杨立宏[1]1993年在《人白细胞介素-3的基因工程表达及其产物分离纯化的研究》文中指出人白细胞介素-3(human Interleukin 3，hiL-3)是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用PCR方法从人T淋巴细胞cDNA文库中扩增出0.44bp的DNA片段，序列分析后确定含有完整的hiL-3成熟蛋白编码顺序，并在信号肽与成熟蛋白编码顺序之间突变入了限制性内切酶位点和ATG起始码。构建的P_L启动子控制下的hiL-3cDNA表达质粒，转入大肠杆菌后经培养、诱导获得hiL-3高效表达，表达量约占细茵总蛋白的15％左右。进一步设计合成了多个寡核苷酸引物，对hiL-3cDNA 5′端和翻译起始区进行了改造，使hiL-3表达水平提高到占菌体总蛋白30％左右。对所获得的工程菌E.coli Tap106／pSBHL-11进行了初步发酵，最高获得湿菌重为24.4g／L。建立了简单有效的分离纯化方法，纯化后hiL-3纯度达95％以上，比活为1.2×10~7u／mg，总回收率为28.2％对所表达的hiL-3进行了ELISA、Western-blot、等电点聚胶分析和N端16个氨基酸顺序分析。本文还初步讨论了T_7噬菌体g10翻译增强子对hiL-3基因在大肠杆菌中表达的影响，初步在酵母中分泌表达了hiL-3基因，初步在大肠杆菌中表达了hiL-3与hiL-11的融合基因。
李斌[2]2015年在《重组人白细胞介素1β(rhIL-1β)在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学作用研究》文中进行了进一步梳理白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是一个重要的促炎性细胞因子,参与多种疾病的生理病理反应,具有潜在的应用价值。目前关于人IL-1β表达的研究主要是采用原核表达系统,由于大肠杆菌表达重组蛋白表达量低、存在内毒素、分离纯化复杂、蛋白回收率低等缺点,因此,本文选用真核表达系统即巴斯德毕赤酵母表达系统表达人IL-1β蛋白,达到提高蛋白产量和回收率的目的。本文首先根据编码人IL-1β的m RNA序列,利用在线优化工具对其基因序列进行优化,然后分别导入毕赤酵母表达载体p PIC9、p PIC9K和p PICZαA,成功构建人IL-1β重组载体,并将其转染至毕赤酵母菌GS115、SMD1168和X-33,从重组毕赤酵母菌中筛选得到正确且高效表达的工程菌株,然后进一步探讨其3L规模的发酵条件、产物纯化工艺及鉴定其生物学作用。本文首先对重组表达载体p PIC9-h IL-1β、p PIC9K-h IL-1β和p PICZαA-h IL-1β进行鉴定,并将其电转化整合到毕赤酵母受体菌GS115、SMD1168和X-33的基因组中,涂布在MD和YPD+Z平板,待长出单克隆后,用基因组PCR鉴定来筛选阳性克隆,然后通过BMGY培养基诱导培养5天,进行SDS-PAGE和Western Blot蛋白鉴定,最终筛选出可正确高效表达的重组菌株X-33-p PICZαA-h IL-1β。本文在3L发酵罐规模下,通过研究诱导阶段中不同的起始诱导菌体密度(OD)、温度、p H、溶解氧体积分数(DO)和甲醇浓度及诱导时间五个因素对毕赤酵母生长和目的蛋白表达影响,从而确定出最佳诱导条件。实验结果表明,X-33-p PICZαA-h IL-1β工程菌株在3L发酵规模下,最佳诱导条件为起始诱导菌体密度(OD600)为600,温度26℃,p H为5.0,溶氧体积分数20%,甲醇浓度0.25%,诱导3天,rh IL-1β的表达量最高,可达280mg/L。本文对rh IL-1β分离纯化方法进行了初步研究,研究结果显示,首先采用低温离心法去除大部分菌体,然后用磷酸氢二钾/无水乙醇双水相体系对收集的发酵液上清进行抽提,收集上相溶液,经10k D超滤、浓缩,最后经DEAE弱阴离子交换层析分离纯化方法,可以得到纯度在95%左右,收率75%的rh IL-1β。本文分别采用MTT法和Hoechst33258染色法对获得的重组蛋白进行初步的生物学活性检测,MTT法实验数据显示,rh IL-1β对人肝癌细胞株Hep G2和小鼠黑素瘤细胞株B16具有增殖抑制作用,通过显微镜观察rh IL-1β处理过的Hep G2和B16细胞发现,rh IL-1β可促进上述两种癌细胞的凋亡。综上所述,本文为rh IL-1β的工业化生产及研究其生物学作用奠定基础,也为研发抗肿瘤新药提供实验依据。
