刘新锐[1]2008年在《Pleurotus属食用菌种的分子鉴别技术研究》文中指出Pleurotus属是一类分布广泛的且具有食、药用价值的木腐生真菌,近年来侧耳的生产发展很快,种类较多但分类较为混乱。因此建立一套侧耳属种的鉴定技术具有重要意义。本研究利用ITS序列及ITS-RFLP分析,对福建省食用菌种质资源保藏管理中心的Pleurotus属12种食用菌、559个菌株进行分子鉴别技术研究,清除了同种异名和同名异种的菌株,并建立了侧耳属生物学种的鉴别技术。具体结果如下:1、供试侧耳的ITS区(含ITS 1,5.8S rDNA和ITS 2)序列的长度范围为630-667bp,其中肺形侧耳为630bp,红平菇为667bp。根据ITS序列,Pleurotus属12种食用菌分为鲍鱼菇、金顶侧耳、红平菇、虎奶菇、肺形侧耳(凤尾菇和秀珍菇)、杏鲍菇、白灵菇(白灵菇和阿魏蘑)和糙皮侧耳(小平菇和平菇)8类,与报道的生物学种相符。高温平菇是一个无效种。2、使用了AluⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、HaeⅢ、MaeⅠ、Sau3AⅠ、SphⅠ七种酶,对Pleurotus属12种食用菌、585个菌株酶切分析,有效的清理了混乱菌株。ITS-RFLP分析结果和部分菌株出菇的子实体相吻合。建立了以ITS大小,AluⅠ、HaeⅢ、MaeⅠ酶切的侧耳属生物学种鉴定技术。3、利用建立的侧耳属生物学种鉴定技术,对7个可能是侧耳属菌株进行ITS大小,AluⅠ、HaeⅢ、MaeⅠ和DraⅠ酶切分析,得到5个是侧耳属的菌株,2个非侧耳属的菌株。经ITS序列分析,证实ITS-RFLP鉴定的准确性,表明ITS-RFLP可用于侧耳属种的鉴定。4、本研究采用ITS序列及ITS-RFLP技术,对侧耳属的12个种亲缘关系进行了研究,结果表明,鲍鱼菇、金顶侧耳、红平菇和虎奶菇等与其它侧耳的亲缘关系较远。鲍鱼菇和囊盖侧耳,金顶侧耳与白黄侧耳,红平菇和桃红侧耳,凤尾菇、秀珍菇和肺形侧耳,糙皮侧耳和佛罗里达,分别是同一个种的不同名称。ITS-RFLP有很好的稳定性和重复性,对侧耳属菌株种性的快速鉴定具有指导意义。
曹鸿雁[2]2009年在《黑木耳等9种食用菌的种质资源分子鉴定》文中认为本研究利用ITS序列及ITS-RFLP分析,分别对福建省食用菌种质资源库(福建农林大学菌物研究中心)保藏的灰树花、滑菇、黄伞、桑黄、姬松茸、猴头菇、虫草、黑木耳和毛木耳9个种进行了鉴定分类,清除了同名异种的菌株,并初步建立了各相关生物学种的鉴别技术。具体结果如下:1.选用了HhaⅠ、HaeⅢ和DraⅠ叁种酶对32个灰树花菌株进行酶切片段多态性综合分析,发现Gr0004菌株的酶切片段不一样。通过测序,并与本实验室鉴定的侧耳属菌株杏鲍菇序列进行比对,判定其为一株杏鲍菇菌株。2.选用了NruⅠ和NcoⅠ两种酶对鳞伞属滑菇和黄伞菌株进行酶切片段多态性综合分析,发现种内菌株间酶切片段一致,而属内种间差异较大。这两种酶可以很好的将两者区分开;另外,ITS-RFLP分析结果和滑菇菌株出菇的子实体相吻合。3.采用拮抗实验及ITS序列分析,对6株桑黄菌进行了鉴定分类研究。拮抗实验结果表明,Ph.l 0001、Ph.l 0003、Ph.l 0003+1和Ph.l 0005与桑黄菌(Phellinuslinteus)菌落形态一致;Ph.l 0002和Ph.l 0004与其它菌株间拮抗线非常明显,其他菌株之间的拮抗线相对弱些;而ITS序列比对分析结果表明,Ph.l 0001、Ph.l0003、Ph.l 0003+1和Ph.l 0005 ITS序列比对相似性为99.86%,但Ph.l 0002和Ph.l 0004菌株之间及与其他菌株间均存在很大差异。通过试验,判定Ph.l 0001、Ph.l 0003、Ph.l 0003+1和Ph.l 0005为桑黄菌(Phellinus linteus);Ph.l 0004为Phellinus pini;而Ph.l 0002与Phellinus badius虽有一定的相似性(95%),但不能确定其具体种性。4.供试的27株姬松茸菌株扩增的ITS片段长度呈现多态性。根据ITS大小初步分成叁类,一类是姬松茸;一类是曲霉属;一类初步判定是真姬菇。