孙凯[1]1998年在《血小板/T细胞活化抗原1融合蛋白的表达、纯化及其配体的初步鉴定》文中进行了进一步梳理血小板和T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)最早在1985年由Bums等发现。由于其表达于人活化T细胞而被命名为TLiSA1抗原(T lineage specific activation antigen 1，TLiSA1)。1989年被更名为血小板和T细胞活化抗原1。在发现PTA1抗原的12年时间里，对PTA1分子的分布、功能及其与疾病的关系做了大量的研究，证实PTA1主要表达于活化T细胞、巨核及血小板谱系，参与T细胞的活化与分化、血小板的活化与聚集，并参与其中的信号转导。PTA1 mAb可诱导血小板活化聚集、抑制CTL的分化。另外，PTA1与血小板功能异常、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、病毒感染性疾病及肿瘤等疾病的发病机理亦有着密切的关系。上述结果提示，PTA1分子具有重要的功能及潜在的临床应用前景。 1997年本实验室与澳大利亚Newcastle大学合作从TPA活化的Jurkat细胞cDNA丈库中克隆了PTA1基因。证实PTA1分子是新的T细胞／血小板膜表面活化抗原，属于免疫球蛋白超家族成员(胞膜外区232aa／路膜区25aa／胞浆区61aa)，它的胞膜外区仅由2个V样区组成，在免疫球蛋白超家族中未见有其它分子具有这种结构。新近，我室又成功克隆了长臂猿和恒河猴PTA1基因，人、猿和猴PTA1分子的cDNA及蛋白水平的同源性为93％～95％，表明PTA1在生物进化过程中高度保守。PTA1基因的克隆为PTA1结构、功能、信号转导的研究打下了良好基础。 但到目前为止，PTA1配体(PTA1 ligand，PTA1L)尚未被基因克隆，亦未见有关PTA1L的研究报道。本文的目的是鉴定PTA1L，为最终克隆PTA1L、
徐竹蔚[2]2009年在《CD226分子与肿瘤和实验性自身免疫性脑脊髓炎关系的研究》文中提出免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)成员CD226分子是一种广泛表达于多种免疫细胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获得新的CD命名。此前,该分子被称为“T细胞谱系特异性活化抗原1(T lineage- specific activation antigen 1,TLiSA1)”、“血小板与T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1,PTA1)”和“DNAX辅助分子1(DNAX accessory molecule-1,DNAM-1)”。人CD226基因于1996年克隆成功,位于染色体18q22.3,其cDNA全长2664bp,开放读框编码336个氨基酸,其基因存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。小鼠CD226基因由我室于2002年成功克隆,位于染色体18 E4,除了cDNA全长为2487bp的原型分子以外,还存在三种异型。完整的CD226分子由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成,分子量为65~67 kDa,胞膜外区有2个IgSF V样结构域和潜在的糖基化位点,胞浆区有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。不同种属的CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平均高度同源,蛋白结构也十分相似,是一个在进化上是一个相对保守的分子,提示该分子在机体免疫应答过程和其他生物学功能中可能扮演了极为重要的角色。此外,CD226分子与CD96以及其他Nectin和Nectin样分子(Nectin-like molecule,Necl)有较高的同源性。CD226广泛表达于T细胞、NK细胞、NK T细胞、活化的血管内皮细胞、巨核/血小板谱系、单核细胞、胸腺细胞、某些B细胞亚群、部分造血干细胞和肥大细胞等免疫细胞表面,在免疫系统以外则分布于海马和小脑皮质的神经突触部位。2003年,人CD226的两种配体鉴定成功,分别是CD112/Nectin-2和CD155/Necl-5/PVR(脊髓灰质炎病毒受体)。CD226与其配体的相互作用参与CTL和NK细胞的活化、分化和细胞毒作用,调节CD4+ T细胞的增殖和分化,介导内皮细胞与其他细胞的黏附,促进血小板的活化与聚集,参与造血调控,介导肥大细胞的脱颗粒作用,参与NK T细胞和胸腺细胞的抗凋亡作用、树突状细胞的成熟、免疫突触和神经突触的形成,并与肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥及病毒感染等疾病密切相关。人CD226除以膜型(mCD226)的形式表达在细胞膜表面外,还以可溶型(sCD226)的形式存在于血清和细胞培养上清中。前期小规模临床标本检测发现,在肿瘤和多种自身免疫性疾病患者的血清中,sCD226的水平均显著高于正常人,但是目前关于CD226与临床疾病的研究仅限于膜型和/或可溶型CD226的表达及其基因SNP与疾病的关系,而CD226在肿瘤及自身免疫性疾病中的作用和可能的分子机制尚不清楚。