断,AvrBs2xoc是一个致病效应因子,且能抑制寄主植物的免疫反应。
赵帅, 张子宇, 冯家勋[4]2011年在《水稻黄单胞菌三型分泌系统效应物的研究进展》文中进行了进一步梳理水稻黄单胞菌(X.oryzae)三型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)效应物(Effector)一直被认为是水稻黄单胞菌最重要的致病因子之一。水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和水稻黄单胞菌栖稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)分别引起水稻两大细菌病害水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight)和水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak)。基因组分析揭示,水稻黄单胞菌中至少存在28个类型的T3SS效应物,分为TAL(Transcription activator-like effectors)效应物和non-TAL效应物(Non transcription activator-like effectors)两大类。通过对水稻黄单胞菌中T3SS效应物的数量、种类、结构、宿主靶标等方面进行综述,为全面了解水稻-水稻黄单胞菌互作的分子机理,调控网络以及水稻分子育种提供一种新洞察力。
邹丽芳[5]2007年在《水稻黄单胞菌遗传操作体系的建立及hrp基因和avrBs3/pthA家族基因的功能研究》文中认为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和水稻细菌性条斑病(baeterial leaf streak,BLS),在生产上造成水稻损失严重。这两种病原菌已成为水稻的两个模式病原菌。为精确和高通量地研究Xoo和Xooc的致病相关基因的功能、基因间相互作用以及调控,如hrp基因,即决定Xoo和Xooc在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)和在寄主植物上具有致病性(pathogenieity)的基因,本研究利用pK18mobGⅡ载体建立了一种基于单交换的基因定点插入突变体系和利用自杀性载体pKMS1建立一种基于负选择标记基因sacB的两次同源交换的无标记敲除技术。成功获得了水稻白叶枯病菌PXO99~A菌株的3个hrpF和4个hrcV插入突变体以及RS105的4个hrpF和4个hrcV插入突变体。RS105的hrcV,hrpF、hrpE、hpaB和hpa1的单基因敲除突变体,hpa1和hpa2、hpa1和hrpF、hrpE和hrpF以及hpaB和hrpF的双基因敲除突变体;hpaB、hpa1和hrpF及hpa2、hpa1和hrpF的三基因敲除突变体。多基因敲除技术的建立为研究水稻黄单胞菌致病相关基因的功能以及在致病过程中基因间相互作用奠定了遗传学基础。有证据表明水稻黄单胞菌都含有15个以上的avrBs3/PthA家族基因,它们具有几乎一样的5'端和3'端,不同的只是中间102 bp重复单元的重复数不同。本研究以avrBs3/pthA家族成员avrXa3的3'端含有核定位信号和酸性转录活化域的359bp的DNA片段构建探针,对中国菌系的白叶枯病菌和条斑病菌的基因组DNA进行Southern杂交分析,发现这两种病原菌的不同小种间所含有的avrBs3/pthA基因的拷贝数不同,有些条带在所有的小种中都存在,有些条带是某个小种所特有的。毒性弱的小种含有较少的avrBs3/pthA家族成员,毒性强的小种含有较多的avrBs3/PthA家族成员和较多的102 bp重复单元的重复数。以相同的359 bp的DNA片段为探针进行菌落原位杂交,从条斑病菌RS105菌株的基因文库中筛选到35个阳性克隆,经过酶切和Southern杂交后归类为28个avrBs3/PthA基因。