吕爱军[1]2001年在《25株嗜温气单胞菌生物学特性及其外膜蛋白型的研究》文中提出对分离的25株嗜温气单胞菌进行了形态学观察、生理生化试验和血清学试验等系统鉴定，确定其中18株为温和气单胞菌，其余7株为嗜水气单胞菌。 免疫电泳试验的结果显示，不同菌种（菌株）的抗原不仅与相应的特异性兔源抗血清，而且与抗其它菌种（菌株）的兔源抗血清也产生3-8条免疫沉淀带，这种免疫交叉反应表明25株嗜温气单胞菌间存在共同抗原。 小白鼠和鲫鱼动物试验结果显示，在25株嗜温气单胞菌中，除XA4、BA5、BA6叁株细菌外，其余菌株对小白鼠都有致死性，致死率均为100％。BA1、BA3、BA10、BA11、BA15、BA16和XA23 7株嗜温气单胞菌对鲫鱼具有致死性，其中BA1、BA3为嗜水气单胞菌，对鲫鱼的致死率分别为66.7％和100％；BA11、BA16、BA10、BA15和XA23 5株为温和气单胞菌，对鲫鱼的致死率为33.3％至100％。这表明嗜温气单胞菌对小白鼠、鲫鱼的致病性有所不同。 采用超声波破碎-SI法提取其中8株嗜温气单胞菌（BA1、BA3、BA6、M1、BA16、BA15、BA10、XA23）的外膜蛋白（OMPs），进行SDS-PAGE电泳，比较分析其OMP型。结果显示5株温和气单胞菌（M1、BA16、BA15、BA10、XA23）的OMP型基本相同，在分子量范围为2.01×10~4-6.62×10~4之间出现7-9条蛋白主带，并均有相对分子质量为2.4×10~4、3.0×10~4、3.7×10~4、4.2×10~4的4条蛋白带。3株嗜水气单胞菌（BA1、BA3、BA6）的OMP型相似，在分子量范围为2.01×10~4-6.62×10~4之间出现6条蛋白主带，其中相对分子质量为2.3×10~4、3.1×10~4、3.75×10~4、4.0×10~4的蛋白带为3株细菌所共有。这表明不同种嗜温气单胞菌的OMP型差异较大；而同种嗜温气单胞菌不同菌株之间的OMP型相似，但蛋白带的迁移率及颜色深浅在菌株间仍有差异，并与菌株来源有关。通过类平均法对8株嗜温气单胞菌外膜蛋白进行系统聚类分析，表明同种嗜温气单胞菌不同菌株之间的亲缘关系相对较近。
倪凌[2]2002年在《嗜温气单胞菌外膜蛋白型及其免疫保护性的研究》文中提出应用动物实验、SDS-PAGE电泳和免疫印迹等方法对8株嗜温气单胞菌(BA1、BA3、BA10、BA11、BA15、BA16、XA23和BA6)的致病性、外膜蛋白型及其免疫保护性进行研究。 首先，将这8株细菌人工感染健康小鼠、鲫鱼和鳖。结果表明嗜水气单胞菌BA6株为非致病株，其余7株嗜温气单胞菌为致病株，但细菌的毒力大小在不同表型种间和不同菌株间都存在差异。 分别用超声波法、超声波加EP(EDTA和PMSF)法、研磨法和研磨加EP法四种不同方法提取了嗜水气单胞菌BA3株的外膜蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明，超声波加EP法提取的外膜蛋白浓度最大，蛋白条带最清晰。进一步采用超声波加EP法提取了9株嗜温气单胞菌BA1、BA3、BA10、BA11、BA15、BA16、XA23、BA6(非致病株)和J-1(标准株)的外膜蛋白，并对其SDS-PAGE电泳图谱进行了分析，结果显示5株温和气单胞菌(BA10、BA11、BA15、BA16和XA23)的OMP型相似，4株嗜水气单胞菌(J-1、BA1、BA3和BA6)的OMP型相似。这些表明了不同表型种嗜温气单胞菌的OMP型存在一定的差异，而同一表型种的不同菌株间的OMP型尽管相似，但蛋白带的迁移率及颜色深浅却仍有差异。 采用免疫印迹技术对具有代表性的四株嗜温气单胞菌的外膜蛋白的抗原性进行了分析，结果表明相对分子量为40000的外膜蛋白是这四株细菌共同的抗原，而分子量为43000、50000、38000和50000的蛋白分子分别为嗜温气单胞菌J-1、BA3、BA15和XA23四株菌所特有的外膜蛋白抗原。 用标准株J-1的外膜蛋白免疫小鼠(50μg／只)，二免10天后分别用J-1，BA3，BA15和XA23四株细菌攻毒。结果表明嗜温气单胞菌的外膜蛋白具有免疫保护性，能使小鼠抵御同种和不同表型种嗜温气单胞菌的攻击。这为研制气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗提供了理论依据。