本研究首先制备和鉴定了一批抗人IgG Fc段、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)和硫氧化还原蛋白(thioredoxin,Trx)等常用标签蛋白(tag)的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),在此基础上建立或改良了定量检测GST、Fc、MBP和Trx或其融合蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒,敏感性分别达到了1.2、15.6、1和0.4 ng/ml。应用Fc ELISA试剂盒检测上清中hCD226-Fc水平的方法,克隆化了高水平分泌该融合蛋白的CHO-hCD226-Fc细胞株,大量制备细胞培养上清,并用抗Fc mAb标记的Sepharose 4B亲和层析柱纯化了hCD226-Fc融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot和流式细胞术(flow cytometry,FCM)鉴定其纯度和生物学活性,以此作为人sCD226 ELISA试剂盒的标准品以及体外杀伤实验中模拟天然sCD226作用的试剂。另外,还对我室前期研制的定量检测人sCD226的双抗体夹心ELISA试剂盒进行了改良。应用条件优化后的ELISA试剂盒检测了259例肿瘤患者(包括消化、呼吸、血液、妇科、骨骼、神经系统等多种来源的肿瘤)及129例正常人血清中sCD226的水平,发现肿瘤患者血清中sCD226的水平(0.2-60 ng/ml,中位数11.5 ng/ml)明显高于正常人(0.1-23 ng/ml,中位数6.3 ng/ml,P<0.001);而在用FCM检测外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)上mCD226的表达时,发现肿瘤患者PBMC上mCD226的表达(14例,1.1%-56.1%,中位数17.45%)明显低于正常人(12例,43.1%-77.8%,中位数65.3%,P<0.001)。在体外NK细胞杀伤肿瘤细胞的模型中用重组表达的可溶型hCD226-Fc融合蛋白模拟天然sCD226的作用,发现hCD226-Fc能显著抑制NK细胞对其靶细胞K562细胞的杀伤,浓度为1μg/ml时抑制率即可达到34%,而且这种抑制作用呈剂量依赖性。在佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)活化的正常人PBMC和Jurkat细胞上,3种蛋白酶抑制剂(金属蛋白酶抑制剂1-10-phenanathroline、丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和半胱氨酸蛋白酶抑制剂NEM)可以在上调mCD226的表达的同时下调培养上清中sCD226的水平,由于多种蛋白酶在许多肿瘤中含量可能有所增加,提示蛋白酶解作用可能是肿瘤患者血清中sCD226的形成机制。用免疫沉淀和Western blot的方法鉴定了血清和细胞培养上清中sCD226的分子量,发现在肿瘤患者和正常人血清以及PMA刺激的PBMC和Jurkat细胞培养上清中,均存在~50 kDa的特异性条带,这与CD226分子的胞膜外区分子量相符。另外,血清样本中还存在一个~45 kDa的条带,这一条带在PMA刺激的细胞培养上清中不存在,提示不同蛋白酶对CD226的酶解作用可能发生在该分子胞膜外区的不同位置。在搞清了肿瘤患者sCD226的表达、作用和来源的基础上,我们提出了如下假说:肿瘤患者中升高的蛋白酶可能通过酶解作用导致了PBMC上mCD226表达下调而血清中sCD226的水平上调,高水平的sCD226与其膜型配体CD112/CD155分子相结合,减弱了杀伤细胞上mCD226分子与肿瘤细胞表面膜型CD112/CD155的结合,从而抑制了杀伤细胞活化信号的产生,并最终导致肿瘤细胞发生免疫逃逸。本研究还用ELISA和胞内细胞因子染色的方法观察了抗人CD226的mAb LeoA1对混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture,MLC)和PBMC中细胞因子分泌格局及细胞亚群百分比的调控,发现被上调的有IL-10、GM-CSF和G-CSF等,被下调的有IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12 p40、IL-15、IL-23和TGF-α等,相关的细胞亚群包括Th1、Th2、CTL、NK以及单核/巨噬和DC。采用信号分子阻断剂的手段,分析了CD226调控MLC细胞因子分泌格局的信号通路中可能涉及的信号分子主要有p38、JNK和PI3K。最后,成功建立了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,证实了抗CD226抗体对EAE的发生有明显的防治作用,其分子机制涉及中枢神经系统局部炎细胞浸润的减轻,脾脏CD25阳性的活化细胞数量的减少,以及脾脏IL-10+细胞和调节性T细胞百分率的增加。简言之,本研究的实验结果为阐明CD226分子在肿瘤和自身免疫性疾病中的作用提供了实验依据,并为深入研究CD226参与机体多种生理功能和病理过程的分子机制奠定了基础。
