王舒[1]2003年在《杆状病毒（Baculovirus）膜融合蛋白的研究》文中提出本论文共包括3章。 第一章 对杆状病毒的膜融合蛋白的研究进展作了综述性介绍，包括GP64与F蛋白的结构与功能，几种病毒膜融合蛋白的替换关系，GP64表面展示的应用。 第二章 利用Bac-to-Bac系统，构建了带有AcMNPV膜融合蛋白GP64的重组病毒HaSNPVgp64+egfp+和对照病毒HaSNPVegfp+，Western blot分析表明，证明GP64可在HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1中表达，并被成功地包装入子代BV。HaSNPVgp64+egfp+感染Sf21细胞的空斑实验，发现在Sf21细胞中形成有感染性的病毒粒子。第叁章 对两个属于不同种群NPV的膜融合蛋白的相关性进行了研究。利用Bac-to-Bac系统，在前期构建的缺失Ha133基因的Bacmid HaBacHa133-基础上,构建了转座gp64基因的重组Bacmid HaBacHa133-gp64+egfp+。通过其对HzAMI细胞的转染和上清对Sf21细胞的感染及转染-空斑的方法，未检测到在HzAMI-HaSNPV系统中产生有感染性的病毒粒子，表明GP64不能功能性地替代F蛋白HA133，并对这一结果进行了讨论。
董小龙[2]2016年在《家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa的鉴定及其在BmNPV入侵中的功能研究》文中研究说明杆状病毒是一类有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,其基因组大小为80-180 kb,以节肢动物为其专一宿主,被广泛的用作昆虫杀虫剂,同时也被用作基因治疗的转移载体和真核表达载体。杆状病毒隶属Baculoviridae,根据其不同的形态学特征可将其划分为核型多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV)两类;根据其对宿主的特异性又可划分为Alpha杆状病毒、Beta杆状病毒、Gamma杆状病和Delta杆状病毒四类。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一类典型的NPV病毒,它所引起的核型多角体病(血液型脓病)对养蚕业的危害极其严重,其造成的经济损失占整个蚕病损失的70%左右,严重影响了蚕丝的产量和质量,减少了蚕农的收入,威胁了我国蚕丝业的稳定和在国际市场上的主导地位。近年来,随着对BmNPV研究的深入,部分与BmNPV抗性相关的家蚕基因被鉴定出来,但是BmNPV的入侵机制始终未能解析清楚。本实验室建立并保存了两株来源于同一品种家蚕幼虫卵巢组织,但对BmNPV感染的敏感性存在显着差异的细胞系—BmN-SWU1和BmN-SWU2,其中BmN-SWU1细胞对BmNPV的感染极其敏感,而BmN-SWU2对BmNPV具有明显的抗性。在前期关于两株细胞系的差异研究中,发现BmN-SWU1和BmN-SWU2细胞系对BmNPV感染敏感性的差异主要是BmNPV入侵BmN-SWU2细胞的过程受到限制。本研究通过iTRAQ蛋白定量技术对BmN-SWU1和BmN-SWU2两株细胞系的蛋白质组差异进行了比较分析,筛选差异的膜蛋白特别是与受体功能相关的膜蛋白,期望通过对这些膜蛋白的研究来解释造成这一差异的主要原因,为阐明BmNPV入侵的详细过程奠定基础,也为从源头控制BmNPV的感染提供理论依据。主要的研究成果如下:1.BmN-SWU1和BmN-SWU2两株细胞系的蛋白质组差异分析本部分通过iTRAQ蛋白定量技术对两株细胞系进行了蛋白质组分析,通过质谱分析鉴定到18952个肽段,匹配到的蛋白质数量为3955个,并对所有鉴定出的蛋白进行go功能注释分析。然后以bmn-swu2为对照对bmn-swu1和bmn-swu2两个样品的的蛋白质丰度进行比较,共检测到629个差异蛋白,其中348个上调蛋白,281个下调蛋白。对这些差异表达的蛋白进一步筛选得到4个膜蛋白,对筛选到的膜蛋白进行深入的分析,鉴定到一个差异倍数大于5,且可能具有增强膜上受体功能作用的膜蛋白——bgibmga013777。荧光定量pcr检测的结果也证实该基因在bmn-swu2中的表达量远低于其在bmn-swu1中的表达量,由此我们将该蛋白锁定为目的蛋白。