通过序列比对,选用了HaeⅢ和XbaⅠ对14个姬松茸菌株进行酶切分析,各菌株的酶切结果一致,表明14个姬松茸菌株种性一致,为同属同种品系,无差异性。5.根据本实验室对猴头菇种质资源遗传多样性研究结果,选择了H0003和H0029这两个遗传差异大的猴头菌菌株进行ITS克隆测序。选用BamHI对猴头菌进行了酶切分析,酶切结果与酶切分析不一致;后经酶切时间、酶切所用酶量的多次验证还是出现同样的结果。通过进一步的酶切转化子、克隆测序,初步判定猴头菌rDNA核基因组内可能至少存在两种ITS序列类型。6.通过对虫草属菌株ITS序列进行比对选用了ApaⅠ、HaeⅢ和AluⅠ叁种酶对虫草属的18个菌种进行了鉴定分析。结果表明,18个虫草属菌株可以分为叁类,一类为Cordyceps属;一类为Tolypocladium属;一类为Gibberella属。7.对102个黑木耳菌株的ITS区域进行了PCR扩增和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析,选用HaeⅢ、MspⅠ、XbaⅠ和HpaⅠ四种酶对所有菌株进行了鉴定分类研究。ITS-RFLP研究结果表明,HaeⅢ、XbaⅠ和HpaⅠ可将黑木耳中混有的其他菌种区分开,而MspⅠ不能很好地将菌种进行区分;通过进一步测序比较,判定Au.a 0004、Au.a 0005、Au.a 0050、Au.a 0051、Au.a 0052、Au.a 0077菌株为毛木耳菌株;分子鉴定结果与栽培实验结果是一致的。然后,选用HaeⅢ、XbaⅠ和HpaⅠ叁种酶对60株毛木耳菌株进行鉴定分类,发现Au.p 0038不是毛木耳菌株,而是黑木耳菌株。另外,HpaⅠ酶切黑木耳电泳结果与酶切分析结果不一致,通过进一步的酶切转化子、克隆测序,表明黑木耳rDNA核基因组内可能存在不同的ITS序列。
曹宏卿, 顾为望[3]2005年在《FMMU白化豚鼠线粒体DNA RFLP分析研究》文中提出目的研究FMMU白化豚鼠的mtDNA,并与花色豚鼠mtDNA进行多态性分析比较,以确定其独特的生物学特性是否与mtDNA相关。方法用碱变性法提取FMMU白化豚鼠以及花色豚鼠的mtDNA,并用AvaⅠ、BalⅠ等12种限制性内切酶进行酶切和限制性片段长度多态性分析。结果与结论FMMU白化豚鼠mtDNA和花色豚鼠mtDNA的相对分子质量相同,约为16.7×103;FMMU白化豚鼠与花色豚鼠两品系的mtDNA经AvaⅠ、BalⅠ等内切酶酶切后有3-8个酶切位点,酶切图谱完全相同,经RFLP分析FMMU白化豚鼠与花色豚鼠的mtDNA之间缺乏多态性。本实验没有发现FMMU白化豚鼠的独特的生物学特性与mtDNA相关。
王庆璨[4]2015年在《南京几种植原体病害的鉴定及铜钱树丛枝病植原体致病机理的初步研究》文中研究指明植原体原称类菌原体(MLO),属原核生物界柔膜菌纲,专性寄生于植物韧皮部的筛管细胞,主要通过取食植物韧皮部汁液的昆虫传播,难以进行人工体外培养。故传统上依赖于微生物表型特征与生理生化特性等的分类方法难以应用到植原体中,使得其检测及分类多依赖于分子生物学手段。利用高度保守基因16S rDNA进行PCR检测分析是目前国际上用于植原体分类研究的主要方法,基于该基因序列的PCR测序分析与PCR-RFLP分析已经作为植原体初步分类体系被广泛接受并应用。随后,相对不及16S rDNA保守的基因,如rp、tuf、secA、secY等基因也逐渐被应用于亲缘关系较近的植原体亚组和株系之间的分类研究中。本文主要基于以上基因并利用分子生物学手段对南京部分地区几种疑似植原体病害的病原进行了分子检测与鉴定,为进一步研究病害的发生规律、传播特点及综合防治等提供了理论基础。本研究首先利用DAPI染色方法初步观察植原体在植物体内的分布特点,在患病的二月蓝植株嫩茎韧皮部附近观察到特异性的荧光亮点;又分别利用植原体的16SrDNA、rp基因、tuf基因及secY基因的通用引物对病株二月蓝的总DNA进行巢式PCR扩增,均获得与目的基因大小一致的特异性片段,测序后比对分析与系统发育学分析结果均表明:患病二月蓝中的植原体与16SrV-B亚组成员亲缘关系较近,可以聚为一簇,属于16SrV-B亚组成员,该结果与其16SrDNA的虚拟RFLP分析结果一致。