邵继平, 符健[1]2019年在《HIV-1 gp41蛋白的主要特性及B/T细胞表位预测》文中进行了进一步梳理目的采用生物信息学方法分析HIV-1 gp41跨膜糖蛋白的基因序列及其编码蛋白的结构特征,并预测可能的B/T细胞表位,为艾滋病疫苗及多肽药物开发提供理论依据。方法从NCBI GenBank数据库获取gp41基因及其编码蛋白序列,综合运用ExPASy ProtParam tool、SOPMA、TMpred、Motifscan、ABCpred、Bepipred、CTLPred和IEDB等在线软件分别预测其低级结构、跨膜区、翻译后修饰位点、B/T细胞表位。结果 HIV-1 gp41基因ORF长度为666 bp,编码222个氨基酸。该gp41蛋白共3 627个原子,相对分子质量为25.642 5×10~3,分子式为C_(1164)H_(1815)N_(317)O_(325)S_6。理论等电点为8.60,是稳定的疏水性蛋白。gp41蛋白具有无规则卷曲55个,占24.77%;13个翻译后修饰位点,存在N-糖基化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、N-酰胺化、蛋白激酶C磷酸化等修饰。gp41蛋白N-末端存在跨膜螺旋区,分别位于第2-20,80-97和171-192位氨基酸处,这3个螺旋区的总评分为4 614。预测gp41蛋白含有23个B细胞抗原表位,优势表位依次是87-102、93-108、113-128、78-93、151-166等;含有NKTYKEIWD、VERYLRDQR和EPDRPERIE 3个优势CTL细胞表位,分别位于第103-111、70-78、213-221位氨基酸处。结论预测gp41蛋白的B/T细胞表位进行预测,可为艾滋病疫苗及多肽药物的开发提供了理论依据。
康银花, 顾觉奋[2]2018年在《基于跨膜蛋白gp41为作用靶点的抗HIV-1药物研究进展》文中认为高效抗逆转录病毒治疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)是当今抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的主要方法,随着HAART的广泛应用,诸如药物交互作用、不良反应和耐药毒株等问题也相继出现,因此人们致力于其他抗HIV药物的研究。gp41是HIV-1病毒表面的一种包膜糖蛋白,介导了病毒膜和宿主细胞膜间的融合,在HIV-1的侵染过程中起了关键作用。基于gp41为相关靶点的HIV-1融合抑制剂是近年来抗HIV-1药物研究的热点。概述gp41的结构及融膜机制,并对gp41为作用靶点的抗HIV-1药物的研究文献,及其研究进展做了分析。
来力[3]2015年在《大肠杆菌体内和体外表达HIV-1 gp41重组抗原及其免疫反应性检测》文中认为近年来,HIV病毒在全球范围内呈现快速流行态势。HIV抗体诊断试剂作为目前初步诊断HIV的主要方法,具有巨大的市场价值。随着生物技术的发展,利用基因工程的手段,制备具有良好免疫反应性的HIV-1 gp41重组抗原原料,对于HIV抗体诊断试剂的研发有着深远意义。本文首先合成了经过密码子优化的gp41基因质粒模板pET-28a(+)-gp41,PCR扩增获得了包含gp41主要优势抗原表位以及膜外重要结构域(NHR、CHR、 MPER)的截短基因序列。通过在gp41截短片段上游添加亲水性分子伴侣DsbA,在大肠杆菌体内实现了gp41优势抗原表位蛋白的融合表达。在优化表达条件下(37℃,0.2 mM IPTG,诱导后培养时间10 h),融合蛋白表达水平为8.7 μg/mL鉴于gp41融合蛋白在大肠杆菌体内表达的水平较低,无法满足制备gp41抗原的要求,本研究进而利用大肠杆菌体外无细胞体系表达gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全长基因,成功构建无细胞表达重组质粒pIVEX2.4c-gp41,在大肠杆菌无细胞体系中实现了gp41全长蛋白的表达。进一步考察去污剂重悬目标蛋白和直接在无细胞体系中添加去污剂两种模式对获得可溶gp41蛋白的影响。结果显示,所尝试的各种去污剂均不能有效重悬gp41蛋白沉淀；而直接添加去污剂模式在最优条件下(添加终浓度为0.2%的Brij78),可溶gp41蛋白的表达水平达到650μg/mL。对添加去污剂模式所表达的可溶gp41重组蛋白进行纯化、浓缩和替换缓冲液,蛋白纯度达到95.6%,浓度为1.5 mg/mL,总回收率为70%。利用纯化后的gp41重组蛋白制备乳胶法免疫层析试纸,通过对不同抗体滴度HIV-1阳性标本、HIV-1阴性标本、TP阳性标本以及HBeAb阳性标本的检测,证明该gp41重组蛋白免疫反应性良好。总之,本文致力于HIV-1 gp41在大肠杆菌体内和体外无细胞体系的重组表达研究。通过对无细胞表达体系的优化,实现了gp41的全长可溶表达,亲和纯化获得的目标蛋白经乳胶法试纸评估具有免疫反应性。本研究为HIV抗体诊断试剂的研发提供了具有潜在应用价值的gp41抗原。
