应激对中国地鼠糖尿病发生的影响，本文主要内容关键词为：地鼠论文,中国论文,糖尿病论文,发生论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
分类号 B845
1 前言
糖尿病是威胁人类健康常见内分泌代谢障碍性疾病之一，它是在遗传易感基础上，由多种内外环境因素造成的胰岛素相对或绝对缺乏以及不同程度的胰岛素抵抗状态，从而表现以持续高血糖症为主的一组综合症，其病因及发病机制仍未完全明了，许多研究者认为，除遗传、自身免疫等生物因素外，心理社会因素也与糖尿病的发生、发展及转归有密切关系。因此，有些作者把它也归入心身疾病的范畴[1]。然而，心理社会因素在人类糖尿病发生中作用的研究存在很大的局限性，受研究条件限制罕见前瞻性研究，因此难于得到肯定的结论。早期动物实验研究多采用外科手术、化学诱导动物模型，得到了一些应激促发糖尿病发生的证据[1-4]，由于这类动物模型的发生过程与人类糖尿病发生过程相差甚远，而逐渐被自发性糖尿病动物模型所取代[3,5,6]。目前的研究结果可以证明，单一刺激因素如慢性应激、动物情绪性或居住环境等均可影响动物糖尿病的发生，但缺乏同时研究这些因素及其交互作用在动物糖尿病发生中作用的系统研究[1-6]。为此，本研究以自发性遗传性糖尿病模型鼠中国地鼠为研究对象，研究实验性应激、情绪性、居住的笼架水平在中国地鼠糖尿病发生中的作用强度及其相互关系，以确定中国地鼠糖尿病发生的主要危险因素。
2 实验设计
2.1 实验对象 实验动物为中国地鼠(Chinese Hamster)，它是自发性遗传糠尿病模型鼠，其糖尿病病理特点为非肥胖型，血糖呈中、轻度增高，血清胰岛素表现多样，胰岛病变程度不一，相似于人类非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，即Ⅱ型糠尿病[7]。种鼠由山西医科大学实验动物室提供，所有实验鼠均在中南大学湘雅二院实验动物室进行近亲繁殖和饲养，实验动物室内光照8Am-8Pm，室温24℃，喂以高脂高蛋白营养饲料，动物自由进食、饮水、实验室通风良好，除实验性应激外无其他不良刺激。
2.2 实验方法
2.2.1 实验动物分组 采用三因素二水平析因设计，为实验性应激（分有应激，无应激）、情绪性（分高分、低分）、笼架水平（居住环境，分上层、下层）；其处理水平组合数为2[3]，共分8组。如第1组为有应激、高情绪性、上层笼架水平组，余类推。1-4组给予应激，5-8组无应激；1、3、5、7组为高情绪性，2、4、6、8组为低情绪性；1、2、5、6组放在上层笼架，3、4、7、8组放在下层笼架。按照动物实验随机入组原则共入组161只。结果为1组23只(♂12，♀11)，2组21只(♂13，♀8)，3组18只(♂11，♀7)，4组21只(♂13，♀8)，5组22只(♂11，♀11)，6组21只(♂14，♀7)，7组19只(♂9，♀10)，8组16只(♂12，♀4)，动物性别构成无统计学差异(x[2]=4.426,p>0.05)。
2.2.2 实验处理因素的确定 综合考虑中国地鼠的生物学特性和行为特点（独居动物、尾巴短约1.8-2.6cm、好斗、多动及对外界反应敏感等）[7]，选用以下处理因素：(1)实验性应激：参照Carter[5]应激方法，采用旋转和震动两种应激随机交替进行，为了防止动物之间相互撕咬，旋转时分别放在小塑料瓶里面，震动刺激时也是各自放入不同的格子里面，活动空间很小，所以也存在“限制”应激。具体方法如下。旋转：为自制旋转器，转速33rpm，使旋转离心力保持在最小程度；震动：为自制震动器，是在75-2型微量搅拌器（上海医用分析仪器厂）上安装18cm×20cm×22cm有机玻璃盒子制成，分成12个格子，每个格子5cm×6cm×18cm。振动频率30-50赫兹，晃动次数最高为1200转／分左右；应激时间随机安排，每次10-30分钟不等，每天1-4次不等，每周3-5天不等。每次应激时1～4组均给予相同的刺激，次数也一致，要求做到刺激总量相同。(2)笼架水平：每个笼箱饲养一只中国地鼠，笼架设上下两层，下层离地20cm高，上层离地150cm高，上下二层笼架大小相同，饲养方式（为高脂饮食）、温度、灯光条件一致。(3)情绪性(emotionality)：是指开放条件下动物情绪始发生程度。在Ader等的评定方法[8]基础上加以修订，编制了中国地鼠情绪性水平评定量表，该量表有取出难易、挣扎程度、发声程度及自发性排尿和排便等5个行为条目，将5项得分相加得出情绪性水平总分，范围为0～8分，经测试总分的中位数为5分，以5分为划界分，能区分出高低情绪性的实验中国地鼠，条目与量表总分呈中高度相关(r=0.33-0.73)，量表总分重测信度良好(r=0.58-0.61)。评定者评分一致性高，符合率达95.2%，Kappa值0.905。说明量表的信度和效度符合测量学要求[9]。
