（1中山大学孙逸仙纪念医院儿科 广东 广州 510120）
（2中山大学附属第七医院儿科 广东 深圳 518107）
【摘要】目的：探讨抗胰岛素生长因子Ⅰ型受体（IGF-ⅠR）单克隆抗体对ALL细胞株细胞周期的影响。方法：以ALL细胞株Jurkat及Reh为研究对象，用浓度分别为0和lμg/ml的抗IGF-ⅠR单克隆抗体（ab16890）及胰岛素（10-8mol/L）共培养两种细胞株各48h，收集两组细胞，以70％乙醇2ml 4℃固定24h，上机检测两组的细胞周期。结果：以1μg/ml的ab16890及胰岛素共同作用于Jurkat及Reh细胞后，与对照组相比，G0/G1期的细胞明显增多（P值均小于0.05），说明加药后使两种细胞株均阻滞在G0/G1期。结论：抗IGF-ⅠR单克隆抗体（ab16890）可诱导两种ALL细胞株凋亡并使细胞阻滞在G0/G1期。
【关键词】儿童；急性淋巴细胞白血病；抗IGF-ⅠR单克隆抗体；细胞周期
急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童时期发病率最高的恶性肿瘤，是由造血干细胞增殖分化异常而引起的恶性血液病。目前在几乎所有的国内外儿童ALL化疗方案中，左旋门冬酰胺酶（L-asp）和糖皮质激素是诱导缓解方案中首选的有效治疗药物。但是，L-asp与糖皮质激素联合诱导化疗的同时也会妨碍胰岛素的产生、释放及功能，这两种药物均易诱发高血糖，发生率为4%～20%。并发高血糖导致肿瘤患者预后不良，除外高血糖增加感染的几率外，高血糖本身合并的高胰岛素及高胰岛素生长因子Ⅰ型受体（IGF-ⅠR）水平或使用胰岛素控制高血糖导致的高胰岛素水平，也可能是导致该现象的原因之一。本课题通过体外实验探讨抗IGF-ⅠR单克隆抗体（anti-IGF-ⅠR monoclonal antibodies mAbs)对ALL细胞株Jurkat及Reh细胞周期的影响，间接证实IGF-ⅠR介导的AKT/mTOR通路在细胞凋亡中的可能作用。
1.材料和方法
1.1 一般资料
研究靶细胞为：Jurkat（人T淋巴细胞性白血病细胞）、Reh（人急性非B非T淋巴细胞白血病细胞），细胞株购自上海科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将Jurkat及Reh细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2天进行半量传代。
1.2 流式细胞仪检测细胞周期
取对数期生长的细胞，调整细胞密度为3×105/ml，接种于24孔培养板.每孔加入lml细胞液，加入终浓度为0和lμg/ml的抗IGF-ⅠR单克隆抗体（ab16890），培养48h，收集对照组和处理组细胞，PBS洗涤2次，70％乙醇2ml 4℃固定24h。离心弃上清，PBS洗涤2遍后加人300μ1碘化丙啶(PI)染液重悬细胞，4℃避光孵育后上机检测，所有试验重复3次。
2.结果
以1μg/ml的ab16890作用于ALL细胞株后上机检测细胞周期，在Jurkat细胞中（表1、图1），与对照组相比，G0/G1期的细胞明显增多（P=0.025），S期细胞减少（P=0.047），而G2/M期细胞变化不大（P=0.478），说明加药后使细胞阻滞在G0/G1期。
Table.1 The percentage of each phase in theJurkat cells cycle that compared between two groups
Figure.2 The distribution of each phase of study variables between two groups were in Reh cell cycle compared betweentwo analyzed by paired T test.groups were showed using histogram.
急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童时期发病率最高的恶性肿瘤，是由造血干细胞增殖分化异常而引起的恶性血液病。目前在几乎所有的国内外儿童ALL化疗方案中，左旋门冬酰胺酶（L-asp）和糖皮质激素是诱导缓解方案中首选的有效治疗药物。但是，L-asp与糖皮质激素联合诱导化疗的同时也会妨碍胰岛素的产生、释放及功能，这两种药物均易诱发高血糖，发生率为4%～20%。并发高血糖导致肿瘤患者预后不良，除外高血糖增加感染的几率外，高血糖本身合并的高胰岛素及高胰岛素生长因子Ⅰ型受体（IGF-ⅠR）水平或使用胰岛素控制高血糖导致的高胰岛素水平，也可能是导致该现象的原因之一。本课题通过体外实验探讨抗IGF-ⅠR单克隆抗体（anti-IGF-ⅠR monoclonal antibodies mAbs)对ALL细胞株Jurkat及Reh细胞周期的影响，间接证实IGF-ⅠR介导的AKT/mTOR通路在细胞凋亡中的可能作用。
1.材料和方法
1.1 一般资料
研究靶细胞为：Jurkat（人T淋巴细胞性白血病细胞）、Reh（人急性非B非T淋巴细胞白血病细胞），细胞株购自上海科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将Jurkat及Reh细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2天进行半量传代。
1.2 流式细胞仪检测细胞周期
取对数期生长的细胞，调整细胞密度为3×105/ml，接种于24孔培养板.每孔加入lml细胞液，加入终浓度为0和lμg/ml的抗IGF-ⅠR单克隆抗体（ab16890），培养48h，收集对照组和处理组细胞，PBS洗涤2次，70％乙醇2ml 4℃固定24h。离心弃上清，PBS洗涤2遍后加人300μ1碘化丙啶(PI)染液重悬细胞，4℃避光孵育后上机检测，所有试验重复3次。
2.结果
以1μg/ml的ab16890作用于ALL细胞株后上机检测细胞周期，在Jurkat细胞中（表1、图1），与对照组相比，G0/G1期的细胞明显增多（P=0.025），S期细胞减少（P=0.047），而G2/M期细胞变化不大（P=0.478），说明加药后使细胞阻滞在G0/G1期。
Table.1 The percentage of each phase in theJurkat cells cycle that compared between two groups
Figure.2 The distribution of each phase of study variables between two groups were in Reh cell cycle compared betweentwo analyzed by paired T test.groups were showed using histogram.