2.bmreepa基因的鉴定及定位分析受体表达增强蛋白(reep)是一类与细胞表面受体功能有关并且参与跨膜转运的蛋白,这一家族在不同物种之间高度保守。reep家族成员均包含一个tb2/dp1,hva22结构域及2-3个跨膜结构域。在脊椎动物中reep家族一般存在5-6个成员分别命名为reep1-reep6,并且被划分成两个亚家族reep1-reep4和reep5-reep6,而无脊椎动物中reep家族的成员一般为2个。本部分通过对bmreepa基因的序列分析发现该基因含有reep基因保守的tb2/dp1,hva22结构域和叁个跨膜结构域;系统发生分析显示bmreepa聚类在reep5-reep6亚家族中。通过免疫荧光和westernblotting分析发现该基因定位于细胞质膜上且其n-末端伸向细胞外而c-末端面向细胞质;通过对该基因的表达模式分析发现其在家蚕五龄叁天幼虫的中肠中和化蛹第一天时表达量最高,这一结果暗示该基因可能与脂类物质的代谢或运输相关。3.bmreepa基因对bmnpv入侵的影响本部分通过在敏感细胞系bmn-swu1和抗性细胞系bmn-swu2中分别干涉和过表达bmreepa基因,探索细胞水平bmreepa基因对bmnpv入侵的影响,结果显示:在bmn-swu1中干涉bmreepa可以明显的抑制bmnpv对bmn-swu1细胞的感染;在bmn-swu2中过表达bmreepa可以一定程度上解除bmn-swu2对bmnpv入侵的抑制作用;同时bmreepa可以与bmnpv入侵的关键囊膜蛋白gp64发生相互作用。利用显微注射技术创制了bmreepa干涉的家蚕品系,通过注射和口服感染两种方式使转基因品系和非转基因品系家蚕幼虫感染bmnpv,然后通过致死率分析及病毒基因表达分析来验证该基因在个体水平对bmnpv感染的影响,结果发现bmreepa干涉的家蚕品系中bmnpv的感染能力相比于非转基因家蚕品系被明显的抑制,且这种抑制主要存在于二次感染的过程中,即bv粒子对其它组织的感染。4.bmreepa相互作用蛋白鉴定本部分以bmreepa蛋白为诱饵蛋白通过免疫共沉淀的方法对bmreepa的相互作用蛋白进行了筛选,鉴定到一个具有受体特性且与胆固醇运输相关的蛋白bmptchd;通过进一步的验证发现BmREEPa、BmPtchd以及GP64可以形成一个蛋白复合体。通过研究BmREEPa和BmPtchd基因与胆固醇之间的关系发现,当细胞胆固醇升高时,BmREEPa和BmPtchd基因的表达量均上调,而当细胞胆固醇被移除时BmPtchd基因的表达量下调,而BmREEPa的表达量依旧上调。由此推测:BmREEPa可能在胆固醇代谢运输以及合成过程中都发挥作用,而BmPtchd基因可能仅在胆固醇代谢运输中发挥作用。本研究的结果表明,BmREEPa定位于细胞质膜上,且其N-末端对其定位具有重要的作用;该基因不论在细胞水平还是个体水平都对BmNPV的入侵具有影响,且这种影响主要针对于BV的感染;同时还发现该基因与细胞胆固醇的调节也有密不可分的关系,而胆固醇又是BmNPV入侵不可缺失的因子。综上所述,BmREEPa在整个BmNPV入侵的过程中发挥了重要的作用,此结果不仅为阐明BmNPV入侵的详细机制奠定了基础,同时也为REEP基因的研究提供了一个新的方向。
冯敏[3]2018年在《家蚕核型多角体病毒入侵宿主机制及囊膜融合蛋白GP64与宿主蛋白的互作研究》文中提出家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)属于杆状病毒家族的α-杆状病毒属,是引起家蚕病害的主要病原。BmNPV在感染宿主细胞的过程中会产生两种遗传物质相同但形态结构各异的病毒粒子,即出芽型病毒粒子(BV)和包涵体衍生型病毒粒子(ODV)。ODV经口感染昆虫中肠引发原发性感染后,产生的BV随后感染其他细胞引起水平传播,最终导致宿主的全身性感染。GP64是BV的一种主要囊膜融合蛋白,在介导病毒感染和水平传播过程中发挥了关键作用。本研究旨在探究BV入侵宿主的分子机制,鉴定与BV结合的细胞表面蛋白,以及筛选宿主细胞中的GP64互作蛋白,从分子水平阐述杆状病毒出芽型病毒粒子BV入侵宿主细胞以及病毒主要囊膜蛋白GP64与宿主互作的分子机制。主要结论如下:1、BV病毒粒子入侵宿主细胞的机制利用内吞体酸化抑制剂在BV感染前处理家蚕BmN细胞,发现病毒增殖受到显着抑制,表明BV通过低pH介导的内吞作用途径进入BmN细胞。