李秀芬[4]2017年在《HIV-1感染者抗p24和gp41体液免疫应答的特征及流行病学意义》文中研究指明研究背景:人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是导致获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)的病原体。HIV-1 的跨膜糖蛋白gp41在HIV-1众多蛋白中最为保守,能诱导产生多个中和抗体,是免疫检测试剂盒中最为常见的检测抗原及疫苗研发的目标。衣壳蛋白p24在病毒蛋白中含量最为丰富,其氨基酸序列在多种亚型中高度保守,也是感染后最早能检测到的抗原,使其也成为重要的生物标志物。研究发现在HIV-1感染者体内存在体液免疫应答模式的转变,提示我们p24和gp41的免疫优势表位或能成为区分不同感染模式的生物标志物,对建立实验室检测方法有利用价值。研究目的:本课题通过重组表达的p24、gp41蛋白,合成p24、gp41的系列肽段作为包被抗原,探究与HIV-1感染人群外周血与病毒蛋白或肽段的免疫反应特征,探讨HIV-1感染者的体液免疫应答模式及其特点,分析HIV-1感染者体液免疫应答模式与感染者病程进展指标的关联,发现有使用价值的特殊生物标志物,建立能区分不同感染时期的实验室检测方法。研究方法:构建p24的重组表达质粒,转化至大肠杆菌感受态细菌。经过诱导表达可溶性重组蛋白并对重组蛋白进行纯化。表达产物用SDS-PAGE电泳和间接ELISA分析鉴定其活性。收集不同人群来源的HIV-1阳性血浆样本,利用商品化试剂盒将样本区分为近期感染和长期感染,观察不同人群在感染时期分布上的差异。分别合成3条覆盖p24和gp41不同区域的肽段。分析不同人群,不同感染时期的样本与重组蛋白及肽段的免疫反应特点。分析不同感染时期的样本与肽段的免疫应答情况,筛选出具有区分HIV-1不同感染时期能力的肽段。优化反应条件,初步建立区分HIV-1不同感染时期的实验室检测方法。通过与两种商品化试剂盒鉴定结果的比较,评价方法的敏感性和特异性。研究结果:成功构建p24的原核表达质粒并诱导表达,蛋白电泳与预期相符,间接ELISA分析显示p24具有抗原特异性。88.3%(233/264)的样本不与叁个覆盖p24主要免疫优势表位的叁个肽段反应,与此形成对比的是,87.7%(236/269)的样本至少与一个gp41的肽段反应。随着感染时间的延长,HIV-1感染者体内gp41-p1特异性抗体滴度逐步上升,感染时间与gp41-p1的酶免实验OD值之间的相关系数为0.78。将gp41和gp41-p1作为捕捉抗原,gp41抗体阳性和gp41-p1抗体阴性定义为近期感染,gp41抗体阳性和gp41-p1抗体阳性定义为长期感染,初步建立了一种能区分HIV-1新近和长期感染的实验室检测方法。研究结论:HIV-1感染者针对p24和gp41的体液免疫应答模式存在较大差异,此为依据,初步建立了一种区分HIV-1新近感染和长期感染的实验室检测方法。
李雪[5]2016年在《基于异肽键定点交联的嵌合N肽类HIV-1融合抑制剂的研究》文中研究表明获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)连续不断地侵染人CD_4~+T淋巴细胞所造成的一种至今尚无法治愈的致死性传染病。病毒包膜与宿主细胞的融合是病毒感染的关键步骤。HIV包膜糖蛋白跨膜亚基gp41是介导病毒与宿主细胞膜融合的关键性蛋白。在融合过程中,gp41中N末端重复序列(NHR)与C末端重复序列(CHR)相互作用,形成六股α螺旋束(6-HB)核心结构,促进病毒膜和细胞膜的融合,最终使得病毒进入宿主细胞。衍生于CHR区域的多肽片段(C肽融合抑制剂)或NHR区域的多肽片段(N肽融合抑制剂)可以通过干扰病毒内源性六股α螺旋束的形成,阻止HIV病毒膜与靶细胞膜的融合,从而对抗病毒感染过程。相比于逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂,融合抑制剂作用于新靶点,可以解决现有抗HIV药物的耐药性问题;此外,由于融合抑制剂是在HIV感染早期介入和在细胞外发挥作用,因此理论上能降低不良反应发生的概率。T20是目前唯一上市的C肽类融合抑制剂。它是新一代抗HIV药物,有效地解决了患者对目前鸡尾酒疗法产生的耐受性问题。但是,由于HIV基因的高度变异性,加之T20是一个完全衍生于病毒CHR区域的天然多肽,对病毒突变的抵御能力差,因此随着T20的临床应用,病毒耐药性问题日益明显。新一代C肽类融合抑制剂虽然可以抑制已有的T20抗性毒株,但由于靶点均为gp41 NHR区域,极易与T20产生交叉耐药,并且预期在进入临床使用后这些交叉抗药性会更加明显。此外,在生理条件下,T20所呈现的无规卷曲构象使其极易被蛋白酶水解,导致其半衰期短,需要一天两次大剂量注射给药(90毫克/天),严重影响病人对药物的接受度和对治疗的依从性。上述缺陷使得T20未能作为一线药物用于抗HIV治疗,因此,能够有效对抗T20耐药毒株和抗蛋白酶降解成为新型HIV融合抑制剂研发的主要方向。本论文旨在发现具有高活性的N肽类融合抑制剂,用于解决目前上市药T20所存在的缺陷和不足。