其次,分别利用植原体的16SrDNA、rp基因的通用引物与设计的secA基因的引物对病株铜钱树的总DNA进行PCR扩增,均获得与目的基因大小一致的特异性片段,测序后比对分析与系统发育学分析结果表明:患病铜钱树中的植原体也与16SrV-B亚组成员聚为一小进化分枝,属于16SrV-B亚组成员,且与该植原体16S rDNA的虚拟RFLP分析结果一致。最后,利用植原体的16S rDNA的通用引物对患病的棕榈、桃树、矮牵牛、竹、玉簪这5种植物的总DNA分别进行巢式PCR扩增,均得到约1.2 kb大小的特异性目的条带,测序后比对分析、虚拟RFLP分析及基于它们的16S rDNA序列的系统发育学分析结果均表明,这5种植物中的植原体均与16SrV组成员之间亲缘关系较近,可以聚为一大进化分枝,初步确定它们同属于16SrV组成员,并暂时将它们划分为不同的植原体株系。另外,本研究还基于目前全球已经报道的16SrV组植原体数据,利用Maxent生态位模型和ArcGIS软件对16SrV组植原体在南京的潜在分布情况进行预测,同时结合实际调查及检测结果进行分析,表明南京的中部与北部地区属于该类病害发生的中风险区,而南京南部地区邻近高风险区,更适于该类病害的分布。植原体的致病机理研究对植原体的防治具有极其重要的意义。在病害的发生和发展过程中,植物体内酶的活性及某些代谢物的含量变化在一定程度上反应了寄主与病原物的互作关系,它们参与植物的抗逆性反应,有助于从生理生化方面理解植原体的致病机理。植物中的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)等与植物的抗氧化作用及防御反应密切相关。通过测定不同生长期健康与患病铜钱树叶片中上述6种酶活性以及丙二醛(MDA)、可溶性总糖和可溶性蛋白质的含量变化,结果发现感染植原体的铜钱树中上述6种酶活性以及丙二醛与可溶性糖含量较健康植株均呈现不同程度的升高趋势,可溶性蛋白质含量则较健康植株减少;除PPO活性变化不明显外,其它酶的活性及代谢物的含量随着植物生长时期的不同也表现出不同程度的变化,往往随着植原体的生长及繁殖活动程度增加即植物患病程度加剧其变化程度表现较为显着。胸苷酸激酶(TMK)可以催化磷酰基团从ATP转移到dTMP形成dTDP,是植原体DNA合成时形成dTTP补救途径中的关键酶,对植原体的生存必不可缺。本研究对16SrV-B亚组中的铜钱树丛枝病植原体的胸苷酸激酶基因进行了克隆、原核表达及酶活性测定分析。经克隆测序后比对结果显示:该植原体的胸苷酸激酶核苷酸序列与JWB植原体的完全一致。将该胸苷酸激酶与已报道的植原体胸苷酸激酶的氨基酸序列比对分析显示:PahWB植原体TMK的氨基酸序列与OY植原体TMK-a、WBD植原体TMK-1、PaWB植原体TMK-a-1及PaWB植原体TMK-a-2的氨基酸序列相似性较高,而与OY植原体TMK-b、WBD植原体TMK-2、PaWB植原体TMK-b的氛基酸序列相似性较低。该胸苷酸激酶在大肠杆菌中成功完成表达,纯化后获得纯度较高的大小约28 kDa的融合目的蛋白,但经双酶分析法测定结果表明该酶几乎没有活性,原因很可能是它们在植原体内作为其它底物的激酶在另外的核苷酸合成途径中发挥着作用。上述结果为进一步制备该酶的抗血清、研究该酶在植原体生长繁殖和代谢过程中的功能以及研究该植原体与侵染寄主植物的互作机制奠定了基础。
陈颖[5]2016年在《若干环境因子对枝角类肠道菌群多样性的影响》文中认为在浮游生态系统中,浮游动物和微生物之间紧密关联,浮游动物为微生物提供优质的营养物质,成为微生物良好的栖息地及避难所,为微生物在浮游系统中的分布提供动力；微生物将生物大分子降解和转化为更易吸收的营养源,增强宿主消化与吸收能力,帮助宿主有效抵抗外界压力,然而现如今的研究通常忽略了两者的关系。随着全球环境问题的出现,水体理化性质发生变化,例如环境温度升高、盐水入侵及蓝藻水华频繁暴发等,浮游动物枝角类在水体变化的过程中,如何通过调节生长与繁殖来适应一系列变化?此过程中,环境菌群或者肠道菌群是否为其提供帮助?本研究围绕该科学问题,以枝角类优势种蚤状溞(Daphnia pulex)及老年低额溞(Simocephalus vetulus)为研究对象,探讨个体发育、食物营养、温度胁迫、盐度胁迫及蓝藻暴发对浮游动物及其相关菌群的影响。