34个阳性克隆分别导入白叶枯病菌PXO99~A菌株中,进行水稻近等基因系苗期注射接种和成株期剪叶接种,发现含有p6、p8、p9、p10和p14的克隆在含有抗病基因Xa10的水稻品种IRBB10上产生特异性的HR(Hypersensitive response)反应。序列测定结果显示它们均是avrBs3/pthA家族的成员,分别命名为avr/pth6、avr/pth8、avr/pth9、avr/pth10和avr/pth14。蛋白质序列比对发现,这5个蛋白质的C端均缺少水稻白叶枯病菌avrBs3/pthA家族特有的SGsVGGTI残基。基因旁侧序列比较发现,水稻条斑病菌的avrBs3/pthA基因在启动子区存在特有的GTTTCTG序列,avr/pth14在启动子区和终止子区存在一段顺式元件,具有转座子转移的特征.将avr/pth6和avr/pth8的BamHⅠ片段替换avrXa3基因相应的BamHⅠ片段,构建为新的融合基因avrBre6和avrBre8,这两个融合基因仍可使PXO99~A菌株在IRBB10上具有无毒性。从水稻条斑病菌中克隆avrBs3/pthA家族基因还未见报道。本研究的结果揭示,Xooc中存在avrBs3/pthA家族基因,可能因为Xooc中某种因子的存在,限制了avrBs3/PthA基因的无毒性功能,这也可能是水稻缺少抗条斑病的主效抗性基因的原因。hrcV基因在动植物病原细菌中高度保守,基因产物是Ⅲ型分泌系统的组成蛋白,推测形成一环状结构,位于细菌的內膜。本研究通过单交换同源重组分别获得了PX099~A的PXV268、PXV917、PXV106和PXV452插入突变体以及RS105的RSV268、RSV917、RSV106和RSV452突变体;通过双交换同源重组获得了RS105的菌株hrcV缺失突变体RS105△hrcV.PXV268和RSV268突变体在非寄主上仍能激发HR,在水稻仍具有致病性.其余的hrV突变体PXV917、PXV106、PXV452和RSV917、RSV106、RSV452丧失了在水稻上的致病性和在非寄主上激发HR反应的能力.HrcV的突变体与Ⅲ型组分蛋白HrcN、HrcJ、HrcR以及TTSS效应分子Avr/pth28、AvrXa3和Avr/pth13的酵母双杂交结果揭示:HrcJ和HrcR蛋白主要与HrcV蛋白N端互作;HrcN蛋白主要与HrcV蛋白C端互作;HrcV蛋白C缺失可能影响AvrBs3/pthA蛋白的分泌。黄单胞菌通过hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)经Hrppilus和HrpF形成的translocon将T3SS效应分子转运至寄主细胞中从而导致寄主产生抗(感)病性.hpa1编码的蛋白Hpa1是一类harpin蛋白,可在非寄主烟草上激发HR,hpa2基因在各类黄单胞菌中高度保守,编码类似溶菌酶的蛋白.在本研究发现,ArpF和hpal基因单突变以及hpa1和hap2基因双突变后Xooc(RS105)仍可在非寄主烟草上产生HR以及在水稻上可形成水渍(water soaking)症状,但是症状不能有效扩展.hrpF和hpa1基因双突变体以及hrpF、hpa1和hpa2的三突变体則丧失了激发烟草产生HR反应和在水稻上形成水渍症状的能力。喷雾接种发现,hrpF突变体不能侵染水稻形成条斑症状,hpa1突变体以及hpa1和hpa2的双突变体能够形成短小的条斑。电镜扫描显示,hpa1和hrpF单突变体均可通过气孔侵染水稻,而hrpF和hpa1双突变体以及hrpF,hpa1和hpa2的三突变体則丧失了在水稻气孔细胞处聚集的能力。扫描电镜显示,hrpF和hpa1单突变以及hpa1和hpa2双突变体均能与水稻细胞互作,但hrpF和hpa1双突变体以及hrpF、hpa1和hpa2的三突变体則丧失了与水稻细胞互作的能力。这提示,hrpF和hpa1基因协同作用是水稻条斑病菌水渍症状形成的主要因素,或者HrpF和Hpa1是两个主要的转运蛋白;hrpF基因是水渍症状扩展的主要因子;hrpF和hpa1基因突变不影响病菌通过气孔侵染水稻,但因突变后影响其它效应分子与水稻细胞的互作从而影响了病害症状的扩展或者与水稻建立营养寄生关系的能力。