利用网格蛋白依赖的内吞作用途径抑制剂处理以及siRNA干扰网格蛋白重链CHC表达,结果表明网格蛋白介导的内吞作用途径参与了 BV入侵宿主细胞过程。此外,动力蛋白抑制剂处理实验证明了动力蛋白参与了 BV对宿主细胞的有效入侵。进一步通过siRNA干扰胞内囊泡运输和融合调控因子Rab蛋白,结果显示BV感染过程受到Rab5和Rab7调控,而Rabll不参与其中,表明早期和晚期内体的运输在BV病毒粒子入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。2、与BV结合的宿主表面蛋白筛选利用病毒覆盖蛋白结合实验,分离并纯化BV病毒粒子以及BmN细胞表面蛋白,并进行孵育。利用GP64抗体检测到3个明显蛋白条带,表明细胞表面存在与病毒相互作用的蛋白。进一步通过质谱分析,从3个阳性分离胶条中共鉴定到158种蛋白。GO分析表明这些蛋白涉及细胞组分、分子功能和生物过程。蛋白分子功能聚类结果显示,在这些鉴定到的蛋白中结合活性蛋白占比45%,转运活性蛋白占比4%,催化活性蛋白占比32%。以上数据为进一步鉴定与BV结合的宿主细胞膜蛋白受体打下了基础。3、BV关键囊膜融合蛋白GP64与宿主互作蛋白鉴定构建了家蚕BmN细胞酵母文库,以GP64作为诱饵蛋白进行酵母文库杂交分析,共筛选到8个与GP64结合的候选蛋白,分别为E3泛素连接酶SINA-like 10(E3 ubiquitin-protein ligase SINA-like 10)、RAN 结合蛋白 9(ran-binding protein 9)、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazolecarboxylase)、卵裂和多腺苷化特异性因子 5(cleavage and polyadenylationspecific factor 5)、Abrupt-like 蛋白(protein abrupt-like)、NADH 泛醌氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase),以及两个未知蛋白 uncharacterized protein LOC101738779 和scaf49 2190774-2191531(-)。4、GP64互作蛋白SINAL10对病毒感染的影响对上述酵母双杂交鉴定的8个候选蛋白作进一步免疫共沉淀验证,发现E3泛素连接酶SINA-like 10(SINAL10)与GP64存在体外相互作用且在细胞内存在共定位。过表达和siRNA抑制实验表明SINAL10能够促进病毒在细胞内增殖,并在病毒的感染周期中发挥重要作用。本论文研究结果初步揭示了家蚕BmNPV BV入侵宿主细胞的途径,明确了该过程涉及网格蛋白介导的内吞作用,依赖于动力蛋白功能,并受到Rab5和Rab7蛋白调控,从分子水平上初步揭示了BV入侵宿主的机制。初步筛选了与病毒结合的细胞表面蛋白,并对其功能进行了注释分析。进一步利用酵母双杂交技术筛选到8个与病毒关键囊膜融合蛋白GP64相互作用的宿主靶标蛋白,并鉴定了其中一个蛋白SINAL10与GP64的互作关系,证明该蛋白对BV增殖具有促进作用。
梁昌镛[4]2005年在《杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的研究》文中认为杆状病毒作为异源病毒进入哺乳动物细胞是近年来发现的一个新现象。虽然有一些研究组在这个领域已经做了许多卓越的工作,但是对杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的机制还没有完全阐明。另外,杆状病毒是一个非常大的家族,不同杆状病毒之间也存在较大的差别,因此具有不同膜蛋白的杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的机制可能也是不一样的。本文旨在通过对不同类型的杆状病毒侵入哺乳动物细胞的特性以及引起的细胞反应的研究,揭示杆状病毒侵入哺乳动物细胞的效率,哺乳动物细胞对杆状病毒入侵的反应,以及杆状病毒膜蛋白在病毒侵入中的功能,为进一步将杆状病毒开发成基因治疗载体打下基础。第一章以综述的形式描述了杆状病毒的病毒学特点,病毒侵入昆虫细胞的机制,膜蛋白的结构与功能,同时介绍了基因治疗的基本概念和常用的基因治疗载体系统。