通过生命表实验研究枝角类如何调控自身生长与繁殖,采用T-RFLP分析与MiSeq高通量测序相结合的方法对动物体甲壳体表与肠道组织分别进行菌群鉴定与分析,初步研究了枝角类相关菌群对个体发育及环境胁迫的响应。首先,探究蚤状溞个体发育对其肠道及体表菌群的影响。本实验针对3个蚤状溞克隆进行,分别培养至3天、10天及20天发育期。克隆差异及发育期差异对蚤状溞肠道菌群及体表菌群组成与多样性均无显着影响,菌群主要由β-,γ,-变形菌纲及拟杆菌门的微生物组成,多样性较低。第二,探究食物营养对蚤状溞肠道及体表菌群的影响。本实验将同一个蚤状溞克隆分别在食物质量为100%蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosd)、50%蛋白核小球藻+50%铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)及食物浓度为200μg CL-1、600 μg CL-1、1000 μg C L-1的条件下培养至10天发育期。体表菌群不随食物浓度及食物质量发生变化,肠道菌群受食物质量影响较大,在蓝藻出现的情况下,肠道菌群中可能出现新的微生物类群来促进蚤状溞的个体发育或者增强其对蓝藻的抗性。第叁,探究环境温度变化对蚤状溞及老年低额溞的影响。本实验设置15、20、25、30℃四个温度梯度,在各温度下进行生命表实验,对各温度下蚤状溞和老年低额溞肠道菌群进行T-RFLP及MiSeq高通量测序。在低温情况下,枝角类的生殖能力普遍降低,平均寿命及世代周期延长；高温显着抑制蚤状溞的生长及繁殖能力,但却显着促进老年低额溞生长及繁殖能力。当温度及铜绿微囊藻共同胁迫时,蚤状溞和老年低额溞受到的抑制作用更为显着,在高温下蚤状溞对铜绿微囊藻的抗性显着增强。蚤状溞肠道菌群受温度及铜绿微囊藻共同胁迫的影响较大,可能存在某些微生物为蚤状溞抵御温度及铜绿微囊藻共同胁迫做出贡献。第四,探究盐度变化对蚤状溞和老年低额溞的影响。本实验设置0、1、2gL-1的盐度梯度,在各盐度下进行生命表实验,对各盐度下蚤状溞和老年低额溞肠道菌群进行T-RFLP及MiSeq高通量测序。蚤状溞耐盐性、抗铜绿微囊藻能力较老年低额溞低,而在盐度及铜绿微囊藻的共同胁迫作用下,蚤状溞抗铜绿微囊藻的能力较老年低额溞得到更显着的提高；蚤状溞抵御盐度和铜绿微囊藻共同胁迫时,肠道菌群的作用较为显着,在老年低额溞面对盐度胁迫时,肠道菌群作用较大。最后,探究采自不同蓝藻水华暴发程度水域的老年低额溞对铜绿微囊藻的抗性及肠道菌群变化。蓝藻水华暴发程度高的水域中的老年低额溞抗蓝藻能力强,主要通过减弱生长与繁殖能力作为补偿。蓝藻水华暴发程度较低的水域中,老年低额溞的生长与繁殖能力较强,抗蓝藻能力较弱,面对蓝藻胁迫,其肠道菌群可能增强其抗蓝藻能力。综合以上研究,枝角类个体发育及食物浓度对枝角类肠道菌群组成与多样性的影响较小。在两种枝角类中,老年低额溞比蚤状溞具有更强的抗高温、抗高盐能力,当高温或者高盐与铜绿微囊藻共同胁迫时,蚤状溞肠道菌群中出现新的微生物种类,可能对蚤状溞提高环境胁迫能力起辅助作用。采自蓝藻暴发程度较低水域的老年低额溞,在抗铜绿微囊藻过程中可能需要肠道菌群的辅助作用。
刘晓云, 陈文新[6]2003年在《叁叶草、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP分析和数值分类研究》文中进行了进一步梳理采用 16SrDNAPCR -RFLP分析和表型数值分类 ,对分离自叁叶草 (Trifolium)、猪屎豆 (Crotalaria)和含羞草(Mimosa) 3属植物的根瘤菌进行了分类研究。 16SrDNAPCR -RFLP分析表明 ,在 80 %的相似性水平上 ,6 7株待测菌株和 18株参比菌株归属到慢生根瘤菌属 (Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属 (Mesorhizobium)、土壤杆菌属 (Agrobac terium)和根瘤菌属 (Rhizobium)与中华根瘤菌属 (Sinorhizobium) 4个系统发育分支。