hrpF和hpa1基因功能的分析将加快Xooc与水稻的互作研究,为从分子水平解析条斑病水渍症状的形成机制奠定了基础。hpaB和hrpE基因XooC在水稻上致病性和烟草上HR反应所必需的。hrpB和hrpE基因突变,則Xooc丧失了在烟草上激发HR的能力和在水稻上的致病性。hpaB和hrpF双突变体仍能使XooC保持在烟草上的HR反应,但丧失了在水稻上的致病性.hrpF、hpaB和hpa1三突变体丧失了激发烟草HR应的能力和在水稻上的致病性。突变体与水稻愈伤细胞的互作结果显示:hpaB突变体以及hrpF和hpaB的双突变体都能够与水稻愈伤细胞互作,hrpF、hpaB和APa1的三突变体以及ArpE突变体丧失了与水稻愈伤细胞互作的能力。扫描电镜的结果显示:hrpE基因突变,Hrp plius装置不能够形成是致病性丧失的主要因素。HpaB可能特异性控制能够引起水渍症状的效应分子的分泌;不依赖HpaB分泌但经址HrpF转运进入植物细胞的某些(个)效应分子能够抑制烟草的HR反应;Hpa1是不经过HrpF进入植物细胞的一类Harpin蛋白。本研究获得了水稻白叶枯病菌PXO99~A菌株的三个hrpF突变体PXF322、PXF410和PXF744。三个突变体通过注射接菌在苗期水稻叶片中仍能够引起水渍状病斑和具有激发烟草产生HR反应的能力。通过剪叶接种成株期水稻结果发现,三个突变体丧失了在水稻叶片上引起白叶枯症状的能力,功能互补子能够恢复突变体在水稻上形成与野生型相似的病斑长度。以上结果证明,Xoo的hrpF是影响水稻白叶枯病菌致病性的关键基因,但是hrpF的突变并不能完全阻止T3SS效应分子与寄主和非寄主植物的互作。
杨娟[6]2007年在《水稻黄单胞菌xopX基因和avrBs3/PthA基因的克隆与功能研究》文中研究指明稻黄单胞菌种下的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xooc),分别引起水稻白叶枯病和水稻条斑病,是水稻上的重要病原细菌,如同其它革兰氏阴性植物病原细菌一样拥有hrp基因(hypersensitive responseon nonhost plants and pathogenicity on host plants)和无毒基因(avrirulence)或毒性基因(virulence)。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)和在感病寄主植物上致病(pathogenicity)的能力。毒性基因则是以基因对基因互作的方式决定着寄主专化性。辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria,Xcv)T3SS效应分子xopX基因产物在烟草上能够激发HR,被认为是植物免疫系统的作用靶标。稻黄单胞菌中是否存在xopX的同源基因以及其在非寄主上激发HR和在水稻上的致病性中有何作用还不清楚。为此,本研究根据Xoo、Xcv、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的xopX基因进行比对设计引物,从水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌中分别克隆了xopXoo和xopXoc基因。利用同源重组的原理对xopXoo和xopXoc基因进行了插入突变,并对xopX基因在非寄主烟草上的过敏反应、水稻苗期的水渍状病斑(water soaking)以及成株期的致病性和病菌生长能力进行了分析。测定结果显示,xopXoo和xopXoc基因并不改变Xoo和Xooc在烟草上激发过敏反应和在水稻上产生水渍状病斑的能力,但在成株期水稻上的致病性和菌体生长能力显著下降。遗传互补能够恢复xopXoo和xopXoc突变体的致病性和菌体生长能力,表明xopXoo和xopXoc是水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的致病性基因。