庄培德[3]2007年在《嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆表达及其产物特性分析》文中指出从鳗源嗜水气单胞菌ZN1克隆到其主要粘附素基因(maior adhesin gene，Mah)。该基因开放阅读框为1074bp，编码357个氨基酸，推导的蛋白分子量为39.606kDa，前22个氨基酸残基构成一明显疏水信号肽。DNA序列分析比较表明ZN1主要粘附素基因与其它嗜水气单胞菌主要粘附素基因同源率约为70％，在系统进化树中，属于嗜水气单胞菌主要粘附素基因的一个新亚群。将Mah重组到pET-32a表达载体中并转化E．coliDE3(BL21)，获得高效表达。表达产物验证与功能分析结果表明：(1)ELISA结果显示鼠抗ZN1主要外膜蛋白血清能识别表达产物Mah-TrxA(硫氧还蛋白与主要粘附素形成的融合蛋白)及野生型菌株ZN1表达的主要外膜蛋白(含主要粘附素)，抗体滴度分别达到1∶3200和1∶12800；鼠抗Mah-TrxA融合蛋白血清可识别Mah-TrxA及野生型菌株ZN1表达的主要外膜蛋白，抗体滴度分别到达1∶12800和1∶1600；(2)免疫印迹显示鼠抗ZN1主要外膜蛋白血清能识别Mah-TrxA和野生菌主要外膜蛋白的相关条带；鼠抗Mah-TrxA血清可识别Mah-TrxA和其它5种不同血清型野生型嗜水气单胞菌主要外膜蛋白的相关条带；(3)Mah-TrxA的功能分析表明ZN1主要外膜蛋白、Mah-TrxA和兔抗Mah-TrxA血清能显着抑制或阻断菌ZN1粘附于EPC细胞的能力，但都不能完全抑制或阻断ZN1对EPC细胞的粘附；(4)以Mah-TrxA经腹腔免疫欧洲鳗鲡，接种30天后，免疫欧洲鳗鲡可抵抗1×10~7cfu野生型ZN1的攻击，免疫保护率达87.5％。以上结果表明：通过基因工程技术以融合蛋白形式表达的嗜水气单胞菌主要粘附素与野生菌株ZN1表达的主要粘附素生物学活性相类似，且具有良好的免疫原性，可诱导动物产生特异性抗体和免疫保护力；免疫印迹试验结果提示不同血清型嗜水气单胞菌主要粘附素的抗原性高度相关，主要粘附素可能是不同菌株之间的共同抗原成份。本研究成功地克隆、表达了嗜水气单胞菌Mah基因，较为系统地分析了表达产物的生物学特性和功能，进一步揭示了嗜水气单胞菌产生粘附作用的本质因素，以及主要粘附素在侵入宿主和诱导宿主产生免疫保护过程中的功能和作用，为嗜水气单胞菌病的有效防治提供有价值的研究资料。
胡萌[4]2012年在《江苏地区气单胞菌分离鉴定及强毒株生物学特性分析》文中认为气单胞菌(Aeromonas)广泛分布于自然界中,属于条件致病菌,有致病菌株和非致病菌株之分。致病菌株可引起多种水产动物的败血症以及畜禽和人类腹泻,尤其在水产养殖业上危害严重。为研究气单胞菌流行情况,从江苏部分地区淡水鱼养殖场采集样品530份,共鉴定出气单胞菌菌株202株(占38.1%)。基于看家基因gyrB测序,将202株菌株确定到种的水平,包括维氏气单胞菌(A. veronii),嗜水气单胞菌(A. hydrophila),温和气单胞菌(A. sobria),中间气单胞菌(A. media),豚鼠气单胞菌(A. caviae),简达气单胞菌(A. jandaei),杀鲑气单胞菌(A. salmonicida),异嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila),双壳类气单胞菌(A. bivalvium)和动物气单胞菌(A. bestiarum),检出率分别为69%,10%,11%,4%,2%,1%,1%,1%,0.5%和0.5%。维氏气单胞菌是最常见的种。高达70%(14/20)的嗜水气单胞菌从病鱼分离到的。选取气单胞菌的5种主要胞外毒力因子气溶素(aer)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、细胞毒性肠毒素(act)、温敏胞外蛋白酶(eprCAI)和丝氨酸蛋白酶(ahp),进行PCR检测。结果显示,alt和act检出率最高,分别为85%和87%,其它3种基因分别为aer(47%),eprCAI(44%)和ahp(51%)。来自水体、病鱼和健康鱼的菌株,5种毒力基因分布的差异没有统计学意义。202株中有201株被检测出至少有1种毒力基因。202株中,19株(9.4%)含有5种毒力基因,其中10株来自发病鱼,而且这10株中有9株被鉴定为嗜水气单胞菌。以斑马鱼为模型,对5种毒力基因均含有的菌株,进行LDso的测定,结果显示来自发病鱼的菌株,其LD5os明显低于来自健康鱼及水体的菌株。以上结果可以看出,不同来源的气单胞菌菌株,毒力基因携带率均较高,具有潜在的致病意义。采用ERIC-PCR和外膜蛋白SDS-PAGE两种分型方法对嗜水气单胞菌09-11年分离菌株及实验室保存菌株共54株进行分型。