最后,介绍了目前杆状病毒作为基因治疗载体的研究现状。杆状病毒AcMNPV 已经显示能高效地进入许多类型的哺乳动物细胞系,而且还表现出对肝细胞系的偏好。第二章阐明了AcMNPV 也表现出对转导哺乳动物肾细胞的偏好。AcMNPV 介导报告基因-绿色荧光蛋白基因在多种传代的哺乳动物(小鼠、仓鼠、猴、猪和人)肾细胞系和原代的小鼠肾细胞中高效表达。但是报告基因必须由哺乳动物启动子启动。报告基因的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正相关,而且,丁酸钠的添加能显着提高报告基因的表达水平,由于丁酸盐是去乙酰化酶的抑制剂,可以促进沉默基因的表达,说明杆状病毒的实际转导率比正常情况下表达报告基因的细胞比率更高。另外,杆状病毒介导的报告基因能在肾细胞中表达一段较长的时期,而且杆状病毒的转导对细胞没有明显的毒性。这表明AcMNPV 具有作为基因治疗载体的优良特性。另外,还发现杆状病毒AcMNPV 能刺激哺乳动物细胞SMMC-7721 细胞产生抗病毒的活性,而使SMMC-7721 细胞获得抵抗水疱口膜炎病毒(Vesicular Stomatitis virus VSV)感染的能力。杆状病毒AcMNPV 诱导SMMC-7721 细胞产生抗病毒状态的主要成分为干扰素α/β。然而,重组杆状病毒AcMNPV 并不能介导哺乳动物启动子控制的报告基因在SMMC-7721 细胞中表达。该病毒在WISH 细胞中则既能诱导抗病毒状态又能介导转基因的表达。而在BHK 细胞和
龙钢[5]2002年在《棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus HaSNPV）的独特基因（Ha122）和膜融合蛋白基因（Ha133）功能研究》文中研究说明本论文共包括4章 第一章首先对杆状病毒的研究历史作了综述性报道，包括病毒的分类学研究，病毒结构和感染循环等。对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)的研究历史和近期对HaSNPV的基因组学研究以及本论文的研究内容作了简要介绍。 第二章对HaSNPV基因组中的HindⅢ-Ⅰ片段的序列进行分析，该片段全长7501bp，包括十个开放阅读框：AcMNPV ORF111的同源基因(Ac111)，晚期表达因子2(lef-2)基因，病毒核壳结构蛋白p24基因，gp16基因，多角体包膜蛋白(poiyhedrin envelope protein，pep)基因，AcMNPVORF63的同源基因(Ac63)，38.7kd基因，晚期表达因子1(lef-1)基因，及两个特有基因HaSNPV orf591(Ha122)和HaSNPV orf435(Ha125)。基因组的排列比较分析发现与AcMNPV有较大区别。 HaSNPV基因组中含有20个独特开放阅读框架。第叁章对HaSNPV中独特基因Ha122进行了深入的分子生物学分析。转录时相显示Ha122从感染后8小时开始转录成一个添加多聚A尾的转录产物，一直延续到感染后72小时。5’RACE(Rapid Amplification of cDNA End)分析结果表明Ha122基因的转录主要从翻译起始密码子上游第47个碱基起始，该处有一个晚期转录信号TAAG。3’RACE分析结果表明转录的终止位点在翻译终止密码子下游的27个碱基处。用原核表达的蛋白免疫鸡，得到特异性的鸡源多克隆抗体。Western blot结果显示HSNPV感染的细胞中有HA122蛋白，分子量为21kDa。将Ha122与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，在昆虫细胞中瞬时表达。当有病毒感染同时发生时，GFP信号定位在核内。进一步的研究显示，HA122蛋白特异的存在于多角体病毒核衣壳中。已获得的研究结果表明该独特基因编码一个特异存在于ODV核衣壳中的结构蛋白。 杆状病毒膜融合蛋白(EFP)是病毒功能及分类研究的一个重要蛋白，包括AcMNPV GP64，LdMNPVLD130，SeMNPVSE8和HaSNPV HA133。第四章对HaSNPV的膜融 中国科学院硕士学位论文 中义摘要 合蛋白基因（Haj33）的功能做了深入的研究。首先对 HaSNPV的出芽病毒的主蛋白进 行测序，结果表面该蛋白由Ha133的C端大片段编码。