有趣的是xopXoc基因2800bp大小,存在2271bp的开放阅读框架,含ATG启动密码子,在启动子区域中不存在PIP-box;推测的XopXoc蛋白由756个氨基酸构成,大小为79.5kDa,与其它黄单胞菌比较发现,在XopXoc蛋白的C端区域含有56个完全不同的氨基酸序列,该氨基酸序列属于丝氨酸/苏氨酸特异性激酶亚科。是一种毒力决定性因子。本研究利用缺失突变技术对水稻细菌性条斑病菌hpa1和xopXoc基因进行突变,并实现了hpa1和xopXoc基因的同时突变。通过测定这三个突变体在非寄主烟草上的过敏反应、水稻苗期的水渍状病斑(water soaking)以及成株期的致病性和病菌生长能力,发现它们在水稻上仍能产生水渍状病斑,但在成株期水稻上的致病性和菌体生长能力显著下降。双突变体的菌体生长能力最低,hpa1突变体的菌体生长能力则低于xopX突变体。遗传互补能够恢复hpa1、xopXoc突变体及其双突变体的致病性和菌体生长能力。有趣的是hpa1和xopX突变体在烟草上的过敏性反应仍然存在,而双突变体在24 h和36 h时仍未能出现明显的过敏性反应。RT-PCR分析发现hpa1和xopX突变体在烟草上激发防卫反应中标志性基因产生不同水平的转录表达。hpa1和xopX基因共同决定了Xooc对植物的反应。hpa1和xopX基因通过激活不同的防卫反应信号传导途径诱导植物产生过敏性反应,如水杨酸介导的系统获得抗性途径(systemacquired resistance,SAR),其中至少包括标志性基因病程相关蛋白PR-1a(pathogenesis-related protein),以及MAPK级联途径,包括促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、伤口诱导的蛋白激酶(wound-inducedprotein kinase,WIPK)和3-羟基-3-甲基-戊二酰-辅酶A还原酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,HMGR2)。其中xopX基因的缺失使4小时前HMGR2基因没有得到瞬时表达,推测hpa1基因对HMGR2有抑制作用。白叶枯病菌与水稻互作符合基因对基因关系,但基因-基因互作特异性的本质并不十分不明确。本实验室以avrBs3基因家族中高度保守的酸性转录激活域的359 bpEcoRI-BamHI DNA片断为探针,扫描用BamHI酶切的稻黄单胞菌系C8菌株基因组,发现C8菌株特有6.0 kb左右的avrBs3/PthA家族基因。为此本研究用BamHI酶切稻黄单胞菌系C8菌株基因组,回收5.5-6.5kb的片段,构建了C8菌株的部份基因文库。菌落原位杂交C8菌株的基因文库,经限制性酶切分析和Southern杂交归类,获得了2个克隆av/rpthC8a和avr/pthC86,其中avr/pthC8a克隆的部分测序结果发现avrBs3/pthA基因家族保守的限制性酶切位点BamHI缺失。将获得的阳性克隆导入菲律宾系统6号小种PXO99~A菌株中,在水稻近等基因系上对苗期水渍状斑和菌体生长能力进行测定发现PXO99~A接合子在水稻品种DV85和Asominar上无水渍状斑,菌体生长能力明显降低。成株期致病性测定结果显示,avr/pthC8a和avr/pthC8b使PXO99~A在近等基因系上的毒性普遍下降。由此推测,avr/pthC8可能与病原菌的毒性和水渍状斑的形成有关。