庄然[3]2007年在《CD226及其配体CD112/CD155分子相互作用机制的研究》文中指出血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1, PTA1)属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)成员,其胞膜外区含有2个V样结构域。在2000年召开的第七届人类白细胞分化抗原国际协作组会议(HLDA7)上获得编号CD226。CD226分子最早通过单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)LeoA1被发现,在使用人混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)得到的活化细胞免疫小鼠时获得LeoA1,它所识别的抗原称为T细胞谱系特异的活化抗原1(T lineage-specific activation antigen 1, TLiSA1)。随后发现除活化T细胞表达外,该分子也分布于血小板,因而命名为血小板/T细胞活化抗原1。美国DNAX研究所也研究了同一蛋白分子,并命名其为DNAM-1(DNAX accessory molecue-1)。该分子于1996年基因克隆成功,cDNA全长2603bp,包含7个外显子,开放读框编码336个氨基酸,胞浆区具有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。CD226分子与表达于杀伤性T细胞(CTL)和NK细胞的CD96(Tactile)分子在蛋白水平有22%的同源性,与BGP-1、CD36、PRR和果蝇神经胶质蛋白Neuroglian也有一定的同源性。CD226基因产物是分子量约为65kDa的I型跨膜糖蛋白,表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨核/血小板谱系及活化的血管内皮细胞;广泛参与了免疫系统的生理和病理学功能,如T细胞、巨核细胞的分化,NK细胞对肿瘤细胞、病毒感染细胞的杀伤,血小板的活化与聚集,单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞等过程,并参与其中的信号转导。CD226分子体内天然配体于2003年得到鉴定,为同属于nectin/Necl家族的黏附分子:人脊髓灰质炎病毒受体(PVR/Necl-5/CD155)及其家族成员人PVR受体相关分子(PRR-2/nectin-2/CD112),CD112同时也是单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的受体。CD226的配体表达广泛,包括神经细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。在与CD112和CD155相互作用后,CD226分子可以向细胞内传递活化型信号,参与固有免疫和适应性免疫应答,引发多种免疫学效应,包括细胞间的黏附、浸润及杀伤活性的发挥等过程。但是目前有关这些细胞间黏附分子相互作用的确切分子机制尚不完全清楚。CD226、CD112和CD155分子同属于免疫球蛋白超家族成员,胞膜外区具有相似的空间结构,这一类黏附分子是通过什么样的结构域相互作用从而传递了活化性的信号仍不明确。探讨参与CD226与其配体CD112和CD155分子作用的蛋白结构域,有助于深入理解黏附分子、杀伤细胞活化型受体等免疫细胞膜分子激活的分子机制。本研究首先通过RT-PCR方法,从人结肠癌细胞系SW480中克隆出CD226分子的两种配体CD112和CD155基因的开放读框全长。针对其胞膜外区(extracellular domain,ED)基因序列和相应的目的载体多克隆位点,合成带有酶切位点的引物,将CD112和CD155分子胞膜外区分别插入可以表达分泌型融合蛋白(带有人IgG Fc段标签)的真核表达载体pCMD7,转染CHO细胞并在真核细胞抗生素G-418选择压力下培养和有限稀释法克隆化筛选后,分别获得了可稳定表达CD112ED-Fc和CD155ED-Fc融合蛋白(C端带有Fc标签)的CHO细胞株,用抗Fc单抗亲和层析柱纯化融合蛋白,并利用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,各制备了一套可满足免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化染色、流式细胞术以及功能实验要求的单克隆抗体,并利用该单抗初步分析了CD112和CD155分子在机体免疫系统抗肿瘤中的作用,以及CD155分子在正常和肿瘤组织中的表达。由于现有真核表达载体pCMD7的多克隆位点过于简单,所以我们改构了pSecTag2B载体,使其可以表达带有3C酶识别位点和C端Fc标签的融合蛋白。利用该载体,同上述方案分别建立了可以稳定分泌胞膜外区第一个和第二个结构域的CD226D1-Fc和CD226D2-Fc融合蛋白的CHO细胞株。纯化的融合蛋白可用于细胞杀伤、细胞黏附等免疫学功能实验模型,以分析CD226分子与其配体CD112/CD155分子相互作用的结构域。应用可溶型分子液相与固相结合试验,发现CD112或CD155与固相化全长CD226分子有较高的结合能力,而与CD226D1和D2的结合能力明显下降。采用CFSE/PI双标记法以及NK细胞为效应细胞、K562细胞为靶细胞的杀伤实验中,CD226-Fc以及CD112-Fc和CD155-Fc融合蛋白均可以明显抑制NK细胞的杀伤活性,而CD226D1-Fc和CD226D2-Fc的抑制作用很弱;FMU-CD112.8和FMU-CD155.12 mAb也具有抑制作用。说明CD226-CD112和CD226-CD155相互作用都参与了NK细胞识别和杀伤靶细胞。采用CFSE荧光标记的PBMC与ECV304内皮细胞黏附阻断实验模型证实,CD226全长分子可以显著抑制PBMC与ECV304细胞之间的黏附,同样发现CD226D1和CD226D2的抑制作用非常弱。