由6-HB晶体结构可知,NHR与CHR互为配基。N肽类融合抑制剂以CHR区域为作用靶点,与T20的作用靶标完全不同,因此理论上可以有效抑制T20的耐药毒株。但是,由于衍生于NHR的多肽本身含有较多的疏水性残基,导致N肽水溶性较差,在生理条件下极易聚集沉淀,无法形成其叁股α螺旋活性构象,因而表现出远低于C肽的抗病毒活性。前期研究表明,通过将能够在溶液中自发形成叁股螺旋的肽序列与N肽嵌合,可以有效改善N肽的水溶性并诱导其形成活性构象;用二硫键将上述嵌合N肽交联形成不可逆的叁股螺旋,如(CCIZN17)_3,可以使活性大幅提高,IC50达到纳摩尔水平,并且对T20耐药毒株也有效。从药物研发角度出发,二硫键在生理条件下不稳定,极易被含有巯基的化合物或酶降解,使药物失活;此外,辅助序列只是为了维系叁螺旋的正确折迭,造成与功能无关肽序列的冗长,不利于药物与靶标的结合。基于上述原因,我们以(CCIZN17)_3为先导化合物,通过酰基转移反应在叁股α螺旋间定点引入异肽键,来取代(CCIZN17)_3中的二硫键连接桥;在此基础上,深入探讨了酰基转移反应的特异性,并系统考察了异肽键交联位点、辅助序列部分的分子尺寸以及功能N肽部分的分子长度对嵌合肽整体生物学活性的影响。其中,通过缩短辅助序列尺寸、延长有效N肽长度、并通过异肽键交联的嵌合叁螺旋(IZ14N24N)_3表现出高于先导结构(CCIZN17)_3和阳性药T20的抗病毒活性,IC50达到0.4±0.01 n M;此外,体外酶解稳定性评价表明异肽键交联策略显着优于二硫键,并且(IZ14N24N)_3可以有效抑制T20耐药毒株,能够解决了T20所存在的缺陷和不足。圆二色谱(CD)、超离心沉降分析(SVA)、凝胶电泳(N-PAGE)和凝胶排阻色谱(SE-HPLC)等一系列生物物理学评价表明,异肽键交联的嵌合N肽可以与靶标相互作用形成外源性6-HB的结构。这些结果也提示我们,异肽键交联的嵌合N肽也可以作为分子靶标,用于研究其与C肽类或小分子类融合抑制剂的作用方式,深化以NHR为靶的融合抑制剂设计的结构基础。本研究的创新点:1.利用异肽键定点交联的方式获得新结构的嵌合N肽;并系统地考察了交联反应的特异性,证明了异肽键交联是一种基于螺旋间精确组装的立体专一性反应;2.系统地研究了交联位点,辅助序列分子尺寸,和天然NHR长度对交联嵌合N肽的结构稳定性、生物学活性的影响;全新结构嵌合N肽的抗病毒活性优于上市药T20,且对T20耐药毒株有效;3.证明了异肽键交联的嵌合N肽酶解稳定性远高于二硫键交联的嵌合N肽。
夏承来, 姜世勃, 刘叔文[6]2009年在《HIV包膜蛋白的结构及其相应的病毒进入抑制剂》文中提出HIV-1病毒包膜蛋白gp120和gp41在病毒感染中起着重要的作用。在病毒进入细胞的过程中,gp120先和CD4分子结合,发生构象改变,进而导致gp41构象的变化,使病毒包膜和细胞膜融合而感染细胞。与gp120或者gp41相结合的多肽、大分子和小分子化合物,都可能影响HIV-1病毒包膜和靶细胞膜结合的过程,从而起到抗HIV-1病毒的作用。该文对gp120和gp41的结构及其相互作用,以及以HIV-1包膜糖蛋白为靶点的病毒进入抑制剂类抗艾滋病药物进行综述。
魏民, 关琪, 梁浩, 陈健平, 陈钊[7]2003年在《人类免疫缺陷病毒1型感染基因诊断方法的建立》文中进行了进一步梳理目的 建立人类免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)基因诊断方法。方法 随机选取 80份全国送检的已确认的HIV阳性样品 ,从健康献血员中选取 40份HIV阴性样品。分别提取人DNA和病毒RNA ,再分别扩增HIV 1的gp41、pol和gag各基因区的 3套反应系统 ,进行巢氏聚合酶链反应(nPCR)和逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)。将结果与血清学方法比较 ,观察结果是否一致。同时检测 3套反应系统的敏感性、重复性和对HIV 1各亚型参考病毒株的扩增情况。结果 用 3套反应系统对 80份阳性样本进行nPCR检测的阳性率为 :gp41反应系统 88 8% ;pol反应系统 83 8% ;gag反应系统 81 3 % ;3套系统联合应用检出率 90 0 %。用RT PCR检测阳性率为 :gp41反应系统96 3 % ;pol反应系统 91 3 % ;gag反应系统 95 0 % ;3套反应系统联合应用检出率可达 98 8%。阴性样品扩增均阴性 ,特异性为 10 0 %。 3套反应系统不但可扩增HIV 1型M组的A、B、C、D、CRF0 1 AE、F、G、H亚型 ,还可扩增其N和O组毒株 ,且与HIV 2无交叉反应。nPCR最低检测限为 1拷贝 /PCR。gag和pol反应系统RT PCR最低检测限为 750拷贝 /ml;gp41反应系统最低检测限为 150拷贝 /ml。nPCR和RT PCR扩增gp41、pol和 gag基因区的重复性分别为 :93 3 %、90 0 %、 86 7%和10 0 %、96 7%、10 0 %?