基于此我们制备两个特异地作 用于＊片段（aal64677）和 FZ片段（aall59）的鸡源多克隆抗体。Western blot结果 显示＊ （62kDa）和 FZ（20kDa）同时存在于 HaSNPV BV中，并以 H硫键结合成 FO （一80kDa）。转录和翻译的时相显示该基因的转录和蛋白翻译是从感染后24小时开始。 衣酶素抑制实验显示只有FZ片段被N糖基化。gP64缺失并引入Ha13叁的重组ACMNPV 能感染SN细胞系，这表明Ha1刀能拯救gp64缺失的ACMNPV并实现功能互补。对 该重组病毒 BV的 Western blot检测，结果表明 FI和 FZ同时存在并以二硫键相连。在 HaSNPV BV中没有发现HA133的多聚体，然而该重组病毒BV中却有叁种HA133的 多聚体存在。
徐智鹏[6]2014年在《苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白在酵母细胞中的表达》文中指出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是多角体杆状病毒科的典型代表，能感染30多种鳞翅目昆虫，该病毒的基因组是由大小为134kb的环状单一双链DNA分子组成。感染宿主后的核型多角体病毒有两种表型：一种为包涵体病毒(ODV)，另一种则为非包涵体病毒(BV)。目前只在BV颗粒中发现Gp64蛋白，分子量为64kD。Gp64蛋白是第叁类过滤性的膜融合蛋白，主要以二硫键相连叁聚体的形式存在于杆状病毒BV的一端，在病毒感染的早期和晚期均能表达这个蛋白，它是病毒进入宿主细胞的关键功能蛋白之一。Gp64蛋白作为杆状病毒BV上的囊膜蛋白，在内吞途径进入细胞中，对结合宿主细胞受体和调节低pH引发膜融合有重要作用。同时Gp64蛋白也是病毒萌芽和后代产生所必需的。本实验将Gp64基因克隆到原核表达系统中，得到重组Gp64蛋白，利用纯化的Gp64蛋白通过免疫大白兔实验获得了Gp64蛋白抗体，用来检测Gp64基因在酵母细胞中的表达。1．苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因在大肠杆菌中的表达：以AcMNPVBacmid质粒为模板，参照NCBI上所给出的Gp64蛋白基因组序列，设计一对引物，并在其上下游分别添加EcoR I和Sal I酶切位点。 PCR扩增出全长的Gp64基因。所得的PCR产物经测序验证后用EcoR I和Sal I酶切后与经EcoR I和Sal I酶的同尾酶Xba I酶同样处理的pET28a(+)原核表达载体连接，命名pET28a-Gp64。挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和测序验证后，转化到于E.coli野生型BL21表达菌中，利用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE检测Gp64蛋白基因在大肠杆菌中没有表达。2．苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒截短Gp64基因在大肠杆菌中的表达：以AcMNPV Bacmid质粒为模板，参照NCBI上给出的Gp64全基因组序列及已报到跨膜区域的相关序列来切除下游跨膜区域以确定截短序列。采用与之前相同的方法设计引物，添加相同的酶切位点，PCR扩增后得到截短Gp64基因，PCR产物和pET28a(+)原核表达载体通过酶切后进行连接反应，重组子命名为pET28a-截短Gp64。挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和测序验证后，转化到于E.coli野生型BL21表达菌中用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE检测Gp64基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白大小约为40kD。对目的蛋白表达条件进行优化，对收获的目的蛋白进行电透析纯化，得到纯度较高的目的蛋白，割胶免疫大白兔，收获Gp64蛋白抗体。3．苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因在酿酒酵母中的表达：以AcMNPVBacmid质粒为模板，参照NCBI上给出的Gp64蛋白基因组序列，设计一对引物，并在其上下游添加了EcoR I和Sal I酶切位点，PCR扩增后得到Gp64基因。