进一步对其中 5 6株待测菌株和14株参比菌株进行表型性状数值分类研究 ,在 84 %的相似性水平上 ,得到 6个独立的类群 :群Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ为新群 ,没有与参比菌株聚在一起 ;群Ⅱ包含慢生大豆根瘤菌 (Bradyrhizobiumjaponicum) ;群Ⅲ含根瘤菌属 (Rhizobium) 2个已知的代表菌株 ;群Ⅴ含土壤杆菌属 (Agrobacterium) 2个已知种的代表菌株。以上结果表明 ,分离自这 3属植物的根瘤菌菌株具有表型和遗传型多样性 ,同时新发现分离自叁叶草的根瘤菌的慢生和中慢生菌株 ;分离自含羞草的根瘤菌的慢生菌株和分离自猪屎豆的根瘤菌的快生菌株 ,此项研究也进一步证实这两种研究方法在菌株归群上的一致性
孙悦[7]2011年在《ARISA和T-RFLP技术分析葡萄酒相关酵母菌多样性》文中认为酵母菌是葡萄酒生产中最重要的微生物有机体,它们通过自身的一系列代谢活动和其多样性及群体组成影响着葡萄酒的质量。葡萄酒相关酵母菌的多样性调查对于葡萄酒生产具有重要的意义,既能够防治微生物病害,监控发酵过程,还能为选育优良性状酵母菌株提供基础。ARISA(automated ribosomal intergenic spacer analysis)和T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)技术在研究微生物群体多样性方面有着独特的优势,是国外广泛用于微生物调查研究的非培养方法,但在国内外还未见应用于葡萄酒酵母菌研究的相关报道。本研究对葡萄酒相关酵母菌做了ARISA分析、T-RFLP分析,进行了酵母菌群落结构多样性的研究,以期为国内葡萄酒相关酵母菌的调查引入快速、精确、简单的新方法,补充并完善我国对葡萄酒酵母菌群体多样性的研究工作。主要研究结果如下:1.纯种酵母菌的ARISA和T-RFLP分析。以5.8 S rDNA-ITS序列为目标片段,使用荧光标记引物ITS1-HEX和ITS4进行PCR扩增反应,得到目的条带后对PCR产物及其经过HaeⅢ和HinfⅠ的酶切消化产物(即荧光标记的PCR产物和T-RFs)分别进行毛细管电泳分析,得到ARISA分析(PCR产物)和T-RFLP分析(T-RFs)结果,以此进行相应数据库的构建。结果表明,ARISA和T-RFLP技术重现性好。对39种91株酵母菌的分析表明,根据PCR产物的长度,可将供试菌株中的10个种进行区分;在T-RFLP分析中,根据HaeⅢ酶切产生的T-RFs长度,可将供试菌株中的14个种进行区分,根据HinfⅠ酶切产生的T-RFs长度,可将供试菌株中的11个种进行区分。综合分析酵母菌的ARISA和T-RFs数据,共可以对供试菌株中的15个种进行区分,分别为:Brettanomyces bruxellensis; Candida apicola; Candida boidinii ; Candida norvegica; Candida stellata; Candida zemplinina; Debaryomyces hansenli var. hansenli; Metschnikowia pulcherrima; Pichia anomala; Pichia fermentans; Pichia membranifaciens; Pichia kluyveri; Saccharomyces ludwigii; Torulaspora delbrueckii; Zygosaccharomyces bailii。单独使用T-RFLP技术共可以对供试菌株中的14个种进行区分,不能对C. stellata进行区分;对于S. ludwigii; T. delbrueckii和Z. bailii来说只有HaeⅢ的酶切结果可以对其进行区分;其余的11个种都可以用HinfⅠ酶切分析进行区分。2.自然发酵过程中酵母菌的T-RFLP分析。对雷司令和霞多丽葡萄品种自然发酵过程的5个时期进行取样,样品不经稀释直接涂在YEPD平板以获得总酵母菌群,用于T-RFLP分析。