张立科[8]2014年在《新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞诱导单核细胞迁移的研究》文中指出一、研究背景和目的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans,Cn)是一种具有荚膜的酵母型真菌,广泛存在于土壤和鸽粪中,主要感染免疫力低下和免疫缺陷人群,其嗜中枢的治病特性极易引起中枢神经系统感染,尤其以HIV相关性隐球菌脑膜炎最为严重,死亡率极高。因此,作为AIDS最严重的真菌感染并发症,新生隐球菌脑膜炎的研究已成为HIV和真菌研究的热点。新生隐球菌以呼吸道吸入为主要致病途径,通过无症状的肺部感染后穿越肺泡-毛细血管屏障进入血循环播散至其他深部组织,主要是中枢神经系统。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)主要有紧密连接的脑微血管内皮细胞(Brain microvasclar endothelial cell, BMEC)构成,新生隐球菌只有穿透血脑屏障才能引起脑膜炎。我们之前研究了Cn与人脑微血管内皮细胞(Human BMEC)之间的相互作用,新生隐球菌可以诱导HBMEC产生细胞骨架肌动蛋白重排和细胞膜表面的CD44在分配。多糖荚膜是新生隐球菌主要的毒性因子。Ambrose Jong等研究表明,新生隐球菌的CPS1基因编码其透明质酸酶(hyaluronic acid synthase),后者合成透明质酸(hyaluronic acid, HA)。HA可以结合HBMEC表面的主要黏附分子CD44,与新生隐球菌黏附侵袭脑微血管内皮细胞密切相关。HA几乎是所有哺乳动物细胞的胞质成分,还可能参与肿瘤侵袭和转移的生物学过程。目前已经利用染色体同源重组技术,构建了新生隐球菌B4500FO2株的CPS1基因缺失株TYCC645#32和CPS1基因回补株CPIP,不表达HA的TYCC645#32相对于B4500FO2,对脑微血管内皮细胞的粘附侵袭率明显降低,证明HA作为CD44的配体,是粘附侵袭HBMEC的重要毒力因子。脑微血管内皮细胞上有多种HA的受体,如CD44, RHAMM, Ivd4,其中CD44是新生隐球菌HA的最主要受体,主要分布在细胞中的膜脂筏(lipid rafts)上,可以在细胞膜和胞质间流动,这种流动的膜结构可能是其信号转导机制的基础。新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞后,CD44分子再分配于膜脂筏中,由胞质向细胞膜再聚集,经过一系列信号转导使细胞骨架肌动蛋白重排,使新生隐球菌进入宿主细胞。另外,黏附分子CD44表达于多种类型的细胞中,涉及多种细胞的免疫过程,如细胞与基质、细胞与细胞间的黏连和细胞迁移、生存、分化等,是一个分布广泛的细胞表面受体家族。透明质酸(HA)结合区域和一个共同的跨膜结构是CD44的保守区域。研究发现,新生隐球菌CPS1野生株刺激脑微血管内皮细胞CD44过度表达,在结合位点可见大量的CD44。同时,白细胞与内皮细胞相互作用也依赖CD44/HA。单核吞噬系统是免疫反应的第一道防线,单核吞噬细胞可以吞噬杀伤新生隐球菌,但是新生隐球菌依赖多糖荚膜等多种毒力因子可以在吞噬细胞内生存繁殖,特别是HIV感染患者单核吞噬细胞功能失调时就成为隐球菌从血循环向深部组织扩散的工具。目前已有多方面的证据支持存在木马机制的穿血脑屏障模式。动物实验表明,将和单核细胞共孵育的隐球菌注入小鼠后,其脑组织真菌负荷相比单纯注射隐球菌明显增多。HIV-1gp41-I90可以诱导HBMEC膜脂筏和CD44重新分布和高表达,从而促进新生隐球菌对HBMEC的黏附侵袭。趋化迁移实验是一种研究新生隐球菌感染时,单核细胞与脑微血管内皮细胞相互作用和运动的很好的实验方法和手段。实验装置是一种有特定孔径的杯状的膜滤器,将脑微血管内皮细胞铺于膜上以模拟血脑屏障。这种实验手段经常被用于共培养、细胞趋化、细胞迁移和细胞侵袭等多方面的研究中。本研究目的将利用人脑微血管内皮细胞(Human brain microvasclar endothelial cell, HBMEC)构建体外血脑屏障模型,通过黏附和趋化迁移实验研究新生隐球菌感染HBMEC对单核细胞的粘附和迁移通过血脑屏障的影响,HIV-1gp41-I90单独作用以及与新生隐球菌协同刺激HBMEC对单核细胞迁移通过血脑屏障的影响；利用体外黏附和趋化迁移实验,对比使用CD44抑制剂和抗体前后,单核细胞迁移的变化,以证明CD44是影响单核细胞迁移的关键分子；利用免疫荧光技术,比较HIV-1gp41-I90和Cn协同作用HBMEC诱导细胞表面CD44表达的情况。二、研究方法1、单核细胞黏附实验检测新生隐球菌、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后的单核细胞粘附情况：实验前24小时用HBMEC铺96孔板106cell/孔,将实验用各菌株真菌以EM培养基稀释为108cfu/ml备用,以下列各种条件刺激单层HBMEC:不同剂量的Gn、HIV-1gp41-I90孵育3h,以相同剂量的Cn、HIV-1gp41-190孵育不同时间,以相同菌量的不同菌株孵育3h,孵育真菌或HIV-1gp41-I90后再孵育Bikunin或抗CD44抗体,然后加入THP-1孵育1h,显微镜下计数黏附在HBMEC上的THP-1细胞数,计算黏附率。2、单核细胞趋化迁移实验检测新生隐球菌、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后的单核细胞迁情况：将106cell铺于趋化小槽(Millicell,12μm孔径)中培养3-5天,测试TEER值在200-300Ω2·cm2时可以进行趋化实验。以下列各条件刺激趋化槽中的HBMEC:不同剂量的Cn、HIV-1gp41-I90孵育3h,以相同剂量的Cn、HIV-1gp41-I90孵育不同时间,以相同菌量的不同菌株孵育3h,孵育真菌或HIV-1gp41-I90后再孵育Bikunin或抗CD44抗体,然后加入THP-1孵育3h后计数迁移到下槽液中的细胞数,计算出迁移率。3、免疫荧光方法检测新生隐球菌、HIV-1gp41-I90感染后HBMEC的CD44的表达：HBMEC培养在24孔板中,以不同菌量的野生株B4500F02孵育3h以观察不同菌量感染HBMEC对CD44表达的作用；以相同菌量的B4500FO2分别孵育30min、2h和3h以观察不同孵育时间对CD44表达的影响；以0、5×106cfu/mL的B4500FO2、 gp41-19020μg/mL和20μg/mL的gp41协同5×106cfu/mL的Cn分别孵育HBMEC3h,然后免疫荧光染色观察CD44表达的情况。