陈功友[7]2000年在《水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）hrp基因克隆与特性研究》文中研究说明如同其它革兰氏阴性植物病原细菌一样，水稻上两种重要的病原细菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae（简称Xoo）and pv.oryzicola（简称Xooc））也拥有hrp基因。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应（hypersensitive response，HR）和在感病寄主植物上致病（pathogenicity）的能力。hrp基因还编码组成Ⅲ型泌出系统的蛋白并将效应分子转运至寄主细胞中。harpin是激发非寄主产生HR的蛋白类信号分子。hrp基因发生突变，则丧失上述功能。 本研究用硫酸二乙酯（DES）化学诱变Xoo野生菌株JXOⅢ和PXO99~A及Xooc野生菌株RS105，获得26株三种类型的hrp~-突变体：HR~-/Pth~-/harpin~-，HR~-/Pth~-/Ⅲ~-和HR~-/Pth~±/harpin~-；4株dsp~-突变体。dsp~-突变体丧失致病功能但胞外多糖能够正常产生。野生型菌株和部分hrp~-突变体经细胞超声波破碎和10％水饱和酚法验证，脂多糖LPS不是激发烟草产生HR的信号物质。激发HR的信号物质为蛋白类，其对热稳定，对蛋白酶K敏感。hrp~-突变体的胞外水解酶类（淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和脂酶）活性与野生型菌株相比没有显著差异。hrp~-突变体在hrp诱导培养基上产生的胞外蛋白数目不等。 以E.coli S17-1为宿主菌，以pUFR034为载体而构建的JXOⅢ和RS105基因文库，交叉互补法导入受体菌M55（Xooc hrp~-突变体）中，获得来自JXOⅢ的hrp基因阳性克隆pUHRX245和来自RS105的pUHRS130、pUHRS138和pUHRS662。经酶切和亚克隆分析发现，pUHRX245所携hrp基因片段大小为36.8-kb，pUHRS130、pUHRS138和pUHRS662所携hrp基因片段大小都为39.3-kb，酶切位点相同。在此基础上，构建了36.8-kb和39.3-kb hrp基因片段的限制性酶切图谱。pUHRX245和pUHRS138不仅能功能互补所有的hrp~-突变体恢复激发烟草产生HR，而且可使hrp~-突变体M1005恢复致病性，表型为细 初 耍条斑病症状。 来自pUHAIQ45的36．SAn hrp基因片段，经一系列亚克隆，获得了3．3协Sacl功能片段，能使所有的h件突变体可在烟草上激发HR（来自PXOg吵的帅－突变体M16除外人序列测定结果表明，3．3－kb DNA片段中含完整的bpc基因，另外还含有与热激蛋白卯家族有关的基因卿OAN和仰ON。HSpOKF和恤OM的功能还不清楚。据推测，可能与感应环境温度和植物信号分子有关。 来自 pUHRS138的 39．3七b hrp基因片段，经一系列亚克隆，获得 4．M’bM’bB删dL闷吐功能片段，能功能互补所有的h叶突变体恢复在烟草上激发HR。：序列测定结果表明，4．5－o DNA片段中含有完整 h叭和 h恤C基因。 交叉功能互补研究表明，来自 XoO的 h咖可交叉互补 XOOC h矿突变体，而来自XooC的hrp“和h恤OC不能单独起作用。 h冲渝o和h…地co序列比较发现，与形成a一螺旋一转一a一螺旋有关的序列高度保守。这一基序的上游，在3862位点和273毛94位点，m户h比和坏林OO有所不同。 根据来自 PXO86的 bed。和来自大豆斑疹病菌（XCpV poed）的 hrof基因序列，PCR方法可从仰基因克隆p和pUHRS138以及XOO、Xe中扩增出h叭和hind同源片段，大小与h叭和bud相同。h叭的序列与bed。相同。PCR的扩增结果还显示，bed。在测试的黄单胞茵中较为保守，hrall在测试的植物病原细菌中较为保守。这说明，pUHRX25和 pUHRS138所携hrp基因片段，不仅含有hrp调控基因hrpG和切和乙而且还含有hrp基因簇的帅基因。：