结果显示54株嗜水气单胞菌采用2种分型方法均能得到多态性较好的指纹图谱。ERIC-PCR能扩增出2至6个大小在600bp到4000bp之间的条带,把54株嗜水气单胞菌分为4群和8类,不同年代及地理位置分别有聚成一类的趋势。外膜蛋白SDS-PAGE显示出3至6个大小在22kD到51kD之间的条带,将54株嗜水气单胞菌分为4群和7类。两种分型方法均体现较好的分型能力,但相关性不明显。两种分型结果与菌株的致病力有一定的相关性。外膜蛋白分型相比ERIC-PCR分型,条带较少,重复性和稳定性更好,分辨力较高,但其操作比较繁琐,对于大量细菌分型往往需要较长的时间,可作为实验室对细菌分型的参考方法；ERIC-PCR分型快速简单,且具备其他分子分型不要求模板序列已知而直接进行扩增的优点,适用于大量嗜水气单胞菌的快速分型研究。在嗜水气单胞菌5种主要胞外毒力因子气溶素(aer)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、细胞毒性肠毒素(act)、温敏胞外蛋白酶(eprCAI)和丝氨酸蛋白酶(a助)检测基础上,选取含有5个毒力基因的3个代表菌株(NJ-35、XX-52、CS-43)和少1个ahp基因的菌株XY-16,进行生化试验、溶血性、溶蛋白性、主要外膜蛋白(MOMP)图谱分析及斑马鱼致病性试验。结果显示：4个菌株生化结果完全相同,均溶血、溶蛋白;NJ-35、XX-52、CS-43和XY-16的MOMP条带高度相似,与J-1株目比,蛋白条带更加清晰,说明J-1株相关条带蛋白浓度较低；NJ-35、XX-52、CS-43和XY-16菌体均能够产生致病作用,导致斑马鱼死亡,其LD50分别为1.5×102CFU/mL、1.3×103CFU/mL、2.5×103CFU/mL和6.9×102CFU/mL.说明4个代表菌株毒力较强,均属强毒株,特别是NJ-35的毒力最强。本试验为嗜水气单胞菌致病机制研究和疫苗研制提供了候选菌株。
王娜[5]2012年在《嗜水气单胞菌浮游态和生物被膜状态比较蛋白质组学及相关蛋白特性分析》文中认为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种重要的人-兽-鱼共患病病原。在自然环境中该茵大多以生物被膜形式存在,该存在形式作为一种同浮游细菌相对应的生长方式,在细菌的致病过程中发挥重要作用。现有的研究主要集中在嗜水气单胞菌生物被膜耐药性及疫苗方面,而毒力及生物被膜形成能力的关系以及生物被膜状态下与浮游态细菌蛋白表达差异的研究,国内外尚属空白。本研究观察了嗜水气单胞茵体外生物被膜的结构特征及形成过程,比较了生物被膜状态同浮游态细菌蛋白表达的差异,研究了生物被膜形成相关蛋白OmpAⅡ、FlaA、Omp38及LuxS勺生物学功能。1.嗜水气单胞菌生物被膜形成能力分析及其与毒力关系结合FITC-conA、FDA/PI荧光染色技术,对生物被膜的不同成分进行染色,利用荧光显微镜、扫描电镜及激光共聚焦显微镜观察不同时间生物被膜的结构特征及形成过程；同时将绿色荧光蛋白(GFP)表达载体导入嗜水气单胞菌,利用GFP标记技术示踪嗜水气单胞茵体外生物被膜的形成。结果显示,嗜水气单胞菌培养8h后聚集形成微菌落团,24h后生物被膜具有一定的厚度,且随时间延长,生物被膜厚度增加,死菌比例增加。气单胞茵不同分离株生物被膜的形成能力分析显示,86.7%(100/113)的气单胞茵菌株可形成生物被膜。通过选取生物被膜形成能力不同的菌株进行斑马鱼攻毒试验,结果表明生物被膜形成能力与菌株的致病性呈明显正相关。2.嗜水气单胞菌浮游态和生物被膜状态比较蛋白质组学研究利用比较蛋白质组学的方法,研究了嗜水气单胞菌J-1浮游态与生物被膜状态全菌蛋白及外膜蛋白的表达差异。结果表明,生物被膜状态下全菌蛋白中,17种蛋白表达上调,另有17种蛋白表达下调；而外膜蛋白中,11种蛋白表达上调,1种蛋白表达下调。采用嗜水气单胞菌鲫鱼感染血清与上述两种状态细菌的外膜蛋白进行免疫蛋白质组学分析,发现7种蛋白在两种状态均具有较强的免疫反应性,其中6种蛋白在生物被膜状态下表达升高,1种蛋白仅在生物被膜状态下具有免疫反应性。结果表明生物被膜状态下的细菌与浮游态相比,蛋白表达存在一定的差异,所鉴定的具有免疫反应性的蛋白作为疫苗侯选抗原,在抵抗嗜水气单胞菌持续性感染中具有较好的应用前景。3.嗜水气单胞菌主要外膜蛋白OmpAⅡ的生物学功能分析了嗜水气单胞菌生物被膜相关基因ompAII序列及其在252株不同气单胞菌中的分布,同时利用同源重组技术构建了ompAⅡ基因缺失株,通过比较野生株、缺失株的生物学特性,阐述主要外膜蛋白OmpAⅡ在嗜水气单胞菌致病过程中所发挥的作用。