叁、结果1、新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的黏附和迁移作用与真菌菌量和感染时间相关以野生株B4500F02不同剂量组(106、5×106和5×107cfu/mL)感染HBMEC诱导THP-1细胞的相对黏附率分别为136±6.7%、165±6.4%和197±9.6%,迁移率分别为28.875±2.21%、29.625±1.15%和36.55±1.95%,与对照组相比有明显差异,P<0.05；以野生株B4500F02感染HBMEC不同孵育时间组(1、2和6h)诱导THP-1细胞的相对黏附率分别为165±6.4%、221±9.8%和320±14.7%,不同孵育时间组(1、2、3、6、12和24h)对应迁移率分别为23.42±1.39%、27.925±0.34%、29.625±1.15%、39.575±3.55%、45.055±6.11%和50.77±2.83%,与对照组相比3h组有差异,P<0.05,6-24h组差异明显,P<0.01。2、新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的促黏附和迁移作用可被CD44阻断剂Bikunin和抗体不同程度的阻断应用不同浓度阻断剂Bikunin(0.1nM、1nM、5nM和20nM)后相对黏附率分别为82±4%、48±3.4%、37±3.4%和30±3.9%,迁移率为21.625±1.22%、19.45±2.22%、13.675±0.64%和12.725±1.61；应用不同浓度的anti-CD44抗体(10ng、100ng、500ng和1000ng)后相对黏附率分别为91±3.6%、77±3.3%、58±4.5%和32±3.9%,迁移率分别为21.775±1.86%、21.775±1.86%、13.875±1.99%和10.075±1.15%,各组与PBS对照组比较有明显差异,P<0.01。3、新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的促黏附和迁移作用与荚膜HA有关利用HA的野生株、缺失株和回补株Cn分别感染内皮细胞诱导的THP-1相对黏附率分别为165±6.3%、126±5.8%和158±6.9%,野生株相比对照组、缺失株均有显着差别,P<0.01；迁移率分别为30.575±1.99%、23.85±1.79%和26.825±1.67%,野生株相比对照组有显着差异,P<0.01,野生株相比HA缺失株差异明显,P<0.05。4、新生隐球菌数量和感染时间影响HBMEC细胞上CD44的表达利用荧光标记抗体检测技术,我们发现随真菌浓度和孵育时间的增加,细胞膜上CD44表达增强,且信号向细胞膜集中。不同的孵育时间对CD44的表达也有很大影响,相比对照组,孵育2h和3h组的荧光信号变得更强,且向细胞膜集中。5、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后对THP-1细胞的促黏附和迁移作用与其剂量和孵育时间相关和HBMEC一同孵育的HIV-1gp41-I90浓度的增加及孵育时间的延长可以促进THP-1黏附和迁移。HIV-1gp41-I90的四个浓度组(0.2、2、20和200μg/mL)诱导THP-1的相对黏附率分别是107±0.5%、117.5±9.5%、150±2.6%和235±15%,当浓度达到2μg/mL时,相比对照组相对黏附率有明显差异,P<0.05,浓度达到20-200μg/mL时,相对黏附率相比对照组有显着差异,P<0.01；迁移率分别是21.575±4.47%、24.483±3.16%、29.05±3.48%和30.6±3.97%,与对照组比较,浓度在20-200μg/mL时有明显差异,P<0.05。6、HIV-1gp41-I90可以增强新生隐球菌感染HBMEC后对THP-1细胞的黏附和迁移作用以PBS、Cn、HIV-1gp41-I90和HIV-1gp41-I90+Cn的四个组分别感染HBMEC诱导THP-1的相对黏附率分别是100±0%、186.5±7.47%、150.7±2.8%和228.6±29.3%,各组相比对照组,相对黏附率均有显着差异,P<0.01; HIV-1gp41-I90+Cn组和单纯Cn组相比,相对黏附率有显着差异,P<0.01; HIV-1gp41-I90+Cn和单纯HIV-1gp41-I90组相比,相对黏附率有特别显着的差异,P<0.001。从迁移实验看,不论是gp41或Cn单独作用于HBMEC,还是HIV-1gp41和Cn共同作用于HBMEC,其迁移率相对于对照组都有明显提高(P<0.01),且随着后者相互作用的时间延长,迁移率亦随着增加；根据重复测量数据方差分析的组间多重比较的结果,gp41+Cn组相比对照组和单纯gp41组有明显差异(P<0.01)。7、HIV-1gp41-I90增强Cn感染HBMEC诱导THP-1趋化迁移的作用可能与CD44分子密切相关Bikunin的4个浓度组0.1nM、1nM、5nM和20nM)抑制HIV-1gp41-I90增强Cn感染内皮细胞诱导THP-1的迁移率分别为19.21±3.71%%、15.22±2.99%、12.75±1.9%和11.725±4.84%,5nM和20nM浓度组与对照比较有显着差异,P<0.01。另外,CD44免疫荧光观察发现,内皮细胞上表达的CD44荧光信号在HIV-1gp41-I90+Cn组最强。四、统计学分析数据用均数±标准差表示,统计方法采用SPSS13.0统计软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和重复测量数据的方差分析进行,方差不齐时进行变量转换。P<0.05时差异有统计学意义。五、结论1、新生隐球菌体外感染脑微血管内皮细胞可以诱导THP-1的黏附和迁移。2、新生隐球菌体外感染脑微血管内皮细胞诱导THP-1黏附和迁移的作用可能与CD44分子密切相关。3、HIV-1gp41-I90作用脑微血管内皮细胞可以诱导THP-1的黏附和迁移。4、HIV-1gp41-190可以增强Cn感染脑微血管内皮细胞诱导THP-1的黏附和迁移。5、HIV-1gp41-190增强Cn感染脑微血管内皮细胞诱导THP-1趋化的作用可能与CD44分子密切相关