所得的PCR产物用EcoR I和Sal I酶切后与经相同酶处理的pGBKT7酵母表达载体进行连接反应，得到的重组子命名pGBKT7-Gp64。挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和测序验证后，转化到于酿酒酵母表达菌AH109中进行营养缺陷性筛选，对筛选出来的菌落进行菌落PCR检测。对所得的目标菌株及对照菌株进行SDS-PAGE和Western-Blotting分析。综上所述，本试验利用大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统分别进行了杆状病毒AcMNPV囊膜蛋白Gp64基因的表达，为进一步研究对该病毒感染过程中的Gp64蛋白的表达检测提供了检测试剂：Gp64抗体。
张媛[7]2015年在《表达呼吸道合胞病毒（RSV）融合蛋白（F）的重组杆状病毒构建与特性》文中认为呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原,导致支气管炎和肺炎,严重时可致患者死亡,给婴幼儿的健康和生命安全带来巨大威胁。接种疫苗是预防病毒性疾病的有效手段。为了有效预防RSV感染性疾病,人们一直在研制RSV疫苗,但是目前仍没有疫苗获得许可上市。因此,研发安全有效的RSV疫苗是预防RSV感染的首要任务。位于RSV病毒粒子表面的糖蛋白——融合蛋白(fusion protein, F)是其主要的保护性抗原,也是研制RSV亚单位疫苗的首选组分之一。本研究构建了表达RSV F蛋白的重组杆状病毒疫苗,探讨了其免疫原性和抗RSV感染免疫应答情况,以及先天免疫信号通路接头蛋白分子VISA在抗感染免疫中的作用。1.以RSV A2株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增F蛋白的F1亚基(包含第155到524位氨基酸的F蛋白片段)编码序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌E.coli中诱导表达重组蛋白,经分离纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗F蛋白的多克隆抗体。ELISA检测表明,制备的多克隆抗体效价大于106；免疫荧光染色证实,抗F蛋白多克隆抗体能与重组杆状病毒表达的F蛋白产生特异性反应。2.以RSV A2株基因组RNA为模板,RT-PCR分别扩增全长F蛋白(第1到574位氨基酸)编码基因和包含F蛋白胞外区的截短F蛋白(tF)(第22到524位氨基酸)编码序列,采用MultiBac系统构建获得以不同形式表达F蛋白的叁种重组杆状病毒-Bac-tF64、Bac-CF、Bac-CF/tF64。其中,Bac-tF64能将F蛋白胞外区展示在杆状病毒包膜上；Bac-CF能在转导哺乳动物细胞后,内源性地表达全长F蛋白。Bac-CF/tF64既能将F蛋白胞外区展示在杆状病毒包膜上,又能在哺乳动物细胞中表达F蛋白。3.以BALB/c小鼠为模型,对叁种重组杆状病毒在机体中诱导的免疫应答和抗感染免疫进行了研究。特异性抗体及细胞因子ELISA检测结果显示,Bac-tF/64免疫组小鼠血清IgG2a/IgG1<1, Th2类细胞因子(IL-4, IL-5, IL-10)水平较高：Bac-CF免疫组小鼠血清IgG2a/IgG1>1, Thl类细胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平较高；Bac-CF/tF64免疫组小鼠血清IgG2a/IgGl>1,但是Thl与Th2类细胞因子水平均较高,表明该组诱导Thl和Th2混合型免疫应答,但是更偏向于Thl类。RSV攻毒感染试验结果表明,Bac-tF64和Bac-CF免疫组小鼠肺组织内均能检测到滴度约为102pfu per lung的RSV,但在Bac-CF/tF64免疫组小鼠肺组织内未能检测到RSV。肺研磨液细胞因子分析显示,RSV感染后,Bac-tF64免疫组小鼠肺组织具有较高的Th2类细胞因子含量,Bac-CF免疫组小鼠肺组织具有较高的Thl类细胞因子含量,而Bac-CF/tF64组Thl与Th2类细胞因子含量均较高。