厦门市海沧医院
摘要：
目的: 探讨姜黄素对小鼠H22肝癌移植瘤模型的作用机制及其机理。方法: 培养肝癌H22细胞并构建小鼠H22肝癌模型，并分为四组（姜黄素组，5-氟尿嘧啶组，联合治疗组，对照组）。分别使用Western Blotting方法和四甲基偶氮哩蓝(MTT)法检测模型癌组织血管内皮生长因子(VEGF)表达以及测定姜黄素对H22肝癌细胞的抑制率。结果: 姜黄素组和5-氟尿嘧啶组相比对照组，肿瘤组织重量，体积显著减小( p < 0. 05)，两两之间均有统计学差异；Western Blotting结果显示对照组VEGF蛋白表达灰度值为：6.78 ± 1.03，联合治疗组灰度值为2.21 ± 1.17，5-氟尿嘧啶组和姜黄素组灰度值分别为4.39 ± 2.14和4.48 ±1.49。和对照组相比，其余三组灰度值均减低（p ＜0.05）；联合治疗组灰度值明显低于姜黄素，5-氟尿嘧啶组（p ＜0.05）；姜黄素组、5-氟尿嘧啶组和联合治疗组对小鼠H22肝癌细胞的抑制率均高于对照组，两两之间均有统计学差异( p < 0. 05 )。结论: 姜黄素能抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长，可能的机制是姜黄素减少了肿瘤组织的VEGF的表达。
关键词：姜黄素 H22肝癌移植瘤 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子
Abstract
Objective：To observed therapeutic effect of curcuma on mice transplanted from H22 hepatocellular carcinoma and its mechanism. Method: Construction of liver cancer mouse model and culture of H22 cells, then split into 4 groups, each group of 25. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in cancer tissues was observed by western blotting; The inhibitory rate of curcumin on H22 hepatoma cells was determined by MTT assay using tetramethylazo blue (MTT) method. Results: Curcumin group and 5 - fluorouracil group compared with the control group in the tumor tissue weight, volume was significantly reduced (p <05); The expression of VEGF protein in the control group was 6.78 ± 1.03, the gray value of the combined treatment group was 2.21 ± 1.17, the gray values of 5 - fluorouracil group and curcumin group were 4.39 ± 2.14 and 4.48 ± 1.49, respectly. The inhibitory rate of curcumin group, 5-fluorouracil group and combination therapy group on mice H22 hepatocellular carcinoma cells was higher than that of control group, respectively. Conclusion: Curcumin can inhibit the growth of H22 hepatocellular carcinoma in mice. The probable mechanism is the case that curcumin reduces the expression of VEGF in tumor tissue.
Key words: Curcumin H22 Hepatocellular carcinoma Transplantation Vascular endothelial growth factor VEGF