栗坤, 修尘林, 高立明, 石明, 翟越[9]2016年在《琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体（英文）》文中研究指明目的通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术。方法以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体。结果通过6轮筛选,筛选得到的次级ss DNA库通过PCR扩增得到ds DNA,ds DNA与p MDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体。获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合。结论利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力。
裘佳寅[10]2014年在《靶向HIV-1 gp41的病毒进入抑制剂的筛选及gp41 Loop疏水中心的功能研究》文中进行了进一步梳理艾滋病,即获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染引起一种严重的传染性疾病,以全身免疫系统严重损害为特征。联合国艾滋病规划署报告显示,截至2012年底,全球有超过3530万名艾滋病带菌者,其中有260万人是在2009年才确诊染病,全球范围内每天新增6300名艾滋病感染者。截至2014年2月,我国共报告现存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人约44.8万例。艾滋病已在全球范围内迅速蔓延,现已成为当今世界最危险的流行病之一,严重威胁着人类的生命和健康。如果防治措施不力,将对我国的人口健康和经济社会发展产生巨大的影响。当前,抗病毒药物治疗依然是防治艾滋病的主要方法。目前上市的抗HIV药物主要包括：蛋白酶抑制剂(Protease inhibitors, PIs)、逆转录酶抑制剂,包括核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs)、整合酶抑制剂(Integrase Inhibitors)、以及进入抑制剂(HIV entry inhibitors)。临床上主要采用联合用药的方式进行治疗,即俗称“鸡尾酒疗法”的高效抗逆转录病毒疗法——Highly active anti-retroviral therapy, HAART)。鸡尾酒疗法通常由两种逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂组成,其利用不同靶标、不同作用环节的抗HIV药物的协同作用,有效地抑制HIV在人体内的复制,大大降低了病毒的发病率和死亡率,延长了患者寿命。但现有的大多数蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂被发现无法完全清除体内的HIV病毒,并且长期用药还易导致药物的耐药性,毒副作用,病人的耐受性,还存在费用高昂等突出问题。面对艾滋病全球蔓延的形势以及现有药物的局限性,临床上迫切需要高效低毒,使用方便,价格便宜的新型抗HIV药物[1]。HIV病毒只有在进入宿主细胞内后才能进行复制,进而导致细胞病变,而逆转录酶及蛋白酶抑制剂都是在病毒进入细胞后才发挥作用。HIV进入抑制剂能够阻止病毒进入细胞,在病毒复制早期即发挥抗病毒作用,因而对耐受前两类抗HIV药物的病毒依然有效,并可组成更多的“鸡尾酒”方案,用于艾滋病的治疗。因此,开发新的阻止HIV病毒进入靶细胞的HIV进入抑制剂已经成为目前抗艾滋病药物研发的热点。HIV进入靶细胞的过程是由其包膜蛋白gp160所介导的,gp160由两个亚基gp120和gp41通过非共价键连接。在HIV进入过程中,首先是gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)先后结合,随后跨膜亚基gp41的构型发生改变,介导病毒包膜与靶细胞膜的融合,完成病毒进入宿主细胞的感染过程。由于gp41的序列在病毒包膜蛋白中较为保守,且是病毒特有的蛋白,以其作为研究HIV进入抑制剂的药物靶点具有较大的优势。目前,主要以gp41形成的核心六螺旋束结构作为药物靶点之一。HIV gp41膜外部分具有两个螺旋重复序列,分别称为NHR和CHR。叁分子gp41上的NHR与CHR分别发生反向结合,形成稳定的六螺旋束(6-Helix Bundle,6-HB)结构,将病毒包膜与靶细胞膜的距离拉近而发生融合,介导HIV进入靶细胞内。HIV进入抑制剂T-20即是衍生于gp41CHR的一段具有抑制HIV与靶细胞融合和抗HIV感染作用的多肽。如果小分子化合物能抑制HIV gp41六螺旋束的形成,也将具有抑制HIV进入靶细胞的作用。2004年,纽约血液中心姜世勃教授筛选到2个“药物样(drug-like)"化合物,NB-2和NB-64[2]。但是,NB-2和NB-64的有效浓度仅在μM级别,远远大于T-20的用量,但可将其作为HIV进入抑制剂的先导化合物(hit),有望研发出更具效能的新型药物。正是基于这一思路,本课题组与军事医学科学院药理毒理研究所谢蓝教授团队合作,采用假病毒体系、体外模拟六螺旋形成的ELISA等方法筛选来自NB-64结构改造后的一系列的小分子化合物,从中发现了两个具有高效抗HIV-1活性且靶向于gp41的化合物。进一步采用多种分子生物学、生物物理学等实验方法探讨了这两个化合物的抗病毒的活性、作用机制及作用靶点。为后续产物的结构优化,寻找更多更有效的HIV-1进入抑制剂奠定基础。目前,HIV-1gp41靶点的药物设计大多是基于NHR和CHR形成六螺旋束结构,而针对疏水性功能区域融合多肽(fusion peptide, FP)和跨膜区域(transmembrane domain, TMD)也逐渐成为人们研究和开发的重点。但目前尚未发现针于上述位点的有效药物。那么,在gp41上,是否还有其他位点也能够成为抑制HIV进入的靶点呢?这使得我们首先要对gp41各部位的功能和作用有更详细和深入的了解。HIV-1gp41NHR和CHR之间的连结区域loop,是在gp41上被发现的第叁个疏水性区域,其序列也较为保守,已被证明在gp41介导融合的过程中至关重要。