3.讨论
目前已有体外实验证实，胰岛素促进肿瘤细胞的生长，主要是通过活化AKT/mTOR信号通路途径。PI3K/AKT/mTOR是细胞内重要的信号传导通路之一，通过活化多种下游的效应分子，介导重要的细胞生理功能，包括促进细胞的增殖、活力和抑制凋亡、自吞噬，与人类多种肿瘤的发生发展密切相关[1]。而IGF-Ⅰ是PI3K/AKT信号通路的上游调节因子，发生高血糖时机体胰岛素分泌，体内的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ产生增加，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ通过与IGF-1R结合募集PI3K到细胞膜并使其被激活，从而活化AKT/mTOR信号通路，产生下游生物学效应。近十年以来，以IGF-ⅠR为靶点进行靶向治疗逐渐成为肿瘤药物研究的热点[2]。目前，体外实验及临床肿瘤活体样本研究均发现，肿瘤的进展多与IGF-ⅠR表达量的增多有关[3]，且IGF-ⅠR的高表达往往伴随着较差的预后。因此，阻断IGF-ⅠR的活化当前已尽可能的应用于各种肿瘤治疗中。抗IGF-ⅠR单克隆抗体作为一种靶向结合蛋白，可与IGF-ⅠR特异性结合，抑制IGF-ⅠR与其配体的结合，从而阻断其介导的通路信号并较弱下游生物学效应。本实验采用abcom公司生产的抗IGF-ⅠR单克隆抗体ab16890，以ALL细胞株为研究对象，探讨抗IGF-ⅠR单克隆抗体对细胞周期的影响和可能机制。对于阻断AKT/mTOR信号通路对细胞周期的影响，有研究发现PI3K的过度活化是细胞发生癌变的必要因素。PI3K能够激活细胞周期依赖性蛋白激酶,使细胞从G0/G1期进入S期，诱导DNA的合成，同时PI3K也能对细胞周期依赖蛋白抑制物p27的表达产生调节作用。Collado等[4]应用PI3K的抑制剂LY294002作用于人胶质瘤U87MG细胞,结果发现p27表达升高,细胞阻滞在G0/G1期。另有文献报道[5]，采用抗IGF-ⅠR单克隆抗体MK-0646作用于子宫内膜癌两种细胞株ECC-1及USPC-1后检测细胞周期，与IGF-Ⅰ处理细胞后相比，两种细胞G0/G1期细胞比例均增加，同时S+G2/M期细胞减少。本实验采用流式细胞术检测在胰岛素的基础上加用1μg/mlab16890培养后细胞周期的变化，与阴性对照组相比，G0/G1期的细胞明显增多（P=0.025、0.020），S期细胞减少（P=0.047、0.031），而G2/M期细胞变化不大（P=0.478、0.045），说明加药后使细胞阻滞在G0/G1期，与上述文献报道一致，猜测ab16890诱导ALL细胞凋亡并使细胞阻滞在G0/G1期可能与胰岛素介导的AKT/mTOR信号通路受到阻滞有关。
【参考文献】
[1] Samani AA, Yakar S, LeRoith D, et al. The role of the IGF system incancer growth and meta stasis: overview and recent insights. Endocr Rev 2007; 28: 20-47.
[2] Gombos A, Metzger-Filho O, Dal Lago L, et al. Clinical development of insulin-like growth factor receptor-1 (IGF-1R) inhibitors: At the crossroad? Investigational New Drugs, 2012; 30(6): 2433-2442.
[3] P. Sch?ffski, D. Adkins, J-Y Blay，et al. An open-label, phase 2 study evaluating the efficacy and safety of the anti-IGF-1R antibody cixutumumab in patients with previously treated advanced or metastatic soft-tissue sarcomaor Ewing family of tumours. European Journal of Cancer, 2013; 49: 3219-3228.
[4] Lowas SR, Marks D, Malempati S. Prevalence of Transient Hyperglycemia During Induction Chemotherapy for Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia. Pediatr Blood Cancer，2009; 52(7): 814-818.
[5] Connie B, Rive S, Menahem S, et al. IGF1R-directed targeted therapy enhances the cytotoxic effect of chemotherapy in endometrial cancer. Cancer Letters, 2013; 335: 153-159.
通讯作者：陈纯，主任医师，教授，博士生导师。E-mail:chenchun69@126.com
论文作者:王健1,林少汾1,董红1,陈纯2(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2018年32期
论文发表时间:2018/12/11
标签：细胞论文; 细胞株论文; 胰岛素论文; 周期论文; 淋巴细胞论文; 单克隆抗体论文; 高血糖论文; 《医药前沿》2018年32期论文;