原发性肝癌是中国常见恶性肿瘤之一。是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位，在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌[1]。肝癌的发病机制有与多种因素相关,目前已知的相关因素包括肝硬化、乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、微环境刺激因素作用下由肝细胞基因组积累的突变、糖尿病、miRNAs参与、黄曲霉毒素污染食物的摄入等[2, 3]。其中，肝癌和肿瘤内新生的血管生成的关系是个新的研究热点[4]。研究已经证明肿瘤生长、转移过程中,需要有新生血管的参与,而VEGF和Ang-2是其中主要的血管生成因子。已有研究证实将高表达VEGF和Ang-2基因的小鼠BNL肝癌细胞注射到小鼠体内,发现肿瘤生长速度明显快于单纯高表达VEGF组和单纯高表达Ang-2组[5]。
姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中，姜黄约含3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物[6]。现代研究发现姜黄素可以抑制炎症反应具有抗氧化、抗类风湿、抗肿瘤、抗突变作用,其抗瘤作用机制不但与诱导肿瘤细胞凋亡相关,抗血管生成也是姜黄素抗肿瘤机制之一,主要作用为抑制血管内皮细胞增殖并促进其凋亡；抑制血管生成促进因子的表达,如通过抑制血管内皮生成因（VEGF）及其对应受体[7]。那么我们大胆假设，应用姜黄素可能会对肝癌或者肝癌细胞有一定抑制作用。
本项目通过观察姜黄素对小鼠肝癌H22细胞移植瘤模型的治疗效果，检测小鼠H22肝癌移植瘤中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平，并利用四甲基偶氮哩蓝(MTT)法测定姜黄素对H22肝癌细胞的抑制率实验研究，并初步探讨姜黄素抑制肝癌生长的可能机制，从而探索治疗肝癌的新途径。
1 材料方法
1.1 实验动物选用雄性昆明种小鼠100只，分为4组，每组25只。6-10 w，体重20±5 g，分笼饲养，室内恒温（18-24℃）。
1.2 实验细胞株：小鼠肝癌H22细胞株（购自北京百欧博伟生物技术有限公司，平台编号：bio-73282）
1.3 主要试剂，药品和仪器
（1）姜黄素注射液(中大恒源公司，规格5g/支)。（2）5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司，国药准字H12020959；规格:10 ml：0.25 g)（3）二甲亚砜（广州化学试剂厂）（4）小牛血清（杭州四季青公司）（5）RPMI-1640培养基（Gibco公司）（6）VEGF兔抗小鼠一抗、羊抗兔二抗抗体试剂盒（武汉博士德公司）（7）免疫组织化学试剂盒（福州迈新公司）。（8）全自动酶标仪（瑞士哈美顿公司）（8）甲基偶氮哩盐( MTT)（美国Sigma公司）。
2.方法
2.1肝癌动物模型建立
取对数生长期小鼠肝癌H22细胞，12000g，3min收集细胞，PBS缓冲液洗涤重悬制成单细胞悬液，台盼蓝染色测定活细胞率＞90%，用0.5 mL一次性注射器将细胞悬液注射入小鼠腹部皮下，每天测量肿瘤大小和体积，待肿瘤长至＞500mm后，认定造模成功，随后进行药物对照实验。
2.2 姜黄素和5-氟尿嘧啶对小鼠肝癌模型的治疗效果
（1）小鼠共分为4组，每组25只。姜黄素组，5-氟尿嘧啶组，联合治疗组，阴性对照组。
（2）姜黄素组每次2ml，每天一次；5-氟尿嘧啶组，每次1ml，每天一天；联合治疗组姜黄素，5-氟尿嘧啶各2ml，一次，阴性对照组，每次PBS 1ml，每天一次。每组均连续注射给药5天。随后，处死一半数量的小鼠，切除肿瘤组织置于-70℃冻存，等待下一步Western Blotting检测。另外一半处死小鼠的肿瘤组织切除后置于4%甲醛固定、组织脱水、石蜡包埋，以2μm厚度切片，用于免疫组织化学检查。
2.3 四甲基偶氮哩蓝(MTT)法测定姜黄素对H22肝癌细胞的抑制率实验：分为对照组(PBS)、姜黄素组(10 mol/L)，5-氟尿嘧啶组(100mol/L)和联合治疗组〔姜黄素联合5-氟尿嘧啶治疗）。每组在加样时候设3个复孔，H22肝癌细胞离心后，重新吹打悬浮，每孔加入200 ul重悬液，配制浓度的MTT （浓度为5mg/mL） 37℃孵育48h，3000g/min离心弃上清后每孔150ul加入。震荡15 min混匀，用全自动酶标仪测定吸光度。细胞抑制率计算公式：（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。
2.4 小鼠肝癌移植瘤组织中VEGF蛋白的Western Blottin检测。