王云鹏, 徐柳, 喻子牛, 张吉斌[8]2015年在《抗水稻黄单胞菌的苏云金芽胞杆菌菌株筛选及其活性物质》文中研究表明【目的】从400株苏云金芽胞杆菌菌株中筛选出拮抗水稻黄单胞菌活性最好的菌株YBT-2532,并对其抑菌活性物质进行分离。【方法】对苏云金芽胞杆菌YBT-2532产生的活性物质理化特性进行测定。【结果】该活性物质对温度、蛋白酶、p H均不敏感,70°C处理1 h仍保留有75%的活性;活性物质在p H 2.0-12.0较稳定;该活性物质溶于甲醇、微溶于乙醇、不溶于丙酮、二氯甲烷和氯仿。利用凝胶过滤、离子交换层析、固相萃取、高效液相色谱技术,对抑菌组分进行分离,并通过HPLC-IT-MS方法确定其分子量。纯化的活性组分是一种分子量为797.8 Da的强极性水溶性小分子。【结论】该活性物质性质与已知的来源于苏云金芽胞杆菌的抗菌活性物质不同,可能为新型抗菌物质。
肖友伦[9]2007年在《水稻黄单胞菌感知的水稻信号分子的分离及hcm1转基因烟草的研究》文中进行了进一步梳理水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas_oryzae pv._oryzicola,Xooc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas_oryzae,Xo)种下的两个致病变种,分别引起的水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)在生产上造成较大危害。Xoo和Xooc均拥有决定在非寄主植物上激发过敏反应和在寄主植物上产生致病性的hrp(hypersensitiveresponse on nonhost plants and pathogenicity on host plants)基因簇。通过改良Xcv(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)hrp基因的诱导培养基XVM2,本实验室获得了适合Xoo与Xooc hrp基因诱导表达的基本培养基XOM3。用N6液体培养基振荡培养,本研究有效建立起水稻的悬浮细胞系。为研究hrp基因的功能,本研究将Xooc的hrpX和hpal基因启动子与绿色荧光蛋白基因gfp(green fluorescenceprotein)构建为融合基因。荧光显微检测表明,Xo的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达;与水稻悬浮细胞、水稻愈伤细胞互作,Xo的hrp基因被高效诱导表达。这些结果表明,Xo的hrp基因是诱导表达的,本研究已成功建立起Xo的hrp基因诱导表达系统。Xo hrp诱导表达系统的建立为研究hrp基因的功能,发掘T3SS(typeⅢsecretion system)效应分子以及开展Xoo和Xooc致病性比较遗传学研究奠定了基础。为研究不同遗传背景下Xooc hpal和hrpX基因的表达情况,本研究将hrpX::gfp、hpal::gfp融合基因导入Xooc的hrpX、hpal、hrpF、hrcV突变体中。绿色荧光蛋白表达揭示,在诱导表达条件下,hpal、hrpF、hrcV基因突变体中hpal和hrpX基因的表达水平与野生型相当,表明hpal、hrpF、hrcV基因突变不影响hpal和hrpX基因的表达;而在诱导表达条件下hrpX突变体中,hpal基因不能被诱导表达,hrpX基因仍能维持野生型背景下的表达水平,表明hpal基因的表达受HrpX蛋白的调控,hrpX基因的表达不受自身的调控,在hrpX基因的上游还存在别的调控因子。为研究Xooc的Harpin和Avr蛋白的泌出特性,本研究构建了harpin::gfp、avr/pth13::gfp的融合蛋白基因,使其在诱导条件下表达。荧光显微检测结果表明,与水稻细胞共培养16h导入融合蛋白基因的RS105菌株在诱导条件下菌体不发荧光,且也没有观察到水稻细胞部位有荧光;导入融合蛋白基因的RS105菌株hrcV基因突变体在诱导条件下菌体可见荧光,与水稻悬浮细胞互作也未见水稻细胞部位有荧光,揭示Harpin::GFP、Avr/pth13::GFP融合蛋白通过T3SS才能泌出至水稻细胞中。由于GFP的瞬时表达特性,在荧光激发光下难以观察到水稻细胞部位有融合蛋白结合。以Xooc的RS105/pXG为供试菌株,本研究试图从水稻悬浮细胞中分离能诱导hrp基因表达的水稻信号分子。