序列分析结果表明,基因ompAⅡ开放阅读框(ORF)为1002bp,编码333aa的主要外膜蛋白OmpAⅡ,该蛋白具有微孔蛋白超家族及OmpA蛋白家族的特性。基因ompAⅡ在嗜水气单胞菌中的分布率为83.3%(60/72)。ompAⅡ基因缺失株胞外产物溶血活性、溶蛋白活性及细胞毒性均有明显降低,生物被膜的形成能力也有所下降。此外,缺失株的黏附能力及抵抗巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力与亲本目比,分别降低了25%和33%,据此可以推测嗜水气单胞菌的OmpAⅡ可能与该菌的黏附有关。以上研究结果揭示主要外膜蛋白OmpAⅡ是嗜水气单胞菌重要的毒力因子,在嗜水气单胞茵对宿主细胞的黏附过程中发挥作用。4.嗜水气单胞菌鞭毛蛋白FlaA的生物学功能分析了嗜水气单胞茵生物被膜相关基因flaA序列及其在252株不同气单胞茵中的分布,同时利用同源重组技术构建了flaA基因缺失株,通过比较野生株、缺失株的生物学特性,阐述鞭毛蛋白FlaA在嗜水气单胞茵致病过程中发挥的作用。序列分析结果表明,基因flaA ORF为909bp,编码302aa的鞭毛蛋白FlaA.从FlaA进化途径上看,嗜水气单胞菌J-1株FlaA位于气单胞茵属FlaA第2群中。flaA基因在嗜水气单胞菌中的分布率为55.6%(40/72),与其他气单胞菌属细菌的鞭毛蛋白的同源性在88%-99%之间。flaA基因缺失株、互补株及野生株的生物学特性比较结果表明,毒力基因aer和vgrG3的表达下调为野生株的0.44和0.45倍,该菌株的溶血活性显着下降。此外,缺失株生物被膜的形成能力降低,为野生株的85%。flaA基因缺失株对HEp-2细胞的黏附能力降低了48%,其茵体和上清液对巨噬细胞RAW264.7的毒性作用分别降低了35%和55%。研究结果表明,鞭毛蛋白FlaA与细菌的黏附作用密切相关,且在生物被膜形成过程中发挥重要作用。5.嗜水气单胞茵外膜蛋白Omp38的生物学功能分析了嗜水气单胞菌生物被膜相关基因omp38及其在252株不同气单胞菌中的分布,同时利用同源重组技术构建了omp38基因缺失株,通过比较野生株、缺失株的生物学特性,阐述外膜蛋白Omp38在嗜水气单胞菌致病过程中发挥的作用。序列分析结果表明,基因omp38ORF为1074bp,编码357aa的微孔蛋白为Omp38,属于微孔蛋白超家族。omp38基因在嗜水气单胞菌中的分布率为,73.6%(53/72)。通过结晶紫染色、激光共聚焦显微镜观察发现缺失株生物被膜的形成能力显着增强,FITC-conA标记后荧光显微镜观察发现生物被膜多糖的产生能力显着增强。噬菌体敏感试验表明,omp38基因缺失株使噬菌体的增殖能力降低,推测Omp38可能是细菌表面噬菌体受体。omp38基因缺失后细菌的溶血活性及溶蛋白活性降低,可能与aer、ahe2、 emp的表达下调有关。omp38基因缺失株对HEp-2细胞的黏附能力、抵抗血清杀菌能力及抗巨噬细胞的吞噬能力均显着增强,分别为野生株的11.45、10和1.73倍,这可能与多糖的保护作用有关。同时缺失株细菌及上清液对巨噬细胞RAW264.7的毒性分别增加19%和10%。此外,缺失株Ⅵ型分泌系统(T6SS)的vgrG2基因表达上调为亲本株的3.4倍。上述结果表明omp38基因缺失可引起嗜水气单胞菌毒力增强。6.嗜水气单胞菌J-1株ompAⅡ和omp38双基因缺失株的构建及生物学特性分析利用接合转移技术在omp38基因缺失株的基础上构建了ompAⅡ-omp38双基因缺失株,并对缺失株与野生株的生物学特性进行了比较。结果显示,缺失株具有较好的遗传稳定性,生长能力显着增强。荧光定量PCR结果显示,缺失株毒力基因aer的表达量下调为亲本株的0.83,而ahe2、emp、hcp2、vgrG2的表达量上调为亲本株的1.60、1.49、1.71、4.46倍。缺失株溶血活性的降低及溶蛋白活性的增强,可能与其毒力基因aer表达量下调及ahe2、emp表达量上调有关。此外,ompAⅡ与omp38双基因的缺失使得细菌抵抗血清杀菌能力及细胞毒性增强,而对HEp-2细胞的黏附能力及对巨噬细胞RAW264.7抗吞噬能力则表现为降低。以上结果表明,双基因缺失株的特性并非是ompAⅡ及omp38单基因缺失株特性的简单加合。7.嗜水气单胞茵J-1株luxS基因缺失株的生物学特性分析群体感应(QS)系统luxS基因缺失后,细菌的生物被膜形成能力显着降低,这与QS系统在生物被膜形成过程中发挥的作用密切相关。