2.3 实验程序 在中国地鼠幼鼠3个月时评定情绪性、测血糖，然后按照三因素两水平析因设计要求随机入组原则进行，连续观察1年后结束实验。血糖测定采取剪动物尾巴取全血快速血糖测定法，仪器为ONE TOUCH Ⅱ（lifescan，美国），使用与该仪器配套的试纸条，以血糖值≥121mg/dl定为糖尿病[7]，快速血糖测定法批内变异系数为2.94%。实验后每3个月检查1次，加上首次测初始血糖1次，共5次，测血糖前12小时内禁食，均在8Am-10Am进行。
3 实验结果和分析
3.1 实验前后八组中国地鼠血糖变化情况及比较
研究结果表明，随着实验进行，全体实验鼠平均血糖由实验初的97.95±20.91mg/dl增加到12个月时103.82±17.90mg/dl，经方差分析血糖呈显著性增高，F=8.543,p<0.01，进一步分析各组实验动物血糖变化情况，第1组（有应激、上层笼架、高情绪性动物）、第3组（有应激、下层笼架、高情绪性动物）、4组（有应激、下层笼架、低情绪性动物）血糖值升高明显，有统计学差异，1组F=2.806，p<0.05；3组F=9.733，P<0.01；4组F=7.982，p<0.01；第2组也有增高趋势，F=2.128，p=0.083，其他5～8组实验前后血糖值变化无显著性，F值分别为0.771、0.776、0.943、0.269，p>0.05。8组实验动物不同阶段血糖值组间比较结果（表1）显示，0、3个月时血糖组间无统计学差异(p>0.05)，第6、9、12个月时血糖值组间差异显著(p<0.05)。结果表明，随着实验进行，中国地鼠总体血糖水平缓慢升高，在6个月时稳定在较高水平，以第3、4组血糖水平升高最为明显。
表1 实验前后八组中国地鼠血糠结果及比较(M±SD)(mg/dl)
表2 实验前后8组中国地鼠发病情况及比较
3.2 实验前后八组中国地鼠糖尿病发病的情况比较
以每次血糖测定值≥121mg/dl定为中国地鼠发生糖尿病，实验结束时总发病率为21.1%。当实验持续到6个月时，各组实验鼠糖尿病发病数组间差异显著(p<0.05)，且这种情况一直持续到12个月(p<0.01)。其中，以3组最高（发病率为50.0%），6组最低（发病率为4.8%），变化趋势与各组血糖值变化一致。
3.3 实验性应激、情绪性水平、笼架水平对中国地鼠糖尿病发生影响单变量因素分析及其相对危险度(RR)
1、2、3、4组为应激组，其他4组为无应激组，两者进行X[2]检验发现，随着实验时间延续，应激组发病率逐渐升高，从6个月开始达到显著性水平(p<0.05)，并持续到12个月。同时，统计相对危险度也发现6、9、12个月相对危险度分别为3.2、2.9、4.1，结果说明给予实验性应激刺激的中国地鼠糖尿病发生危险性是无应激的2-4倍，说明实验性应激在中国地鼠糖尿病的发生中起着重要作用。
情绪性高分组与低分组比较，在0、3、6个月时未发现显著差异，而在9、12个月时两组发病率有显著性差异(p<0.05)，相对危险度分别为3.4、2.3。结果提示，高情绪性的中国地鼠糖尿病发病率随实验持续时间延长而逐渐升高。
比较下层与上层笼架水平的实验鼠糖尿病发生情况发现，发病率未达到显著差异(p>0.05)；相对危险度(RR)也较小，结果说明笼架水平对中国地鼠糖尿病的发病没有显著影响。
表3 单变量对中国地鼠糖尿病发病的影响及其相对危险度(RR)
表4 三因素两水平对中国地鼠实验后血糠影响析因方差分析结果(n=161)
3.4 实验性应激、情绪性、笼架水平三因素两水平对中国地鼠血糖的交互作用分析
为了解实验性应激、情绪性、笼架水平3个因素对中国地鼠实验后血糖变化相互作用的强度，以血糖增加值为统计指标，做三因素两水平析因方差分析。结果发现实验性应激在6、9、12个月时对中国地鼠血糖的作用明显(p<0.01)，笼架水平在9个月时对血糖作用显著(p<0.05)，情绪性在整个实验过程中对中国地鼠血糖作用不显著(p<0.05)。进一步分析发现，笼架水平与情绪性的交互作用对实验后4次血糖无作用(p>0.05)，情绪性与实验性应激的交互作用在3、6、9、12个月时对中国地鼠血糖的影响有显著性(p<0.05)，但是实验性应激、情绪性、笼架水平3者的交互作用对中国地鼠实验后的血糖无显著影响。
4 讨论