本实验研究中,我们还构建了含CD226胞膜外区不同结构域的截短体和CD226/ICAM-1绿色荧光蛋白嵌合体分子,及其配体CD112/CD155分子与红色荧光蛋白融合表达载体,转染CHO细胞后,采用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察分析了CD226与其配体CD112和CD155分子间的相互作用结构域。结果显示,单独CD226第1结构域(羧基端连接ICAM-I分子胞膜外区第5结构域和跨膜区、胞浆区)或者单独CD226第2结构域(氨基端连接ICAM-I分子胞膜外区第1结构域)的嵌合体膜型分子均不能与细胞表面膜型CD112或CD155分子有效结合,只有包括了D1和D2的完整CD226分子才能有效结合CD112或CD155分子,并引发相应分子在细胞膜上的极化和聚集,出现明显的帽形成(capping)。上述多个模型的实验均证实,CD226分子胞膜外区2个V样结构域都参与了同配体的结合;在高浓度可溶形式条件下,CD226分子胞膜外区单独一个结构域仍可以与配体分子以较低的亲和力结合,可以部分的模拟天然分子的结合效应,但胞膜外区2个V样结构域的完整性对于CD226与其配体有效结合及活化信号的传递是必需的,缺失任何一个结构域都不能有效的与相应配体发生高亲和力的结合,也不能诱导受体和配体膜分子在相应细胞膜表面的极化和聚集。说明CD226与配体的结合有赖于完整的蛋白空间构象。这些实验结果为进一步深入研究免疫细胞活化型受体CD226分子参与机体多种免疫学功能的分子机制奠定了实验基础。
孙凯, 金伯泉, 孙忱, 朱勇, 贾卫[4]1998年在《人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)亲和层析柱的制备及PTA1/Ig的纯化》文中认为目的：制备可用于纯化血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）融合蛋白的亲和层析柱，纯化真核表达的ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，以进一步研究ＰＴＡ１的功能及其配体。方法：以硫酸铵及阴离子交换色谱法纯化抗ＰＴＡ１ｍＡｂ，并交联Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备ＰＴＡ１亲和层析柱。通过亲和层析法，从ｐＰＴＡ１／Ｉｇ表达载体转染的ＣＯＳ７细胞培养上清中纯化ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，用夹心ＥＬＩＳＡ及ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定纯化结果。结果：硫酸铵及阴离子交换色谱纯化后，获得纯度高和活性好的抗ＰＴＡ１ｍＡｂ，用其交联Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备ＰＴＡ１亲和层析柱，交联率为９６％。该亲和层析柱可从ｐＰＴＡ１／Ｉｇ转染的ＣＯＳ７细胞上清每１００ｍｌ中，纯化ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白约１２６μｇ。结论：制备成功可用于纯化ＰＴＡ１的亲和层析柱，并获得纯化的ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，为进一步研究ＰＴＡ１的功能及鉴定其配体提供了有力手段
孙凯, 金伯泉, 冯琦, 朱勇, 杨琨[5]1999年在《血小板/T细胞活化抗原PTA1配体的初步鉴定》文中研究说明血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)是1997年克隆的新分子,主要表达于血小板和T细胞,参与T细胞的活化与分化。前期实验表明,PTA1与肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病及移植排斥反应有密切的关系。但到目前为止PTA1配体仍不清楚,这在一定程度上阻碍了PTA1/
孙凯, 金伯泉, 孙忱, 田方, 朱勇[6]1998年在《人血小板/T细胞活化抗原PTA1/Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定》文中研究表明目的：获得人血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）胞膜外区与人ＩｇＧ１Ｆｃ段融合蛋白，为ＰＴＡ１配体的鉴定及其功能的研究提供有力的工具。方法：针对人ＰＴＡ１ｃＤＮＡ序列设计３段引物，通过反转录、半套式ＰＣＲ方法从活化Ｊｕｒｋａｔ细胞中扩增出ＰＴＡ１胞膜外区基因片段，并将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＩＧ中，通过酶切、ＰＣＲ及序列测定鉴定重组表达载体。重组载体通过ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，经夹心ＥＬＩＳＡ及亲和层析、ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定融合蛋白的表达及免疫学活性。结果：经序列测定后证实重组表达载体含有正确的ＰＴＡ１胞膜外区序列及剪接供体序列，转染ＣＯＳ７细胞后，通过亲和层析纯化证实融合蛋白的Ｍｒ为８３０００，并能被抗ＰＴＡ１胞膜外区单抗及抗人ＩｇＧＦｃ的单抗同时识别。结论：ｐＰＴＡ１／Ｉｇ融合表达载体的构建及表达成功，为ＰＴＡ１的功能及配体（ＰＴＡ１Ｌ）的研究打下了良好的基础。