（1）切除肿瘤组织。（2）冰PBS缓冲液洗3次，剪碎至最小块，置入匀浆器，加入组织裂解液，冰浴匀浆30min，4℃条件下离心，取上清，采用Braford法测定蛋白质浓度，总蛋白35μg上样量进行SDS - PAGE电泳分离蛋白。（3）电转到（PVDF）膜上。（4）PVDF膜在含5% BSA的TBST溶液中封闭过夜。（5）用VEGF兔抗小鼠抗体及内参一抗40℃孵育过夜。（6）然后用TBST洗涤10 min 3次。（7）加如二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，室温孵育90min，再次洗涤10 min 3次，增强化学发光显色液暗室显影，曝光处理后进行灰度值计算，以目的蛋白和内参蛋白β-actin灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
3. 统计学方法
采用SPSS（19.0）统计分析软件，用描述性统计分析所获得的统计数据， 通过使用Pearson Chi-Square检验或Fisher精确检验分析分类变量，用Image proplus 软件分析Western blotting结果。P<0.05为差异有统计学意义。
4. 结果
4.1 姜黄素对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗效果。
待小鼠移植瘤长至约500mm3后开始治疗，4组小鼠给药后5d内均无死亡。比较最终肿瘤体积、最终瘤重之间的大小。姜黄素组和5-氟尿嘧啶组相比对照组，他们之间差异（肿瘤组织大小，体积）有显著统计学意义(P < 0. 05)。姜黄素组和5-氟尿嘧啶组相比，肿瘤组织大小，体积）有显著统计学意义(P < 0. 05)。见表1所示。
5.讨论
姜黄素是姜黄中提取的一种植物多酚,也是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分之一。目前姜黄素对于肝癌的抑制作用机制多有研究，如有学者报道，其抑制机制与诱导肝脏肿瘤细胞凋亡有关[8]，也有报道与信号传导与转录激活因子3及其磷酸化形式表达的影响有关[9]。甚至和原发性肝癌组织中肝星状细胞活性高低有关[10]。但是关于姜黄素影响肝癌组织中新生血管生成的报道尚不多见，所以，本研究从分子生物和蛋白机制方向对姜黄素对肝癌组织的影响进行了对照研究。
VEGF在肝癌组织和癌旁组织的表达远高于正常组织[11]，VEGF能诱导新生毛细血管的形成，促进肿瘤持续生长以及肿瘤基质的形成，是目前所知最强的血管活性物质[12]。
H22肝癌细胞瘤小鼠经腹腔注射药物治疗后，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组的最终肿瘤体积、最终瘤重均比对照组小，但都明显大于联合治疗组的肿瘤体积、最终瘤重。这与其他学者报道类似[13]。这充分说明，姜黄素对治疗肝癌有一定的作用。可能的机制是姜黄素抑制肿瘤新生血管的形成、并有抗炎、抗氧化作用。Western Blotting检测小鼠肝癌移植瘤组织中的VEGF蛋白表达量，发现姜黄素组和联合治疗组的VEGF蛋白相对表达量均低于对照组。其他学者报道姜黄素可显著抑制HGF诱导内皮细胞发生迁移、小管形成及VEGF的表达[14]，这与我们结果类似。
本研究MTT法检测姜黄素对H22肝癌细胞的生长抑制率，结果显示，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组对小鼠H22肝癌细胞的抑制率均高于对照组;联合治疗组对小鼠H22肝癌细胞的生长抑制作用最强。国内徐等报道低剂量的姜黄素对H22肝癌细胞无毒性,但可诱导其细胞膜异位表达CRT[15]。金等报道5-氟尿嘧啶对小鼠肝癌H22细胞有明显地抑制增殖和诱导凋亡作用[16]。这与我们研究结果类似。可能的解释是在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶转化为胸苷酸，而干扰DNA的合成。氟尿嘧啶同样可以干扰RNA的合成[17]。
本研究通过治疗实验证实姜黄素能抑制肝癌H22小鼠移植瘤的生长，姜黄素联合5-氟尿嘧啶对肝癌H22小鼠移植瘤的抑瘤作用明显好于对照组、姜黄素组和5-氟尿嘧啶组，提示姜黄素不仅能抑制H22肝癌细胞的增殖，而且和5-氟尿嘧啶有协同效果。本研究结果为姜黄素在肝癌治疗的作用提供了初步的理论基础。其具体机制需要进一步探索研究。
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论文作者:潘梓荣 廖伟家 蔡哲臻 纪程宏 郭东来 姜燕
论文发表刊物:《医师在线》2017年10月上第19期
论文发表时间:2017/12/19
标签：姜黄论文; 肝癌论文; 小鼠论文; 细胞论文; 肿瘤论文; 抑制论文; 尿嘧啶论文; 《医师在线》2017年10月上第19期论文;