结合酵母菌WL营养培养基(Wallerstein Laboratory Nutrient Agar)分类鉴定方法和5.8 S rDNA-ITS序列的HaeⅢ和HinfⅠ酶切分析,研究酒精发酵各时期酵母菌种类和数量。对于雷司令葡萄自然发酵过程,T-RFLP分析比常规分析方法鉴定出的酵母菌种类要多,M. pulcherrima, C. zemplinina和300±1bp代表的酵母菌种类,在酵母菌的常规分析方法中都没有鉴定出来;对于霞多丽葡萄自然发酵过程, T-RFLP分析比常规分析方法鉴定出的酵母菌种类要少。WL分类表明霞多丽自然发酵过程中还存在M. pulcherrima和P. minuta var.minuta,而在T-RFLP图谱中没有检测出来,可能是因为取样不均匀造成的。T-RFs为300±1bp的酵母菌在常规分析方法中没有被检测到。此外,S. cerevisiae是酒精发酵中期和后期的优势菌,随着发酵的进行,S. cerevisiae在发酵液中数量增加,到发酵后期分离到的S. cerevisiae比例达到100%,成为主要发酵动力群体并最终主导发酵完成。总之,本文首次将ARISA和T-RFLP两种不依赖于培养的技术应用于葡萄酒相关酵母菌多样性研究中,初步建立了纯培养酵母菌ARISA和T-RFLP分析的数据库,探索了二者在酒精发酵过程的酵母菌多样性研究中的应用价值;加强人们了对酒精发酵过程的认识和理解,为建立葡萄酒相关酵母菌群生态与葡萄酒品质之间的对应关联奠定基础。
张瑛[8]2015年在《蝉科昆虫内共生菌的分布规律研究》文中进行了进一步梳理蝉科昆虫食性单一,以植物木质部汁液为食,食物中的营养成分极度不均衡,因此内共生菌在蝉科昆虫的营养代谢和生长发育中至关重要。这些内共生菌通常存在于寄主昆虫腹部的贮菌体中。然而,蝉科昆虫贮菌体中细菌群落组成并不清楚,内共生菌在贮菌体之外其他器官是否分布尚不明确,其他器官(如肠道、唾液腺、马氏管、精巢、卵巢)细菌群落的研究也较少。本研究采用基于16S rRNA基因的限制性片段长度多态性(RFLP)方法对蝉科几种代表昆虫(黑蚱蝉Cryptotympana atrata(Fabricius)、斑透翅蝉Hyalessa maculaticollis(Motschulsky)、合哑蝉Karenia caelatata Distant、枯蝉Subpsaltria yangi Chen)贮菌体、马氏管,以及斑透翅蝉H.maculaticollis不同器官及肠道区域(唾液腺、食道、“滤室+锥形体”、中肠、回肠、马氏管、“膜质囊+直肠”、卵巢、精巢以及贮菌体)的细菌群落组成及多样性进行研究,以揭示各个器官及肠道部位细菌组成特点及差异。研究结果如下:1.叁种蝉科昆虫(黑蚱蝉C.atrata、斑透翅蝉H.maculaticollis以及合哑蝉K.caelatata)马氏管细菌组成和多样性存在明显差异,黑蚱蝉C.atrata马氏管中共分布6种细菌,分别属于γ变形菌门和放线菌门,斑透翅蝉H.maculaticollis马氏管中仅分布2种γ变形菌门细菌,合哑蝉K.caelatata马氏管中共分布4种细菌,一种为α变形菌门细菌,另外3种属于γ变形菌门。2.隶属于拟杆菌门的内共生菌Candidatus Sulcia muelleri在3种蝉科昆虫(枯蝉S.yangi、黑蚱蝉C.atrata和斑透翅蝉H.maculaticollis)贮菌体中均有分布,枯蝉S.yangi和黑蚱蝉C.atrata贮菌体中均只分布内共生菌Ca.Sulcia muelleri一种细菌,而斑透翅蝉H.maculaticollis贮菌体中共分布13种细菌,其中Ca.Sulcia muelleri仅占整个克隆文库的5.5%。3.斑透翅蝉H.maculaticollis不同器官细菌群落组成明显不同,但优势细菌较为一致。(1)唾液腺中共存在7种细菌,分别属于变形菌门和厚壁菌门;其中绿脓假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa和肠杆菌Enterobacter sp.为优势细菌,分别占克隆文库的48.7%;另外5种细菌总共占克隆文库的2.05%。