张新海[7]2003年在《小鼠PTA1/CD226分子的基因克隆及其表达、分布和功能研究》文中研究指明人血小板T细胞活化抗原1(PTA1)是1985年发现的一个表达于血小板和活化的T细胞表面的分子，1997年基因克隆成功，并在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获准了新的CD编号(CD226)。自从发现该分子以来，对其结构、分布、功能以及与临床的关系等做了大量的研究，结果表明，人PTA1／CD226分子参与了T细胞的分化，也参与了血小板的活化和聚集；在结构上人PTA1／CD226是免疫球蛋白超家族的成员，并具有信号转导的功能；新近的研究更证实人PTA1／CD226参与了免疫突触的形成。在结肠癌等多种来源的细胞系表面发现有人PTA1／CD226分子配体的分布，另外LFA-1、4.1G、hDlg以及Rap1等分子可能与人PTA1发生作用。在临床上，与血小板功能异常、自身免疫性疾病、移植物抗宿主反应、病毒感染性疾病以及肿瘤等的发病有着密切的关系。因此，人PTA1／CD226是一个具有重要生物学功能和临床潜在应用前景的分子。 本博士论文是基于人PTA1分子研究的基础之上，克隆了小鼠PTA1分子的基因，并进行了其相应的表达、分布、分子特性、以及初步的功能学研究。主要的研究结果有： 利用人PTA1分子的氨基酸序列，从GenBank的EST数据库中检索出一段与人PTA1分子在氨基酸水平有51％的同源性的小鼠EST序列，并根据此EST序列设计特异性引物，采用RACE方法从BALB／c小鼠胸腺中克隆出小鼠PTA1分子的全长基因以及三个不同剪切体(异型)。结果表明，小鼠PTA1分子cDNA的开放读框有1002bp，编码333个氨基酸残基，比人PTA1分子少3个氨基酸残基；与人PTA1分子在核苷酸水平有67％的同源性，而在氨基酸水平有53％的同源性；在结构上，小鼠PTA1分子为穿膜蛋白，其胞膜外区由四个半胱氨酸组成两个免疫球蛋白V样结构域，而胞浆区具有磷酸化及与信号分子相作用的位点；编码小鼠PTAI分子的基因定位于小鼠第18号染色体，由7个外显子组成；通过对外显子和内含子的序列分析表明，所克隆的三种异型均符合mRNA的剪切规则。 将小鼠PTAI胞膜外区克隆入真核表达载体psecTagZB，通过转染COS7细胞、表达上清经抗MyC抗体亲和层析纯化获得融合蛋白dTA IMyC，免疫新西兰兔获得兔抗小鼠 PTA多克隆抗血清；将小鼠PTAI胞膜外区克隆入原核表达载体pGEX＊Tl，转化大肠杆菌BLZI，IPTG诱导表达，用所获融合蛋白GST－mPTAI免疫BAsB止小鼠，制备单克隆抗体；通过鉴定表明，兔抗小鼠PTAI多克隆抗血清可以识别天然的小鼠TPAI分子，因而可以用于免疫荧光、免疫沉淀、以及功能阻断实验等研究中；小鼠抗小鼠PTAI单克隆抗体7G10可以识别变性的小鼠 PTAI分子，因而在 Western Blot中检测小鼠 PTAI分子效果较理想。 采用逆转录PCR 原位杂交、以及免疫荧光染色等方法对小鼠PTAI的组织细胞分布特点进行了研究。其中，RTICR的结果表明：小鼠 PTA明确地表达于胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结等免疫组织，以及 EL．4和 P815等小鼠细胞系；脾脏原位杂交结果表明：小鼠PTAI mRNA阳性细胞主要分布于脾脏被膜下及动脉周围淋巴鞘区域，亦即成熟的T淋巴细胞所分布的区域；对小鼠胸腺、脾脏、淋巴结、骨髓来源的不同细胞进行免疫荧光染色，结果表明：小鼠PTAI分子主要表达于成熟T细胞表面，其中以CD3＋CD4CDS＋细胞表达最强，另外，单核巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞以及活化的DC也有一定水平的表达。 对小鼠胸腺瘤细胞系EL－4的PTAI表达情况进行了研究，结果表明，EL－4细胞在静止时 PTA有一定水平的表达，当受 TPA刺激活化后PTAI的表达上调；对活化的EL－4细胞进行PTAI兔疫沉淀可以获得分子量为60kDa的主带，另外还有两条分于量略小的条带，活化EL－4的培养上清亦可沉淀出一个小分子量条带，表明上清中有可溶性形式存在；提取 EL－4细胞的 RNA进行 Nowhern Blot研究，发现在未刺激 EL－4细胞即有PTAI mRNA的转录，当 TPA刺激一天后，转录水平大大提高，但当联合使用 TPA和 A23187后，PTAI的转录水平反而明显下降，该结果与在Jurkat细胞上研究人PTAI的结果相类似。 取C57BL历 ／J’鼠的DC细胞作为刺激细胞，BALB儿小鼠的纯化CD4＋和CDS＋T细胞作为反应细胞，进行淋巴细胞增殖实验，并在该系统中加入抗小鼠PTAI多克隆抗体，结果表明抗小鼠PTAI多克隆抗体对由异品系DC引起的小鼠T细胞的增殖反应有抑制作用，其中以CD4＋T细胞为明显。为了使功能阻断实验更为精确，我们又构建了能稳定分泌小鼠PTAI胞膜外区FC融合蛋白的细胞系CHO－11LAlffg，大量制备融合蛋白hal／lg，交联亲和层析柱，亲和纯化出特异性高的抗小鼠PTAI多克隆抗体，为进一步的功能学实验创造了条件。 4 通过对小鼠PTAI所进行的各种研究表明，作为人PTAI同源分子，小鼠 PTA在核酸和氨基酸组成、分子结构、分布等方面有许多相似性，但亦存在有一定的差异，表现在：（）尽管小鼠PTAI分子在胞浆区含有与人PTAI相同的结合SHZ?