荧光定量PCR结果显示,缺失株所有毒力基因表达均下调,其中aer、ahe2、emp、hcp2的表达量显着下调为亲本株的0.14、0.21、0.06、0.24倍,这与细菌溶血活性及溶蛋白活性显着降低相一致。缺失株对细胞的黏附能力及菌体、上清对细胞的毒性显着降低,分别为野生株的84%、85%、48%。以上结果表明,LuxS参与调控细菌的毒力,与细菌生物被膜的形成有关。8.嗜水气单胞菌Omp38重组蛋白的动物免疫效果评价嗜水气单胞菌重组蛋白Omp38抗血清可与76%(47/62)的不同血清型嗜水气单胞菌外膜蛋白反应,表明其是一种潜在的共同保护性抗原。将重组蛋白Omp38分别注射免疫小鼠、鳊鱼,评价其免疫效果。结果表明,小鼠免疫后灭活疫苗组(I组)及蛋白免疫组(II组)IgG抗体水平显着高于对照组(III组),第35d达到最高。腹腔巨噬细胞吞噬活性及脾淋巴细胞转化能力均呈增加趋势,与血清IgG抗体产生水平基本一致。免疫后42d脾脏淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+CD8所占比率最高,I组为65.17%、52.08%,II组为53.22%、39.58%。荧光定量PCR分析结果表明免疫后21d开始,免疫组淋巴细胞IFN-y及IL-4mRNA表达水平上调,35d达到最高。鳊鱼免疫后,灭活疫苗组(I组)及蛋白免疫组(II组)IgM抗体水平显着高于对照组(III组),21d达到最高,此时Ⅱ组抗体水平高于I组,之后一直维持在较高水平。各免疫组血清超氧化物歧化酶(SOD)活性在免疫初期变化较为明显,14d II组SOD活性显着高于Ⅲ组(P<0.05),21d时SOD活性达到最高。各免疫组血清溶茵酶(LSZ)活性在14d呈现较高水平,且Ⅰ组高于Ⅱ组(P<0.05),之后呈现波动且高于同时间点III组LSZ活性(P<0.05)。流式细胞仪及平板计数结果表明各免疫组鳊鱼头肾细胞吞噬活性显着高于Ⅲ组(P<0.05)。免疫保护试验显示,Ⅰ组、Ⅱ组小鼠分别获得了82.00%、58.82%的相对保护率；Ⅰ组、Ⅱ组鳊鱼分别获得了50.00%、57.14%的相对保护率.结果表明,重组蛋白Omp38能够有效地刺激机体产生体液免疫应答及细胞免疫应答,对小鼠及鳊鱼的嗜水气单胞茵感染具有较好的免疫保护效果.
任红梅[6]2009年在《黄鳝体表溃疡病病原菌的分离、鉴定和组织病理学观察》文中认为黄鳝是中国地区特有的温水性名贵经济鱼类,其市场价值和开发潜力巨大。近年来,在四川、湖北等地出现了一种严重危害黄鳝养殖的传染性疾病,其主要症状为:腹部皮肤发白溃疡,周围组织呈黑色,重者溃疡烂穿露出骨骼和内脏,伴有红肿出现。该病具有传染快、死亡率高等特点,给养殖业带来了巨大经济损失。本文通过细菌分离鉴定和分子生物学等方法首次鉴定了四川地区黄鳝体表溃疡病的病原菌,并进行了相关的药敏试验和人工感染黄鳝的组织病理学观察。从患体表溃疡病的黄鳝的肝、肠和肾中分离到致病菌株(hs-1),分离菌株通过肌肉注射、划痕浸泡等方式对黄鳝进行人工感染试验,出现了与自然病例相似的症状,证实该菌为黄鳝体表溃疡病的病原菌。分离菌对鲤鱼和泥鳅同样具有致病性。分离菌株在TSA平板上生长,菌落呈圆形、边缘整齐、中央微隆起、半透明或灰白色、光滑、湿润。该菌的生理生化特性为:革兰氏阴性短杆菌、单极生鞭毛、无芽孢、两端钝圆、单个或两个相连排列;有运动性,能利用葡萄糖产气,氧化酶、甘露糖、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、麦芽糖、明胶和V-P为阳性;七叶灵、水杨苷、H_2S为阴性。以该菌株的16S rDNA序列(GenBank编号为FJ461353)在RDP数据库进行在线Classifer,结果表明:该菌属于气单胞菌属。再将获得的序列与GenBank中已报道的的4株温和气单胞菌和6株嗜水气单胞菌的16S rDNA序列用DNAstar软件进行多序列比对分析和构建系统发育树,结果证实:该菌株与其他温和气单胞菌形成一个簇群,同源性高达98.3%。根据形态学、生理生化特性,并结合同源性分析结果,鉴定该分离菌为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。分离菌株对21种药物的药敏试验结果表明:该病原菌对头孢氨噻肟、头孢曲松钠、丙氟哌酸、洛美沙星、氟哌酸、壮观霉素、萘啶酸、四环素、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、头孢他啶等11种药物高度敏感;对头孢氨苄、利福平、链霉素、卡那霉素、红霉素、呋喃妥因、头孢拉啶等7种药物中度敏感;对氨苄青霉素、乙酰螺旋霉素、新生霉素等3种药物不敏感。