病理分析显示,RSV感染后,Bac-tF64免疫组小鼠肺内产生了严重的炎症反应,是疫苗增强性疾病(Vaccine Enhanced Disease,VED)的重要标志,而Bac-CF和Bac-CF/tF64组只有轻微的炎症。4.将先天免疫信号通路接头蛋白VISA编码序列插入到Bac-CF/tF64基因组中,构建了共表达VISA的重组杆状病毒Bac-CF/tF64/VISA。用Bac-CF/tF64/VISA免疫小鼠后,共表达VISA对F蛋白诱导的抗体水平没有显着影响(p>0.05)。但是,能够显着降低Th2类细胞因子水平(p<0.05),降低Th2类反应。病理分析显示,共表达VISA能明显减弱免疫小鼠在RSV攻毒感染时出现的VED现象。我们的研究成果将为研发基于F蛋白的RSV疫苗和发展新型疫苗佐剂奠定了基础。
冯敏, 吴小锋[8]2014年在《昆虫杆状病毒囊膜蛋白GP64与宿主细胞表面因子互作的研究综述》文中研究表明昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用的研究成果在病害防治和基因治疗、真核表达系统及基因工程疫苗生产等方面都极具应用价值。杆状病毒在对宿主昆虫细胞的感染周期中会产生遗传物质相同,但形态结构各异的出芽型病毒粒子(BV)和包涵体衍生型病毒粒子(ODV)。ODV经口感染昆虫中肠引发原发性感染后,BV在感染细胞或组织间水平传播引起宿主昆虫的全身性感染。GP64作为BV囊膜上的一种主要融合蛋白,在介导病毒的感染和水平传播过程中发挥了关键作用。本文综述囊膜蛋白GP64介导BV进入宿主细胞的方式,特别是在BV病毒感染宿主昆虫细胞和转导哺乳动物细胞中发挥作用的具体功能域,包括直接参与病毒结合并进入宿主细胞的区域(终端融合环、肝素结合区域和胆固醇识别氨基酸共识域)以及与宿主细胞表面因子磷脂质、胆固醇、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖间的互作等研究进展,从分子水平阐述杆状病毒BV与宿主细胞的相互作用。
毛海涛[9]2006年在《基于杆状病毒F蛋白的真核表面展示系统的构建》文中研究表明表面展示技术为生物大分子的设计以及分析它们之间的相互作用提供了有力的工具。近十几年来,噬菌体表面展示已被应用分子生物学的各个领域并极大的促进了生物学的研究进展。但是作为一种原核表达系统,在糖基化,复杂蛋白质的折迭方面,噬菌体表面展示技术显示出一定的局限性。真核展示使得复杂糖基化蛋白的表达成为可能。自从1995年Boublik等以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)成功展示外源蛋白以来,已经有多个实验室利用该系统展示了一系列原核系统难以展示的蛋白。通常是将外源蛋白融合到AcMNPV的主要膜蛋白Gp64的N末端。该技术在产生和筛选真核表达文库以及生产单克隆抗体中的潜在应用价值已经得到验证。 杆状病毒的出芽型病毒粒子(budded virions,BV)有两类截然不同的膜融合蛋白。Gp64是组Ⅰ类NPV BV上的主要膜融合蛋白,它在低pH的条件下介导膜融合;并且Gp64对于病毒粒子从被感染细胞中的出芽是必需的。另一类不同的膜蛋白由组Ⅱ类NPV编码,被称为F蛋白。组Ⅱ类NPV包括甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua MNPV,SeMNPV),舞毒夜蛾核多角体病毒(Lymantria disper MNPV,LdMNPV),中国棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera SNPV,HaSNPV)等。作为Gp64的同源蛋白,F蛋白同样在病毒进入细胞的过程中介导酸性条件下的膜融合。但是F蛋白在获得膜融合活性并使病毒粒子有感染性之前,必需要被细胞内的furin蛋白酶切割成两个二硫键连接的小亚基。到目前为止,基于AcMNPV和基于BmNPV(Bombyx mori NPV)的杆状病毒表面展示系统已经开发出来。但它们都是属于组Ⅰ类NPV,组Ⅱ类NPV的表面展示还没有人研究。在本文中,我们将报告另一类基于HaSNPV的F蛋白的真核展示系统得构建。 HaSNPV是棉铃虫的主要致病病毒,所以在中国主要用于生物防治杀虫剂。像其他的组Ⅱ类NPV一样,HaSNPV的基因中没有Gp64样的基因,但是发现ORF133与f基因同源,经研究证实ha133编码F蛋白。F蛋白经过翻译后修饰被切割成两个由二硫键连接的小亚基,一个是跨膜结构域所在的F1片段,大小59kd,另一个是20kd的F2片段。由于F蛋白介导病毒粒子进入细胞的过程并能影响病毒粒子出芽的效率,因而在病毒的复制周期中是必需的,它的缺失也是致死的,所以我们在HaSNPV基因组的polh基因座处引入F蛋白的第二个基因拷贝。作为组Ⅱ类的杆