王东琳[8]2008年在《CD226抗体治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究》文中指出人CD226曾先后被称为T细胞谱系特异性活化抗原(1 TLiSA1,1985)、血小板T细胞活化抗原1(PTA1,1989)DNAX辅助分子1(DNAM-1,1996),并于2000年首次以我国实验室为主要研究单位在国际人类白细胞分化抗原协作组(HLDA)大会上获得编号为CD226。该分子于1996年基因克隆成功,cDNA全长2603bp,包含7个外显子,开放读框编码336个氨基酸,胞浆区具有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。CD226分子与表达于杀伤性T细胞(CTL)和NK细胞的CD96(Tactile)分子在蛋白水平有22%的同源性,与BGP-1、CD36、PRR和果蝇神经胶质蛋白Neuroglian也有一定的同源性。CD226成熟蛋白由318个氨基酸组成,分子量约为65kDa,属免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白,表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨核/血小板谱系及活化的血管内皮细胞;广泛参与了免疫系统的生理和病理学功能,如T细胞、巨核细胞的分化,NK细胞对肿瘤细胞、病毒感染细胞的杀伤,血小板的活化与聚集,单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞等过程,并参与其中的信号转导。CD226分子体内天然配体于2003年得到鉴定,为同属于nectin/Necl家族的黏附分子:人脊髓灰质炎病毒受体(PVR/Necl-5/CD155)及其家族成员人PVR受体相关分子(PRR-2/nectin-2/CD112),CD112同时也是单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的受体。小鼠PTA1/CD226基因于2002年成功克隆,由7个外显子组成,编码完整小鼠CD226分子的cDNA开放读框有1002bp,编码333个氨基酸残基,小鼠CD226分子亦属免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白。小鼠CD226与人CD226在核苷酸水平有67%的同源性,而在氨基酸水平有53%的同源性。已证实mCD112和mCD155(Tage4)是mCD226的配体。小鼠CD226介导了抗原特异性CD8+T细胞共刺激信号的转导,并可参与肿瘤的免疫监视,而小鼠CD226分子在自身免疫调节中的作用尚未有较多的研究结果。Th17细胞和Th1细胞均可诱导自身免疫应答,但其二者的相互关系尚未清楚。EAE最初被认为是由Th1细胞介导的,但近期的越来越多的研究认为,部分器官特异性自身免疫性动物模型中,Th17细胞对于诱导整个免疫病理中是必不可少的,并提出EAE首先是由Th17细胞启动介导的理论。本实验就小鼠CD226分子在体外培养体系及体内功能实验所参与的自身免疫调节进行了初步研究。本研究中首先克隆化建立稳定表达mPTA1-Fc融合蛋白的CHO-mPTA1/Ig细胞株,通过培养上清制备mPTA1-Fc融合蛋白,并成功免疫新西兰大白兔动物,获得了较高的免疫血清,通过亲和层析的方法纯化出特异性的多抗,ELISA、SDS-PAGE电泳结果及免疫荧光流式检测显示,该多克隆抗体具有良好的生物学活性和较高的纯度。在单抗制备过程中,将融合蛋白免疫大鼠,利用杂交瘤技术,建立制备大鼠源性单抗的平台,从5400个克隆孔中,通过交叉筛选挑选出5株阳性克隆,利用裸鼠体内诱生腹水及无血清培养上清纯化获得了具有较高活性的单抗克隆抗体。所获得的5株单抗经ELISA、SDS-PAGE电泳结果及免疫荧光流式检测显示,有4株能很好的识别小鼠CD226的重组蛋白及天然分子,为后续研究mPTA1分子的表达、分布及功能提供了有利的研究工具。我们利用所制备的抗体通过免疫荧光染色技术检测小鼠PTA1在不同细胞系的表达情况。结果表明,在小鼠肥大细胞系、小鼠单核/巨噬细胞系PTA1分子表达较高。此外mPTA1分子在小鼠树突状细胞系表达较高,在B细胞也有组成性的表达。而在上皮细胞来源、纤维母细胞或低分化细胞来源细胞系上表达为阴性。本研究还发现正常小鼠脾淋巴细胞即有mPTA1分子的高表达,CD4+T细胞及CD8+T细胞均表达mPTA1分子,但CD8+T细胞表达更高,小鼠NK细胞及巨噬细胞表面也有mPTA1分子的表达。小鼠脾淋巴细胞经MLC培养7天后,其mPTA1的表达更加明显,CD8+mPTA1+细胞与CD4+mPTA1+细胞均有明显增多,而且以CD8+mPTA1+细胞更为显著。同时发现,作为小鼠PBMC的脾淋巴细胞在经MLC刺激的同时,与PTA1抗体共培养后,其细胞培养上清中Th1样细胞因子INF-γ水平明显升高,胞内细胞因子的荧光标记染色结果也有类似变化。提示PTA1分子可能在CD4+Th细胞分化中发挥了重要的免疫调节作用。为进一步研究小鼠PTA1分子所参与的免疫调节机制作用,我们又进行了mPTA1的体内功能实验。