近年来大多数研究结果证实，实验性应激能够促使具有糖尿病遗传倾向动物发生糖尿病[2,5,6]，但实验性应激刺激性质与动物糖尿病发生的关系仍未完全明了[10,11]。在动物应激实验中，由于所给予不同性质、不同程度、不同时间的应激刺激，所引起的血糖改变方向和程度可能不一样。我们(1999)曾用拥挤、限制、旋转等急性应激方法研究应激与链脲佐菌素(STZ)诱导的昆明小鼠血糖的关系，发现急性应激后只有少数STZ鼠血糖呈中度升高，并且维持时间只有一周左右，应激刺激四周后应激作用才较为明显，使血糖维持较高水平[4]。Saravia-Fernandez等(1996)提出长程慢性应激作用比短程慢性应激或亚慢性应激强[12]，说明慢性持续的应激具有累加作用，能引起稳定的持续的高血糖状态。本研究所采用的实验性应激时间长达一年，为了防止中国地鼠对这种应激方式产生习惯化，应激时间安排是随机的，每次10-30分钟不等，每天1-4次不等，每周3-5天不等，属于慢性间断的应激，实验性应激后6个月糖尿病发病率才出现稳定的显著性增高。因此，只有长程的慢性实验性应激对中国地鼠糖尿病发生产生显著作用，且这种作用效应是缓慢的，达到一定时间后才促使具有糖尿病遗传性倾向的中国地鼠发生糖尿病。
目前动物应激实验的方法无统一标准，有的采用单项刺激，如电击、游泳或震动，有的采用多项不同刺激联合应作，如旋转、限制、重社会化、麻醉、寒冷等，但是不同的应激方法对动物的血糖水平及糖尿病的发生的影响也是不一致的。如Surwit等(1984)系列研究结果表明，遗传性肥胖鼠(ob/ob)高血糖、血浆胰岛素下降程度部分取决于动物是否暴露于应激环境[3]。Huang等(1981)发现灯光-电击配套应激可降低STZ诱导的CD-1鼠的血糖水平，减少其糖尿病的发生，这种反应只有在STZ注射后72小时内开始应激才会发生，但对于大鼠，电击与其他应激一样使血糖升高，动物发病迅速增加。Carter等(1987)发现多项同时性应激(multiple stressors)如限制、旋转、拥挤、重社会化可缩短BB鼠发病所需要的时间，提高发病率[5]。有研究发现，震动可使即刻早基因c-fos在脑内持续表达，并能防止实验动物对应激产生习惯化[8]。但Saravia-Fernandez等(1996)却发现拥挤、限制、冷刺激、麻醉等短期多项慢性应激能防止6-8周大小的非肥胖性糖尿病模型鼠(NOD)鼠发生糖尿病，推测NOD鼠是否发生糖尿病取决于不同的实验性情景和环境状况[12]。因此，我们参照Carter的应激方法，综合考虑中国地鼠的行为特点，选用旋转、震动合并限制应激，不采用电击等应激方式，实验结果说明我们的实验性应激方法具有可行性和可操作性。
近年来，许多研究者发现实验动物的情绪性与多种心身疾病的发生、发展有密切关系，Ader N.D等(1991)研究NOD时发现情绪性与糖尿病发病率有关，认为情绪性可预测IDDM的发生，是IDDM表达的中介因素[6]。Lehman等(1991)认为对小鼠而言应激越严重，情绪反应就越高，发病率就越低的反应模式[13]。但本研究对情绪性单变量分析发现，中国地鼠情绪性越高，糖尿病的发病率就越高。Surwit(1993)研究了社会环境因素对ob/ob鼠血糖的影响，结果提示ob/ob鼠高血糖反应的表达依赖于所处的社会环境刺激[3]。Ader D.N.等(1991)研究了NOD鼠群居数、笼架高度与糖尿病发病率的关系，研究结束时糖尿病发病率与笼架水平有明显相关，提示笼架高度影响了NOD鼠糖尿病的发病率[6]。但本研究发现笼架高度对中国地鼠糖尿病发病率的无显著性影响。本研究的不同结果可能与中国地鼠的种属、行为反应特点有关。
影响实验动物糖尿病发生的因素很多，如实验性应激性质、强度、作用时间以及动物种类、反应方式、情绪性、性别、体重、饮食饮水行为、所处实验环境等[1-13]，本研究考虑了这些因素，采用三因素两水平析因设计方差分析，以区分是哪个因素起主要作用。研究结果证实，随着实验时间的延长，实验性应激对血糖的影响在6、9、12个月时明显，进一步分析发现，情绪性与实验性应激的交互作用在3个月时就开始起作用，且在6、9、12个月达到显著性，但实验性应激、情绪性、笼架水平3个因素的三级交互作用无显著性，说明实验后中国地鼠血糖的变化主要受实验性应激和动物本身的情绪性的共同作用，并随着时间的推移，这种交互作用就更加明显。根据本研究的结果和综合许多研究者的发现，说明实验性应激对正常实验鼠所产生的血糖增高只是一过性的，它使糖尿病遗传倾向模型鼠的疾病易感性(Disease Susceptibility)增加，从而产生持续血糖增高作用，最终导致动物糖尿病发生[1-13]。