RS105/pXG与水稻悬浮细胞互作16h,在悬浮培养液中游离的菌体hrp基因也能被诱导表达。根据这一结果,本研究在RS105与水稻悬浮细胞互作16h后的共培养液的基础上获得了RCM2,荧光检测发现RCM2能诱导,hrpX基因的表达,表明其中含有能诱导hrp基因表达的信号分子。通过超滤离心,发现诱导信号分子存在于分子量小于5000D的溶液中。紫外-可见光(190nm-780nm)扫描结果表明,RCM2最大吸收峰在190-238nm处,在360-780nm处基本没有吸收。进一步的研究发现,诱导信号分子是亲水性的物质,不能被乙酸乙酯、氯仿、等萃取,也不能被80%甲醇、乙醇沉淀,对蛋白酶K不敏感,100℃20min信号分子不会失活。薄层层析结果揭示,RCM1与RCM2中主要物质成分均为为糖类,两者比较主要是所含糖类的种类和含量不同。Harpin_(Xooc)蛋白可在植物上激发HR(hypersensitive response)与诱导产生多种有益表型,如抗病、抗虫、抗旱以及促进植物生长等,但它没有直接的杀菌活性。将Harpin_(xooc)和Cecropin以及Melittin的活性结构域通过polylinker与自由环进行分子组合,重组表达后的Hcm1(Hpal-Cecropin-Melittin)融合蛋白在植物上可激发过敏反应和诱导产生SAR(system acquired resistance),对革兰氏阴性植物病原细菌和植物病原真菌具有杀菌功能。为研究Hcm1蛋白在植物体内表达后是否也能赋予植物产生SAR,本研究通过土壤杆菌介导法将含hcm1基因的pBI121重组载体导入基因工程模式植物烟草中。在含Km(100mg/L)的MS固体培养基上筛选到具有抗性的烟草转化植株,初步认为是转化成功的植株。PCR和Southern杂交证明融合基因已经整合到植物染色体上,RT-PCR结果证明转化成功的植株中hcm1基因能够正常转录表达。Hcm1融合蛋白含有Hpa1蛋白完整的功能域,能在植物上激发HR反应和诱导植物产生SAR,本研究通过RT-PCR检测植物防卫反应途径与HR反应标志基因的转录表达情况。结果表明,Hcm1融合蛋白在烟草中表达后,HR反应标志基因hin1与hsr203j的转录被激活,植物防卫反应途径下游PRla基因的表达也被激活,而相应转空载体的植株检测不到这些基因的转录表达。TMV抗性测定结果表明,表达Hcm1融合蛋白的烟草对TMV的抗性显著增强;喷雾接种烟草野火病菌,结果发现转基因烟草的病斑数明显较转空载体植株少。这些结果表明Hcm1蛋白通过激活植物抗病反应途径赋予了转基因烟草广谱的抗病活性。
范素素[10]2015年在《水稻黄单胞菌Ⅲ型分泌系统酚类化合物抑制剂的筛选及其机制研究》文中进行了进一步梳理传统抗生素通常以细菌生存的关键因素为作用靶标,导致细菌抗药性的产生越来越普遍和严重。因此,靶向细菌毒性因子、而不影响细菌的生长,成为抗菌药物研发的新思路和新途径。细菌III型分泌系统(T3SS)是革兰氏阴性病原细菌中的关键毒性因子,已经成为了研发新型药物的理想靶标之一。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)分别引起白叶枯病和条斑病,是水稻上重要的细菌性病害,研发新型有效的病害防治新药物是迫切需要解决的关键问题之一。T3SS是Xoo和Xoc的关键毒性因子,在两个致病变种中高度同源和保守,可以用作新型药物分子设计的靶标。因此,本研究鉴定了4种对其T3SS的功能有抑制作用的酚类化合物,探讨了它们抑制作用的分子机制,为其进一步在生产实际的病害防控中的应用提供理论依据。研究结果如下:1.水稻白叶枯病菌T3SS抑制剂的筛选和鉴定选用了一个编码harpin蛋白(一个T3SS分泌蛋白)的hpa1基因的启动子,构建了绿色荧光蛋白(GFP)报告系统;利用流式细胞术,检测了酚类化合物对Xoo菌株PXO99AT3SS的影响,以筛选出相应的抑制剂。在hrp基因诱导培养基XOM2中添加不同酚类化合物,检测细菌hpa1基因启动子活性。