首先我们成功建立了自身免疫性疾病的经典动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽段并辅以结核杆菌及百日咳毒素免疫EAE敏感动物品系C57BL/6小鼠后,于免疫免疫后第10天开始陆续发病,出现EAE的典型临床神经系统症状,病程为慢性单时相进展型,约在第20天达到发病高峰,发病率达到70%,同时伴随脑组织的病理改变, HE染色检测结果发现,在脑白质区小血管周围有淋巴细胞浸润,即呈“袖套样”炎性结构改变。LFB染色发现在脑的冠状切片及脊髓纵向矢状切片中发现,白质区有LFB未着色区,髓鞘稀疏不连续,部分呈片状脱失。EAE模型小鼠的脾淋巴细胞IFN-γ的胞内染色水平表达较正常小鼠有明显下降,而IL-17水平增高了近70%。当小鼠EAE模型中注射mPTA1抗体时,发现EAE的发病率、发病时间及发病程度均有较好的缓解,发病率由60%减少到30%,发病起始时间由免疫后的第7天延缓至第14天,平均临床分数由2.2分降低至0.5分。同时,在对EAE组和抗体注射组的研究中发现,抗体注射组的脾淋巴细胞IFN-γ的胞内染色水平较EAE组升高了约85%,接近正常未免疫小鼠;而IL-17水平反而较EAE组降低了约87%。这些研究结果提示我们,抗mPTA1抗体对EAE有较强的保护机制之一可能是由于通过提高了EAE小鼠机体内IFN-γ的水平,从而抑制了IL-17的产生,进而减弱了IL-17诱导的自身免疫性炎症。
朱参胜[9]2007年在《人CD96分子表达和功能的研究》文中研究表明1992年,Wang及其同事发现并且克隆了一种新的细胞膜型分子,当时将其命名为Tactile(T cell activation increased late expression)。随后,在人类白细胞分化抗原协作组会议上将该分子命名为CD96。CD96分子表达于正常T细胞、T细胞克隆以及某些转化的T细胞系。外周血T细胞表达低水平的CD96分子,活化后其表达明显上调,并在刺激后第6~9天表达达到高峰值。在同种异体抗原刺激的条件下,NK细胞上CD96的表达也发生上调。CD96属于免疫球蛋白超家族,胞膜外区包含3个免疫球蛋白样结构域,共有15个N-连接糖基化位点,还有1个高度O-连接糖基化富含丝/苏/脯氨酸残基的茎状结构域,跨膜区有24个氨基酸残基,胞质区含44个氨基酸残基,并有一个富含碱性/脯氨酸的区域。自克隆CD96分子后的十多年间,由于不清楚其配体,该分子的研究无明显进展。直到2004年,Fuchs及其同事发现NK细胞可通过CD96识别PVR(CD155),促进NK细胞对表达CD155靶细胞的黏附,介导NK细胞对靶细胞表面上CD155的内化作用。由于PVR(CD155)高表达于某些肿瘤细胞,这一受体系统可能在NK细胞对肿瘤的识别和杀伤中起重要作用。然而,迄今为止对CD96表达和功能的认识还十分有限。在本课题中,我们通过对CD96分子的生物信息学分析,发现CD96的同源分子有CD166、CD113、CD226和CD86，预测CD96分子的配体结合位点为Y177、T186、T245、T246和V249，可结合配体上GLU-LYS-VAL保守序列。也发现CD96分子的胞质区有1个高度保守的ITIM模体，跨膜区有1个能结合跨膜型接头分子带正电的精氨酸残基。这些结果为进一步探讨CD96分子的功能及其信号转导途径提供了重要的启示。采用PHA刺激上调人T淋巴细胞系HSB-2细胞CD96分子的表达，用RT-PCR成功从该细胞中克隆出CD96分子胞膜外区第一免疫球蛋白V样结构域的cDNA基因，并将该cDNA插入pCDM18-T载体中，经过测序证实该序列正确。从pCD96-D1-T载体中通过双酶切得到CD96-D1 cDNA片段，将该cDNA插入到载体pCDM7中构建出pCDM7-CD96-D1真核表达载体。用脂质体将该载体的质粒转染CHO细胞，表达出CD96-D1-Fc融合蛋白。用抗-Fc mAb亲和层析柱对CD96-D1-Fc融合蛋白进行纯化。以纯化后的CD96-D1-Fc融合蛋白为免疫原制备了17株抗人CD96-D1 mAbs。用ELISA、FCM、Western Blot等方法对这些抗体进行了鉴定。按常规方法制备腹水，用饱和硫酸铵和阴离子交换层析法对抗CD96-D1 mAbs进行纯化。用过碘酸钠氧化法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗CD96-D1 mAbs，以建立测定可溶型CD96的夹心ELISA试剂盒。从抗CD96-D1 mAbs和HRP标记的CD96-D1 mAbs中筛选出最佳抗体配对，即包被抗体采用抗CD6-D1-No.5 mAb，检测抗体采用HPR标记的抗CD96-D1-No.13 mAb。对包被抗体和HPR酶标检测抗体的工作浓度进行优化，建立了测定可溶型CD96的夹心ELISA试剂盒。该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度和稳定性均令人满意，为可溶型CD96的研究奠定了重要基础。我们对CD96在多种造血、非造血细胞系以及正常人PBmAb，检测抗体采用HPR标记的抗CD96-D1-No.13 mAb。对包被抗体和HPR酶标检测抗体的工作浓度进行优化，建立了测定可溶型CD96的夹心ELISA试剂盒。