(2)食道中共检测到12种细菌,分别属于变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门以及栖热菌门,优势菌生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus占克隆文库的46.28%,绿脓假单胞杆菌Ps.aeruginosa其次,占克隆文库的33.88%,其他10种含量较低总共占克隆文库的19.84%。“滤室+锥形体”中共分布9种变形菌门细菌,生癌肠杆菌E.cancerogenus含量最多,占克隆文库的38.36%,Enterobacter sp.次之,占克隆文库的35.77%,绿脓假单胞杆菌Ps.aeruginosa占克隆文库18.53%,其他6种总共占克隆文库的7.34%。中肠中分布4种γ变形菌门细菌:生癌肠杆菌E.cancerogenus占克隆文库0.87%,绿脓假单胞杆菌P.aeruginosa占克隆文库2.61%,成团泛菌Pantoea agglomerans占克隆文库95.22%,菠萝泛菌Pa.ananatis占克隆文库1.3%。回肠中检测到3种γ变形菌门细菌:生癌肠杆菌E.cancerogenus和Ps.aeruginosa分别占克隆文库1.39%,成团泛菌P.agglomerans占97.22%。“膜质囊+直肠”克隆文库比对出3种γ变形菌门细菌,绿脓假单胞杆菌Ps.aeruginosa占0.97%,成团泛菌Pa.agglomerans占97.58%,Sodalis glossinidius占1.45%。(3)马氏管中只检测到2种γ变形菌门细菌;其中绿脓假单胞杆菌Ps.aeruginosa占克隆文库的90.35%,肠杆菌Enterobacter sp.占9.65%。(4)贮菌体中鉴定到13种细菌,分别属于栖热菌门,β变形菌门,放线菌门和拟杆菌门,其中Meiothermus sp.和Caldimonas hydrothermale为优势菌,分别占整个克隆文库的32.5%和21.5%。内共生菌Ca.Sulcia muelleri占5.5%,其他9种细菌各自含量均非常低,总共占克隆文库的46%。(5)雄性精巢细菌群落包括6种细菌,分别属于拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和栖热菌门,优势细菌为内共生菌Ca.Sulcia muelleri,占克隆文库的89.06%,其他5种含量较低;雌性卵巢细菌群落只鉴定出内共生菌Ca.Sulcia muelleri一种细菌。研究结果表明,蝉科昆虫不同器官中细菌组成和含量差异较大,且不同的细菌群落中都有两、叁种优势细菌;内共生菌Ca.Sulcia muelleri仅局限分布于贮菌体和精巢、卵巢中。
陈卫民[9]2006年在《西北荒漠地区骆驼刺根瘤菌多样性及其系统发育研究》文中研究表明本论文综述了根瘤菌多样性、分类和多相分类技术的研究进展;采用表型分析(153项生理生化测定,数值分类)和遗传型分析(16S rDNA PCR-RFLP,23S rDNA PCR-RFLP,IGS PCR-RFLP,16S rRNA基因全序列分析)等多相分类技术,对45株分离自我国甘肃和新疆不同地区豆科植物骆驼刺的根瘤菌,首次系统地进行了多相分类和系统发育研究。对甘肃省41个县市73个乡镇,总计200多个采样点,进行了豆科植物根瘤菌资源的调查和采集,涉及豆科植物32属75种,分离纯化得到1200多株根瘤菌,斜面保藏和甘油超低温冰箱保藏,极大丰富了根瘤菌资源库,为我国西部地区根瘤菌资源研究和开发奠定了基础。生理生化性状测定表明,所有待测菌株可在50ug/ml林可霉素和pH9的条件下生长,分离自甘肃阿拉尔的供试菌中9株快生菌性状更优良,耐酸碱能力强,其中CCNWOX04-2可在pH5-pH12范围内生长,而来自甘肃安西县盐碱地的根瘤菌最高只能耐受pH9。温度测试中,40℃条件下,分离自新疆的CCNWOX04-2、CCNWXJ11-2、CCNWXJ40-1均可生长;在60℃条件下,来自新疆的绝大多数能够生长,而甘肃只有少数可以生长。在唯一碳氮源利用,抗生素和染料抗性测定、石蕊牛奶实验等,所有待测菌株都表现出地区多样性,本实验还将待测菌株对重金属和苯酚的抗性作为生理生化指标,甘肃安西县CCNWAX39-1可耐受600mg/L苯酚,也可在锌浓度为1.4mmol/L的YMA培养基上生长。