结果显示,在检测的45种化合物中,以对hpa1基因的启动子活性抑制率高于60%为标准,筛选到10种可能的T3SS抑制剂。随后,检测了它们对Xoo在非寄主烟草上引起过敏性反应(HR)能力的影响。结果发现,4种酚类化合物(TS006,TS010,TS015和TS018)完全抑制了Xoo在烟草上诱导HR的能力,并且它们对Xoo各生长阶段都未发现有抑制作用。以上结果说明,TS006,TS010,TS015和TS018是通过影响T3SS功能,而非细菌生长,影响了Xoo烟草诱导HR的能力。2.水稻白叶枯病菌T3SS抑制剂的作用机制为了进一步揭示这4种抑制剂抑制T3SS功能的分子机制,选取了hrp基因簇中hrp B和hrc C基因启动子,检测这4种抑制剂对它们活性的影响。hrp B基因启动子中含有一个完整的受Hrp X调控的PIP-box,而hrc C启动子中不含有PIP-box。结果显示,hrp B启动子活性被4种抑制剂显著抑制,而hrc C启动子活性不被抑制。通过q RT-PCR检测了不同类型hrp基因的m RNA水平,结果发现hpa1、hrp E、hrp F、hrc C、hrc T、hrc U以及调控基因hrp G和hrp X的转录水平都有不同程度的降低,表明4种抑制剂影响了Xoo中T3SS的表达水平,而且可能是通过Hrp G/Hrp X的调控途径来实现的。采用Cya-转导试验,发现4种抑制剂对两个T3SS的Non-TAL效应子(PXO_04172和PXO_03702)转导的抑制作用。另外,检测了4种抑制剂对gum基因表达的影响,发现gum基因m RNA水平并没有降低,表明4种抑制剂可能并不影响EPS的产生。3.T3SS抑制剂对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌致病性的影响检测了4种T3SS抑制剂是否抑制Xoo和Xoc对水稻的致病性。结果表明,在水稻感病品种IR24幼苗叶片上,Xoo引起的水渍状病斑以及Xoc引起的病症均可被TS006,TS010,TS015,TS018显著地抑制。而在IR24成株叶片上,Xoo和Xoc引起的白叶枯和条斑病害症状也在不同程度上被抑制。总之,本研究鉴定出了4个T3SS抑制剂,揭示了它们可能通过Hrp G/Hrp X调控途径影响了hrp基因转录以及T3SS效应子转导,从而不同程度地影响了Xoo和Xoc在水稻上的致病性。这一结果为这四个T3SS抑制剂在农业生产上作为细菌病害的新型防治药剂应用提供了理论依据。
参考文献：
[1]. 水稻黄单胞菌T3SS效应分子的鉴别和xopQ1-1基因功能研究[D]. 裴俊国. 南京农业大学. 2010
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[3]. 水稻黄单胞菌Hpa1与AvrBs2蛋白调控植物生长与抗病性的研究[D]. 李小杰. 南京农业大学. 2013
[4]. 水稻黄单胞菌三型分泌系统效应物的研究进展[J]. 赵帅, 张子宇, 冯家勋. 微生物学通报. 2011
[5]. 水稻黄单胞菌遗传操作体系的建立及hrp基因和avrBs3/pthA家族基因的功能研究[D]. 邹丽芳. 南京农业大学. 2007
[6]. 水稻黄单胞菌xopX基因和avrBs3/PthA基因的克隆与功能研究[D]. 杨娟. 南京农业大学. 2007
[7]. 水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）hrp基因克隆与特性研究[D]. 陈功友. 南京农业大学. 2000
[8]. 抗水稻黄单胞菌的苏云金芽胞杆菌菌株筛选及其活性物质[J]. 王云鹏, 徐柳, 喻子牛, 张吉斌. 微生物学通报. 2015
[9]. 水稻黄单胞菌感知的水稻信号分子的分离及hcm1转基因烟草的研究[D]. 肖友伦. 南京农业大学. 2007
[10]. 水稻黄单胞菌Ⅲ型分泌系统酚类化合物抑制剂的筛选及其机制研究[D]. 范素素. 中国农业科学院. 2015
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