对黄鳝人工感染分离菌株后的临床症状和病理变化进行了观察。感染黄鳝出现与自然发病黄鳝相似的体表溃疡症状,感染后12-36h为死亡高峰期。感染后9h开始出现明显的临床症状,黄鳝头肿大,腹部出现红斑块,肛门红肿外翻;感染后12h,腹部出现明显溃疡斑,身体扭转,开始出现死亡:感染后18h,黄鳝头部出血,腹部出现大小不等的溃疡斑、红肿,肛门红肿外翻。病理组织学变化以肝细胞变性;肠绒毛脱落,黏膜肌上有大量红细胞:肾小球结构消失,充满大量红细胞为主。感染后9-27h出现肝细胞索排列紊乱,肝细胞肿大并空泡化,部分肝细胞破裂:感染后3-30h小肠绒毛脱落,固有层淋巴小结增生,粘膜下层、肌层、浆膜层红细胞增多;感染后3-21h肾小管上皮细胞肿胀,严重颗粒变性,肾小球上皮细胞坏死,细胞核淡然,消失;感染后21-30h肌纤维细胞坏死,大量炎性细胞浸润。
罗志飞[7]2009年在《江苏地区嗜水气单胞菌分离鉴定、分子分型及弱毒株生物学特性分析》文中提出嗜水气单胞茵(Aeromonas hydrophila)普遍存在于淡水、土壤、人畜粪便等各种环境中,有致病菌株和非致病菌株之分。致病菌株可引起多种水产动物的败血症以及畜禽和人类腹泻,尤其在水产养殖业上危害严重。因此,了解嗜水气单胞茵的流行情况及流行菌株的致病性就显得格外重要。为了研究嗜水气单胞菌在江苏地区的流行情况,从水体环境和鱼体中共采集样品169份,其中分离鉴定出嗜水气单胞菌菌株41株(占24.3%),说明该菌在自然环境中分布广泛,水体和鱼中均有分布。选取嗜水气单胞茵的5种主要胞外毒力因子气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、和细胞兴奋性肠毒素(alt)、温敏胞外蛋白酶(eprCAI)、丝氨酸蛋白酶(ahp),设计并合成5对引物,对41株分离株进行PCR检测,了解嗜水气单胞菌毒力因子的分布情况。结果显示aer和ahp的检出率较高,分别为80.5%和78.0%；act和alt的检出率为65.9%和61.0%；eprCAI的检出率最低,为39.0%；5种毒力因子均含有的占17.1%,均不含有的占4.88%。可见气溶素和丝氨酸蛋白酶在嗜水气单胞菌分布非常广泛,是最主要的毒力因子之一,而温敏胞外蛋白酶则在嗜水气单胞菌中分布较少,且大部分分离株能检测出毒力因子。从以上结果可以看出嗜水气单胞茵的毒力因子分布较广,具有潜在的致病性。采用ERIC-PCR和RAPD两种分型方法对嗜水气单胞菌09年分离菌株及实验室保存菌株共84株进行基因分型。参考相关文献设计并合成引物,分别进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳。电泳结果经Quantity One软件数值化后利用SPSS软件进行聚类分析。结果显示84株嗜水气单胞茵均能得到多态性较好的指纹图谱。ERIC-PCR能扩增出4至16个大小在100bp到5800bp之间的条带,把84株嗜水气单胞菌分为4群和17类,不同年代,不同地理位置分别有聚成一类的趋势。RAPD两种不同引物能扩增出1至12个大小在200bp到4500bp之间的条带,分别把84株嗜水气单胞菌分为4群、12类和3群、19类。两种分型方法均体现很好的分型能力。但ERIC-PCR分型相比RAPD分型,重复性和稳定性更好,分辨力更高,且具备RAPD不要求模板序列已知而直接进行扩增的优点,更适合嗜水气单胞菌的分型研究。在嗜水气单胞菌的5种主要胞外毒力因子气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、和细胞兴奋性肠毒素(alt)、温敏胞外蛋白酶(eprCAI)、丝氨酸蛋白酶(ahp)检测基础上,选取毒力基因少的3个代表菌株(NJ-4、NJ13、CS-13)进行溶血性、溶蛋白性、细胞毒性的测定、粘附试验、主要外膜蛋白(MOMP)图谱分析及斑马鱼致病性试验。结果显示：3个菌株均不溶血、不溶蛋白；NJ-4和CS-13均不使细胞产生病变,NJ13能致细胞病变；NJ-4没有细胞粘附能力,NJ13、CS-13则有一定的细胞黏附能力,但与强毒株BSK-10相比,黏附能力较弱；NJ4Y、CS-13的MOMP条带与BSK-10相似度很高,而与NJ13有一定差别；NJ-4、NJ13和CS-13的上清均不致斑马鱼死亡,但菌体能够产生致病作用,导致斑马鱼死亡,其LD50分别为2.6×107CFU/mL、7×106CFU/mL和1.22×107CFU/mL。说明3个代表菌株毒力较弱,均属弱毒株,特别是NJ-4的毒力最弱。由于NJ-4不含上述5种毒力基因,NJ13只含有ahp基因,CS-13仅具备aer基因,而致病性上,NJ-4较另2株毒力更弱,且不具有粘附性,说明毒力基因的携带率与致病性具有一定的相关性。