在数值分类中,所有供试菌株在70%的相似水平上聚在一起。待测菌株主要分为五个表观群,群Ⅰ为快生菌群,均来自新疆阿拉尔,在91%的相似水平上与R. leguminosarum聚在一起。群Ⅱ、群Ⅲ和群Ⅳ在80%的相似水平上聚在一起,距中慢生根瘤菌属较近,但并没与已知参比菌株聚在一群,为新的独立群。群Ⅴ中的4株菌与M. tianshanesnse在88%水平上聚在一起。数值分类的中心菌株CCNWXJ12-2、CCNWXJ40-4、CCNWAX44-1、CCNWAX24-1和CCNWOX02-2在与8种其他豆科植物交叉结瘤实验表明,骆驼刺根瘤菌结瘤范围非常广,其中CCNWXJ12-2可与6种豆科植物结瘤,根瘤形状与寄主有关。遗传型分析(16S rDNA PCR-RFLP,23S rDNA PCR-RFLP,IGS PCR-RFLP)结果表明,分离自甘肃和新疆45株骆驼刺根瘤菌存在明显的遗传多样性。16S、23S ARDRA将45株菌分成3个遗传群,多数按地区聚群,表现出地区多样性。IGS PCR-RFLP进一步将45株菌分成3个遗传群、6个遗传亚群。
曹宏卿[10]2002年在《FMMU白化豚鼠线粒体DNA RFLP分析研究》文中提出目的：FMMU白化豚鼠是从普通花色豚鼠突变种中选育而成的新品系封闭群实验动物。前人研究结果表明FMMU白化豚鼠的听觉阈值明显低于花色豚鼠，缺氧耐受性优于花色豚鼠，免疫功能低于花色豚鼠。本实验的目的是研究FMMU白化豚鼠的mtDNA，并与花色豚鼠mtDNA进行多态性分析比较，以确定其独特的生物学特性是否与mtDNA相关。 方法： 1、用碱变性法提取FMMU白化豚鼠以及花色豚鼠的mtDNA。 2、用AvaⅠ、Bal Ⅰ、BamHⅠ、Bgl Ⅰ、Cla Ⅰ、DraⅠ、EcoRⅤ、HpaⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、XhoⅠ等12种限制性内切酶对FMMU白化豚鼠以及花色豚鼠的mtDNA进行酶切和限制性片段长度多态性分析。 3、用凝胶图像分析系统计算mtDNA以及酶切mtDNA后酶切片段的分子量。 结果： 1、FMMU白化豚鼠mtDNA和花色豚鼠mtDNA的分子量相同，约为16.7kb。 2、FMMU白化豚鼠与花色豚鼠两品系的mtDNA经AvaⅠ、BalⅠ、BamHⅠ、BglⅠ、Cla Ⅰ、Bra Ⅰ、EcoRⅤ、Hpa Ⅰ、Pst Ⅰ、PvuⅡ、Stu Ⅰ、XhoⅠ等内切酶酶切后有1-7个酶切位点，酶切图谱完全相同，二者之间没有多态性。 结论； 1、FMMU白化豚鼠mtDNA和花色豚鼠mtDNA的分子量约为16.7kb。 2、经RFLP分析FMMU白化豚鼠与花色豚鼠之间缺乏多态性。 3、本实验没有发现FMMU白化豚鼠的独特的生物学特性与mtDNA相关。
参考文献：
[1]. Pleurotus属食用菌种的分子鉴别技术研究[D]. 刘新锐. 福建农林大学. 2008
[2]. 黑木耳等9种食用菌的种质资源分子鉴定[D]. 曹鸿雁. 福建农林大学. 2009
[3]. FMMU白化豚鼠线粒体DNA RFLP分析研究[J]. 曹宏卿, 顾为望. 中国实验动物学报. 2005
[4]. 南京几种植原体病害的鉴定及铜钱树丛枝病植原体致病机理的初步研究[D]. 王庆璨. 南京农业大学. 2015
[5]. 若干环境因子对枝角类肠道菌群多样性的影响[D]. 陈颖. 华东师范大学. 2016
[6]. 叁叶草、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP分析和数值分类研究[J]. 刘晓云, 陈文新. 中国农业大学学报. 2003
[7]. ARISA和T-RFLP技术分析葡萄酒相关酵母菌多样性[D]. 孙悦. 西北农林科技大学. 2011
[8]. 蝉科昆虫内共生菌的分布规律研究[D]. 张瑛. 西北农林科技大学. 2015
[9]. 西北荒漠地区骆驼刺根瘤菌多样性及其系统发育研究[D]. 陈卫民. 西北农林科技大学. 2006
[10]. FMMU白化豚鼠线粒体DNA RFLP分析研究[D]. 曹宏卿. 第一军医大学. 2002