Loop的中心疏水区域存在一对保守的二硫键,两个半胱氨酸之间601位的碱性赖氨酸为这一段序列中唯一的亲水性氨基酸,可推测其在loop形态和功能中的重要性。因此,我们合成了包含中心区域的27个氨基酸的loop区域多肽以及K601A,L602A突变的loop多肽,研究其突变后对loop结构和作用的影响。这些结果将帮助我们更好的理解gp41在病毒膜与细胞膜融合过程中的作用和机制,为寻找更多可能的药物作用靶点指明方向。本课题为开发新的HIV病毒进入抑制剂提供新的思路。第一部分靶向gp41的HIV-1进入抑制剂的研究目的：通过高通量筛选方法筛选出具有抑制HIV-1感染靶细胞作用的小分子化合物,研究该化合物抗HIV-1进入的活性,评价其体外细胞毒性,并深入探讨其作用机制及可能的作用靶点。方法：1.用pSFl62病毒包膜蛋白质粒与pNL4-3.Luc.RF核心质粒共转染构建HIV-1假病毒,筛选化合物抑制假病毒感染的活性；抑制gp41六螺旋束结构形成的酶联免疫测定法(ELISA)快速检测化合物是否能够阻止NHR和CHR的结合。共有11个待检测系列化合物,阳性对照药物为T20或NB-64,PBS为阴性对照。2.通过假病毒体系包装HIV-1SF162、HIV-1JR-FL、HIV-1HXB2和VSV-G假病毒,检测有抗病毒活性的化合物是否具有抗HIV-1进入靶细胞的作用。同时利用细胞-细胞融合方法初步确定化合物在病毒复制周期中的作用机制和药物靶点。实验时检测化合物在50μM、25μM、12.5μM、6.25μM和3.125μM五个梯度稀释浓度时的作用,阳性对照药物为T20,PBS为阴性对照。3.MTT法评价化合物在100μM和6.25μM五个梯度稀释浓度时在体外对HIV-1作用靶细胞的细胞毒性,阳性对照药物为T20,阴性对照为PBS。4.用酶联免疫测定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)、圆二色谱法(Circular Dichroism, CD)检测化合物抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的活性。建立在细胞水平上的ELISA法检测化合物抑制抗CXCR4单抗与表达CXCR4细胞结合的活性。其中,ELISA选用50μM、25μM、12.5μM6.25μM和3.125μM五个梯度稀释浓度,N-PAGE选用400μM、200μM、100μM、50pM和25μM五个梯度稀释浓度,CD法为20μM,cell-based ELISA为25μM。阳性对照药物为NB-64、ADS-J1或AMD3100,PBS为阴性对照5.利用点突变技术对可能的作用靶点W571、K574、Q577和R579在pJR-FL质粒上进行改造,包装基因突变的假病毒,探讨化合物在HIV gp41上的作用靶点。实验时检测化合物在50μM、25μM、12.5μM、6025μM和3.125μM五个梯度稀释浓度时的作用,阳性对照药物为T20,PBS为阴性对照。6.采用Sigma Plot作图。采用GraphPad Prism5.0软件包进行数据分析,数据结果以x±s表示,多组间均数比较采用One way-ANOVA,多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验；两组数据间均数比较采用两样本t检验,p<0.05具有统计学显着性差异；剂量依赖反应关系分析取X=Log(X)后,采用Nonlinear regression和Pearson分析,Linear regression计算回归方程。结果：1.从来源于先导化合物NB-64的系列小分子化合物中筛选出XLHX-124-50和XLHX-130-7,两者在25μM时能够抑制HIV-1SF162假病毒感染(F=37.90,P=0.0000),且能抑制N36和C34结合形成六螺旋束结构(F=302.8,P=0.0000)。2. XLHX-124-50和XLHX-130-7对HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2这叁种假病毒株的抑制作用呈剂量依赖性(r=0.9855、P=0.0021,r=0.9933、P=0.0007, r=0.9483、P=0.0140和r=0.9253、P=0.0242,r=0.9483、P=0.0140,r=0.8930、 P=0.0413)。XLHX-124-50抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分别为19.65±2.63μM,13.95±3.34μM,23.09±1.10μM;XLHX-130-7抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分别为13.13±4.55μM,13.82±3.06μM,24.96±0.60μM。两个化合物均对VSV-G假病毒无明显的抑制作用(P>0.05),但由于样本量较小,尚不能完全否认其作用。细胞-细胞融合结果显示XLHX-124-50和XLHX-130-7均能有效抑制MT-2和CHO-WT细胞的融合,其IC50分别为14.44±1.24μM和9.54±0.37gM,两个化合物对细胞融合的抑制作用与剂量呈显着正相关关系(r=0.9800、P=0.0034, r=0.9718、P=0.0057)。3.XLHX-124-50和XLHX-130-7对各靶细胞U87.CD4.CCR5,U87.CD4.CXCR4, MT-2以及实验用细胞CHO-WT的体外细胞毒性作用均较低,其CC50值大于其抑制HIV-1假病毒的IC50值。4.利用衍生于HIV gp41NHR和CHR区域的多肽N36和C34,可以在体外形成类似gp41NHR和CHR结合的六螺旋束结构。因此,抗HIV gp41核心六螺旋束结构的活性可以用抑制N36和C34的结合来测定。ELISA法显示,XLHX-124-50和XLHX-130-7均能够抑制gp41六螺旋束结构形成,其作用呈剂量依赖性(r=0.9593、P=0.0098,r=0.9542、P=0.0117),IC50分别是23.05±1.44μM和10.29±0.76μM。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳通过比较gp4l核心结构条带形成的强弱来判断化合物对N36和C34六螺旋束形成的影响,圆二色谱法直观显示了N36和C34形成的多肽二级结构,结果均证实XLHX-124-50和XLHX-130-7均能剂量依赖性地抑制gp41六螺旋束的形成。