牟巧凤[8]2012年在《四川地区斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌分子流行病学调查》文中认为维氏气单胞菌是一种条件致病菌,普遍存在于海水、淡水和污水等环境中,河水及海产品中均能检出维氏气单胞菌,它能够引起人类的化脓性关节炎、腹泻和败血症等疾病,在水产养殖动物方面,可以引起泥鳅、中华绒螯蟹、锦鲤等死亡,造成巨大的经济损失,严重危害我国渔业及水产业的发展。现有斑点叉尾(?)维氏气单胞菌感染的研究报道集中在病原的分离鉴定上,而关于维氏气单胞菌引起斑点叉尾(?)疾病的流行病学资料匮乏。流行病学作为研究疾病分布规律及影响因素的一门学科,为探讨疾病病因,制订疾病防控对策提供重要参考资料。本研究旨在对四川省斑点叉尾(?)维氏气单胞菌病进行的流行病学调查,为临床诊断该病原菌和进行分子流行病学检测提供可靠的方法,为维氏气单胞菌病的预防和控制提供科学的理论依据。采集来自四川不同地区自然发病的斑点叉尾(?),采用TSA培养基,对细菌进行分离培养与纯培养、菌落形态特征及理化特性等表型特征鉴定,同时进行16S rDNA基因序列的测定、分析相关细菌相应序列的同源性和构建系统发生树；结合表型特征鉴定结果及细菌发育学分析的结果进行分离菌的种属判定,并在此基础上采用ERIC-PCR和AFLP对维氏气单胞菌(39株)进行基因分型,确定引起四川省斑点叉尾(?)爆发性流行性疾病发生的主要流行菌株的基因型。对四川省眉山、绵阳、攀枝花等7个地区自然发病的斑点叉尾(?)进行细菌的分离鉴定,根据细菌的生物学特性,并结合16S rDNA检测结果建立系统发育树,确定分离得到了25株维氏气单胞菌。通过ERIC-PCR对本次分离25株和实验室保存的14株维氏气单胞菌(13株分离自斑点叉尾(?),1株标准菌ATCC35604)进行基因分型,结果显示以相似系数0.77为分界点,39株维氏气单胞菌分为7个基因型,其中48.7%的菌株表现为基因Ⅰ型,7.4%的菌株表现为基因Ⅱ型,5.1%的菌株表现为基因Ⅲ型,第四类群Ⅳ型和第五类群Ⅴ型都只包含一株菌株,显示出与别的菌株有较大的遗传差异；第六类群Ⅵ型包含了4株菌株；第七类群Ⅶ型包含了剩下的9株菌株,约占总菌株数的23%。基因Ⅰ型为四川省维氏气单胞菌的主要流行型,分布于眉山、德阳、绵阳、简阳和成都5个地区。此外,不同地区维氏气单胞菌菌株的基因型差异明显,主要以一种基因型为主,交叉有少数其他基因型。通过AFLP技术对维氏气单胞菌进行基因分型,结果显示以遗传相似系数0.67为分界点,39株维氏气单胞菌分为9个基因型,其中第四类群Ⅳ型包含了14株菌株,约占总菌数的35.9%,第五类群V型包含7株菌株,占了总菌数的17.9%,第六类群Ⅵ型、第八类群Ⅷ型和第九类群Ⅸ型依次占了总菌数的15.4%、7.7%和12.8%,其余的第一类群Ⅰ型、第二类群Ⅱ型、第叁类群Ⅲ型和第七类群Ⅶ型都只含有一个菌株。同一聚类群内的菌株的相似系数都在95%以上,亲缘关系较近。不论是ERIC-PCR优势基因型,还是AFLP优势基因型均达到30%以上,说明维氏气单胞菌以一种基因型为主要流行型。维氏气单胞菌的遗传聚群既有一定的地域性,同时也表现出多样性特征,只有少数地区的基因型单一。
刘玮[9]2012年在《嗜水气单胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达》文中研究指明嗜水气单胞菌的外毒素、胞外蛋白酶、S层蛋白和外膜蛋白是其重要的毒力因子。气溶素类外毒素HEC对同型和异型的嗜水气单胞菌的攻击均显示出极显着的保护作用。而溶血素作为嗜水气单胞菌气溶素类外毒素之一，广泛存在于嗜温气单胞菌中，其减毒基因工程亚单位疫苗实验室试验有很高的保护率。外膜蛋白基因是嗜水气单胞菌重要的粘附因子和保护性抗原，不但能激发机体的包括体液免疫在内的多种免疫机制，还可以与不同血清型该病原菌产生免疫交叉反应。本文在完成外膜蛋白基因原核表达及多克隆抗体制备的基础上，进一步尝试了对外膜蛋白基因和溶血素基因的融合表达。结果如下：（1）以嗜水气单胞菌BYKAH2008AC的基因组DNA为模板，PCR扩增得到嗜水气单胞菌的OmpTS基因和Hly基因的ORF区，各包含335个和461个氨基酸残基，编码37kD和52kD的蛋白。