文莉[10]2015年在《杆状病毒定点标记及侵染行为动态示踪》文中进行了进一步梳理对复杂生物体系进行实时、原位和活体分析是分析化学发展的重点和难点。病毒相关疾病严重威胁着人类健康,因此全面深入地了解病毒侵染机制,对病毒性疾病的预防、早期诊断和治疗具有重大意义。病毒的荧光标记技术及单颗粒示踪技术为研究病毒的侵染机制提供了强有力的工具。量子点具有优越的荧光性质,在长时间病毒单颗粒示踪方面是一种非常理想的荧光标记物。然而,已有的量子点标记病毒策略大都以病毒外部包膜作为标记位点,无法用于示踪病毒脱去包膜后的侵染事件,因此需要发展一种量子点标记病毒衣壳的策略。另外,以往对病毒侵染机制的研究缺乏系统性和整体性,也极少提供病毒侵染行为的动态信息,因而需要发展一套能够系统阐述病毒整个侵染过程的动态示踪方法。病毒的叁个关键组分(病毒包膜、衣壳和核酸)都参与病毒侵染过程,然而目前仅实现了病毒双组分的同时标记,无法全面而细致地探索病毒的整个侵染机制。杆状病毒表达系统能够将一种或多种外源基因表达在包膜或衣壳上,为实现病毒衣壳的量子点标记及病毒多组分的同时标记提供了可能性。论文针对已有的病毒标记策略及其在病毒侵染机制研究方面的不足,以具有典型叁组分结构的杆状病毒为模式病毒,利用杆状病毒表达系统的优势,主要研究内容如下：建立了一种用量子点定点标记包膜病毒衣壳的策略。利用杆状病毒表达系统,病毒在宿主细胞内自我复制中实现了其衣壳蛋白VP39的生物素化,继而衣壳被链霉亲和素修饰的量子点定点标记。该标记避免了常规的剧烈化学反应,因此病毒侵染性得到了很好的保持。由于VP39是主要的衣壳蛋白,该标记具有很高的标记效率(约为95%)。这种包膜病毒内部衣壳的量子点标记为同时示踪病毒脱去包膜前和脱去包膜后的过程奠定了良好基础。发展了一种系统地示踪病毒侵染全过程的方法。基于衣壳被量子点标记的杆状病毒及单颗粒示踪技术,分别示踪了杆状病毒与囊泡、酸性内涵体、肌动蛋白及核孔等与病毒侵染过程密切相关的细胞结构之间的相互作用,从而阐明了杆状病毒从吸附到细胞膜到进入细胞核内经历的五个阶段,并提供了病毒的运动模式及运动参数。该方法实现了对病毒整个侵染过程的动态示踪,为研究病毒的整个侵染机制提供了可能性。建立了一种同时定点标记病毒包膜、衣壳和核酸的方法。利用杆状病毒表达系统同时实现了杆状病毒包膜蛋白的生物素化和衣壳蛋白的GFP标记,结合核酸染料SYTO 82及SA-QDs对宿主细胞的孵育,使杆状病毒多组分的同时标记在病毒自我复制过程中实现,避免了分别标记各组分和除去多余标记物的繁琐操作,最大限度保持了病毒侵染性。病毒蛋白的定点改造以及SYTO 82与核酸之间极强的结合力使各组分都被定点且高效地标记(标记效率约为90%)。基于该标记获得了病毒各个组分在细胞内的分离以及转运信息,为病毒侵染机制全面而细致的研究以及病毒性疾病的预防和诊治提供了可能性。
参考文献：
[1]. 杆状病毒（Baculovirus）膜融合蛋白的研究[D]. 王舒. 中国科学院研究生院(武汉病毒研究所). 2003
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[6]. 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白在酵母细胞中的表达[D]. 徐智鹏. 武汉工程大学. 2014
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[8]. 昆虫杆状病毒囊膜蛋白GP64与宿主细胞表面因子互作的研究综述[J]. 冯敏, 吴小锋. 蚕业科学. 2014
[9]. 基于杆状病毒F蛋白的真核表面展示系统的构建[D]. 毛海涛. 华中师范大学. 2006
[10]. 杆状病毒定点标记及侵染行为动态示踪[D]. 文莉. 武汉大学. 2015
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