5.细胞水平上的ELISA检测显示XLHX-124-50和XLHX-130-7没有抑制抗CXCR4单抗与表达CXCR4细胞结合的活性,其作用后的OD450值与PBS组比没有显着性差异(P>0.05),但样本量较小,所以尚不能完全排除化合物在高浓度时抑制单抗与细胞结合的作用。6. XLHX-124-50和XLHX-130-7均能剂量依赖性的作用于W571A、Q577A及R579A突变型HIV-1JR-FL假病毒(r=0.9267、P=0.0235,r=0.9204、P=0.0266, r=0.9399、P=0.0175和r=0.8997、P=0.0375,r=0.9035、P=0.0355,r=0.9648、 P=0.0079),且抑制水平与野生型假病毒接近。但两个化合物都不能够抑制K574D突变的假病毒对靶细胞的感染。结论：筛选自一系列来源于先导化合物NB-64的小分子化合物发现,XLHX-124-50和XLHX-130-7具有抗HIV-1进入的活性,其作用靶点可能是HIV-1gp41NHR口袋区574位的赖氨酸残基。但是对于抗HIV-1的候选药物来说,其有效浓度依然在μM水平,且毒性CC50与抑制作用的IC50相差不显着,两个化合物可做为HIV-1进入抑制剂的先导化合物进行后续研究。第二部分HIV-1gp41Loop疏水中心的功能研究目的：合成突变了氨基酸位点的HIV-1gp41loop多肽(27aa),利用分子生物学、生物化学及生物物理学等多种实验方法研究其二硫键疏水中心疏水性的变化对loop区域在包膜内外功能和结构所产生的影响。方法：1.采用Fmoc固相合成法,合成多肽：L27WT为野生型的含有loop中心区域的27个氨基酸的loop多肽,L27K601A为突变601位赖氨酸为丙氨酸的loop多肽,L27L602A为突变602位亮氨酸为丙氨酸的loop多肽。2.通过所有的通用蛋白质资源库(universal protein resource, UniProt)建立HIV和SIV包膜上的跨膜蛋白的数据资料,运用生物信息学方法,分析loop多肽的序列及疏水性,以及突变后多肽疏水性的改变。3.用RP-HPLC法直接测定loop多肽L27中心区域半胱氨酸的氧化动力学。含巯基的化合物可以与DTNB发生反应,利用DTNB直接显色法可以检测多肽在溶液中所含游离巯基的浓度,通过比较氧化前后的数据,计算出L27中半胱氨酸在溶液或脂质体溶液内是否形成二硫键及其程度。4.用ELISA的方法,检测了叁种抗loop的单克隆抗体T32、240-D、246-D与各多肽之间的结合能力。比较突变后的多肽是否使loop的蛋白结构发生了改变,从而影响其固有的抗原表位,进而减少蛋白与抗体的结合。5.通过圆二色谱法(Circular Dichroism, CD)检测loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A在水溶液和L-a-溶血磷脂酰胆碱(LPC)溶液中二级蛋白结构的变化。6. Loop序列中含有色氨酸(Trp,W)残基,通过荧光偏振的方法检测色氨酸在脂质体(PC:Chol为9：1)中的含量,分析和定量loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A与膜的结合,分析计算得到多肽与脂质体模拟的两性离子膜的结合能力。7.细胞膜和病毒的包膜皆为磷脂双分子层,膜的融合包括了内外膜的融合。通过荧光探针稀释实验来检测两性离子的脂质体融合,研究突变的多肽对于膜与膜融合的影响。8.采用Sigma Plot作图。采用GraphPad Prism5.0软件包进行数据分析,数据结果以x±s表示,多组间均数比较采用One way-ANOVA,多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验；两组数据间均数比较采用两样本t检验,p<0.05具有统计学显着性差异。结果：1.多肽的生物学分析显示,loop中心区域的两个半胱氨酸在序列中非常保守,而另一个碱性残基(赖氨酸K或精氨酸R)也在loop中心内相对保守,K601和L602突变后,多肽的疏水性发生了改变。RP-HPLC的结果也验证了该结果。2. DTNB直接显色法显示,Loop WT可以在水溶液状态下发生氧化,L602A不会减少loop多肽形成二硫键的能力,而K601A发生氧化反应的能力显着下降(t=6.917,P=0.0023),尤其当loop多肽处于膜状态下时(t=4.694,P=0.0094)。RP-HPLC与DTNB检测法的结果相似,L27K601A明显降低了疏水性增加的速度,即减少了loop多肽形成二硫键的能力。3.L27WT对抗loop抗体T32、246-D和240-D的亲和常数分别为4.4×10±106±1.5x106M-1,4.3×107±0.8×107M-1,1.9×107±0.4×107M-1。L27K601A和L27L602A均不能与T32结合,两者与240-D的亲和常数分别是8.6×106±1.4×106M-1和8.4×106±1.9×106M-1,L27L602A与236-D的亲和常数为6.1×107±0.2×107,而L27K601A却不能与246-D结合。4.在HEPES水溶液中,L27WT和L27L602A均呈现一种无规则的弯曲结构,而L27K601A有少量的α-螺旋结构。在膜模拟的环境中(1%LPC),L27WT有非常明显的α-螺旋,L27K601A和L27L602A与其有少量的α-螺旋含量差异。5.通过荧光偏振的方法检测色氨酸在脂质体中的含量,检测到L27WT,L27K601A和L27L602A与膜的结合常数分别为3.8×103±0.5×103M-1,7.2×103±1.8×103M-1,1.5×103±0.9×103M-1。6.荧光探针稀释实验检测两性离子膜与膜融合的结果显示,与L27WT相比,L27K601A可以增加膜的融合(t=5.439,P=0.0055),L27L602A却明显减弱了融合能力(t=15.42,P=0.0001)=L27K601A促进的几乎都是膜的全融合,其内膜的融合比L27WT增加了40%,而L27L602A则大部分为外膜的融合。结论：HIV-1gp41loop疏水中心区域二硫键之间的601位为亲水性的碱性残基赖氨酸,其并非是膜外部分决
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