该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度和稳定性均令人满意，为可溶型CD96的研究奠定了重要基础。我们对CD96在多种造血、非造血细胞系以及正常人PBMC中的表达情况进行了系统研究,发现CD96在造血和非造血细胞系中表达十分广泛。CD96也表达于正常人CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞和NK细胞。在PHA刺激后，CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞上CD96表达明显上调，证实CD96是一种活化表达增加的分子。但PHA对单核细胞CD96的表达上调作用不十分明显，提示不同细胞上CD96分子的表达调节具有不同特点。对CD96分子对细胞因子分泌的影响也进行了研究，发现用CD96-DI mAb交联正常人PBMC细胞上CD96受体，能促进PBMC细胞TNF和IL-10的分泌。单独CD96-D1 mAb的刺激并不能始动IL-2的分泌，但CD96-D1 mAb能促进同种异体抗原诱导的IL-2分泌。另外，CD96-D1 mAb交联CD96对IFN-γ和IL-4的分泌未发生明显影响。这些结果提示CD96分子在免疫调控、炎症反应、T细胞增殖和分化中可能发挥着重要作用。对CD96介导杀伤作用也进行了研究。在CD96-D1 mAb介导的重导向杀伤实验系统中，观察到CD96-D1 mAb能介导MLC中反应细胞对P815细胞的重导向杀伤。也发现CD96-D1 mAb能抑制MLC中反应细胞对K562细胞的杀伤，证实CD96为NK细胞的活化性受体，说明CD96胞膜外N-端第一免疫球蛋白V样结构域为参与CD96/CD155结合的主要结构域。CD96分子具有十分重要的生理功能，尤其是该分子参与NK细胞对肿瘤细胞的杀伤和黏附。本文研究了CD96结构、表达和功能，对弄清其信号转导通路和生理功能具有重要意义。
张新海, 杨琨, 贾卫, 欧阳为明, 刘莹[10]2003年在《含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用》文中提出目的 :构建含 3C蛋白酶酶切位点的人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体 ,并进行表达和初步鉴定。方法 :将人CD2 2 6分子的胞膜外区基因 ,克隆入含 3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体 p 3C Ig中。测序证实后 ,转染COS7细胞并进行瞬时表达。表达产物经亲和层析柱纯化 ,并通过免疫荧光染色及 3C蛋白酶酶切反应进行鉴定。结果 :经表达和纯化获得CD2 2 6胞膜外区的Ig融合蛋白。该融合蛋白可与表达于ECV30 4细胞表面的CD2 2 6配体有效结合。同时 ,融合蛋白的Fc段亦经 3C蛋白酶切除 ,从而获得CD2 2 6胞膜外区的真核表达分子。结论 :成功地获得了含有 3C蛋白酶酶切位点的人CD2 2 6分子胞膜外区Ig真核表达产物 ,为进一步对CD2 2 6分子进行结构和功能研究 ,以及X线结晶衍射提供了重要条件
参考文献：
[1]. 血小板/T细胞活化抗原1融合蛋白的表达、纯化及其配体的初步鉴定[D]. 孙凯. 第四军医大学. 1998
[2]. CD226分子与肿瘤和实验性自身免疫性脑脊髓炎关系的研究[D]. 徐竹蔚. 第四军医大学. 2009
[3]. CD226及其配体CD112/CD155分子相互作用机制的研究[D]. 庄然. 第四军医大学. 2007
[4]. 人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)亲和层析柱的制备及PTA1/Ig的纯化[J]. 孙凯, 金伯泉, 孙忱, 朱勇, 贾卫. 细胞与分子免疫学杂志. 1998
[5]. 血小板/T细胞活化抗原PTA1配体的初步鉴定[C]. 孙凯, 金伯泉, 冯琦, 朱勇, 杨琨. 面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）. 1999
[6]. 人血小板/T细胞活化抗原PTA1/Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定[J]. 孙凯, 金伯泉, 孙忱, 田方, 朱勇. 细胞与分子免疫学杂志. 1998
[7]. 小鼠PTA1/CD226分子的基因克隆及其表达、分布和功能研究[D]. 张新海. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[8]. CD226抗体治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究[D]. 王东琳. 第四军医大学. 2008
[9]. 人CD96分子表达和功能的研究[D]. 朱参胜. 第四军医大学. 2007
[10]. 含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用[J]. 张新海, 杨琨, 贾卫, 欧阳为明, 刘莹. 细胞与分子免疫学杂志. 2003