（2）同源性分析显示BYKAH2008AC的OmpTS基因编码的蛋白与嗜水气单胞菌外膜蛋白的同源性为95.9%，且与多株嗜水气单胞菌的粘附素同源性都高达97%以上，而BYKAH2008AC的Hly基因编码的蛋白除与J1，HA7，GA1，BA17等多株嗜水气单胞菌的溶血素同源性为99%以上外，其与气溶素的高度同源性也说明了二者存在共同抗原表位的可能。（3）通过构建重组表达质粒pET32a-OmpTS-Hly，采用大肠杆菌BL21对融合基因进行了诱导表达及蛋白纯化（4）以表达的融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，兔抗OmpTS-Hly重组融合蛋白多克隆抗体经ELISA测定效价为1：40000。同时以His-tag多抗为对照，Western blot结果验证了该重组融合蛋白的抗原性，为探索其作为基因工程亚单位疫苗的候选成分的可能性提供了理论依据。
吴亚锋[10]2015年在《南京地区气单胞菌的分离鉴定及嗜水气单胞菌菌株分型研究》文中研究表明气单胞菌(Aeromonas)在水生生态系统中无处不在,存在于新鲜的河口水、地表水、污水、健康或患病鱼、食品、动物和人类粪便中,能够引起人和鱼类的感染。气单胞菌属是众所周知的鱼类条件致病菌,在应激条件下,如水温增加、水质不佳等,是疫情爆发的主要原因。为了确定南京市某渔场发病鱼感染的病原,本试验采集患鱼脏器,采用平板培养、生化实验和种特异性gyrB基因扩增测序等方法进行细菌的分离鉴定;利用PCR技术检测分离株毒力基因的分布,分析其生物学特性,并进一步通过动物试验确定菌株致病力。结果分离到1株水族箱气单胞菌,命名为LK13-25。该菌株携带5种主要毒力基因:气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(aact)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、温敏胞外蛋白酶(epr)和丝氨酸蛋白酶(ahP),溶血性和溶蛋白能力较强,对斑马鱼的半数致死量为1.02×103CFU/尾,确定为强毒株。进化树分析表明,水族箱气单胞菌与嗜水气单胞菌达卡亚种亲缘关系较近。本研究在国内首次报道发现水族箱气单胞菌,为进一步预防该菌所引起的相关疾病的发生和传播提供理论基础。为调查南京地区渔场的气单胞菌感染情况,于2013年10月至2014年10月,从发病、健康水生动物及水体环境中采集163份样品,采用平板培养和特异性gyrB基因扩增测序等方法进行细菌的分离鉴定;利用PCR技术检测分离株6种主要毒力基因act、alt、epr、ahp、ascV的分布;通过动物试验确定部分菌株致病力。结果显示,共鉴定出气单胞菌菌株147株,主要菌种为维氏气单胞菌(A.veronii)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila),检出率分别为46.3%和34.7%;毒力基因中,除ascV之外,检出率都在50%以上,最高为94.6%,最低为68.0%;以斑马鱼为模型,对不同种的气单胞菌进行LD50的测定,结果显示嗜水气单胞菌的LD50明显高于其他种。以上结果可以看出,气单胞菌在南京地区渔场环境中广泛分布,并且含有多种毒力基因,具有潜在的公共危害,尤其以嗜水气单胞菌需要更多的关注。为了解嗜水气单胞菌分离株的O抗原情况,对所有已知嗜水气单胞菌O抗原基因簇进行分析,筛选出共同存在的单糖合成基因rmlA、rmlC和rmlD,对嗜水气单胞菌新分离株及实验室原保存菌株共71株进行分型,最后用MLST方法对部分菌株进行分类比较。结果显示,71株嗜水气单胞菌中共能检出57株与已知相一致的O抗原基因簇型,其中与中国流行菌株NJ-35和美国流行菌株ML09-119 O抗原基因簇相一致的菌株所占比重比较大,分别为56.14%(32/57)和33.33%(19/57)。比对MLST分析结果,除CS-43、JH-17株之外,NJ-35和ML09-119O抗原基因簇型的菌株都属于ST251和ST328,而两个型的菌株在斑马鱼致病性试验中都为强毒株,说明嗜水气单胞菌O抗原单糖合成相关基因与菌株的致病力有一定的相关性。研究结果显示,江苏地区的嗜水气单胞菌的流行株的O抗原基因簇型为NJ-35型和ML09-119型,O抗原基因簇相关基因分型方法可以作为一种新的分子分型方法应用于嗜水气单胞菌的流行病学调查中。综上所述,本研究对南京地区的气单胞菌感染情况进行了调查,并在国内首次分离到水族箱气单胞菌,同时对71株嗜水气单胞菌进行O抗原基因分型,研究结果为开展气单胞菌感染的流行病学调查和防控奠定了基础。
参考文献：
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