李利云[3]2016年在《重组人白细胞介素-29突变体的真核表达及抑制肿瘤细胞增殖分析》文中研究说明人白细胞介素-29(Interleukin-29,h IL-29),也被称作干扰素λ1,为2003年发现的一种新型细胞因子。hIL-29与其受体复合物(由IFN-λR1及IL-10R2两个亚基组成)结合激活JAK-STAT信号转导通路,因此h IL-29的生物学效应包括抑制肿瘤增殖、抗病毒和免疫调节等。h IL-29的受体表达具有组织特异性,因此h IL-29的毒副作用较小,故有望成为新型基因工程类药物进一步研究开发。用生物信息学软件将hIL-29的三级结构与人白细胞介素-28B(Interleukin-28B,h IL-28B)的晶体结构进行比对发现,h IL-29在A螺旋中有3个氨基酸残基(33Lys、35Arg、43Lys)与hIL-28B中对应氨基酸残基(34Arg、36Lys、44Leu)不同,F螺旋中143Ala与IL-28B中144Pro不同。以h IL-28B的相应氨基酸为参照,对hIL-29中43Lys和143Ala进行定点突变,并研究h IL-29突变体抗肿瘤细胞增殖活性。采用大引物PCR方法对hIL-29基因进行点突变,得到的hIL-29突变体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得重组蛋白质hIL-29K43L和hIL-29A143P,高效液相色谱检测纯度达到98.17%和97.83%。经过SDS-PAGE分析显示重组蛋白质的相对分子量约23.0 kDa,Western-Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测重组蛋白质hIL-29K43L和hIL-29A143P对肿瘤细胞株(人胃癌SGC7901、人结肠癌HCT8、人肝癌BEL7402、人肺腺癌A549和人急性单核白血病THP1)增殖的影响检测,结果显示h IL-29K43L和h IL-29A143P对上述肿瘤细胞株均有抑制作用,而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rhIL-29的,其中hIL-29K43L对上述肿瘤细胞增殖的抑制率为(29.42±1.76)%、(29.42±1.76)%、(29.42±0.74)%、(27.09±3.85)%和(25.09±3.89)%;h IL-29A143P对上述肿瘤细胞增殖的抑制率为(25.20±3.30)%、(23.84±2.93)%、(28.57±0.80)%、(25.96±1.41)%和(27.86±1.63)%。表明对h IL-29的受体结合区域氨基酸进行改造,可以提高其抗肿瘤细胞增殖活性,这为进一步研制开发h IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。
唐峰[4]2005年在《重组人白细胞介素-15的原核表达和治疗肿瘤的研究》文中研究说明白细胞介素-15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种具有免疫调节活性的细胞因子，它具有与白细胞介素-2(IL-2)相似的生物学功能，可促进T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)的增殖与分化，增强细胞毒T细胞(CTL)／NK细胞的细胞毒活性等，并能发挥优于IL-2的抗肿瘤作用。 本论文是在我们的前期工作基础上，通过基因工程技术和蛋白质纯化技术获得了纯度在95％以上的重组人白细胞介素-15(rhIL-15)，并用建立的小鼠肿瘤模型，研究了rhIL-15的抗肿瘤作用，为将rhIL-15开发成一类抗肿瘤新药奠定了基础。本论文工作主要研究内容包括三部分：(1)rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定；(2)抗rhIL-15单克隆抗体的制备；(3)rhIL-15的急性毒性实验和抗肿瘤作用研究。 (1)rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定 根据已知人白细胞介素-15(hIL-15)成熟蛋白的氨基酸序列，在不改变氨基酸序列的前提下，采用大肠杆菌偏爱密码子合成寡核苷酸片段，通过拼接PCR法成功合成hIL-15基因，分别插入原核表达载体pGEX-2T、pET_(30a)、pET_(42)、pETBlue-1或pBV_(220)，在多种宿主菌中获得了表达，最后筛选到稳定高效表达rhIL-15的工程菌株，即BL_(21)Star~(TM)(DE3)plysS／pBV_(220)-IL-15。在工程菌BL_(21) Star~(TM)(DE3)plysS／pBV_(220)-IL-15中，rhIL-15以包涵体形式表达，最高表达量为菌体总蛋白的15.2％。经蛋白印迹法鉴定表明，此rhIL-15能与抗hIL-15的单克隆抗体特异结合。诱导表达后，分离出包涵体，经反复洗涤后，溶于6mol／L盐酸胍，获得rhIL-15粗品。再经反相层析分离后溶于8mol／L尿素，经透析或稀释复性获得有生物活性的rhIL-15，复性后的rhIL-15依次经DEAE弱阴离子交换层析和Sephadex G-25脱盐得到纯化的rhIL-15。纯化的rhIL-15行SDS-PAGE鉴定及光密度扫描分析，结果显示，纯度在95％以上。N端氨基酸序列分析结果表明，此rhIL-15 N端的前15个氨基酸序列与预期的一致；毛细管电泳分析表明，纯化rhIL-15的纯度接近100％，等电点为4.14，接近rhIL-15的等电点理论值4.42。纯化rhIL-15的体外促CTLL-2细胞增殖活性为6.7×10~6U／mg。因此，可以确定分离纯化的表达蛋白即是rhIL-15。
赵敏[5]2009年在《鸡白介素18在原核和真核中的表达与生物学活性的检测》文中研究指明白细胞介素18是一种新发现的细胞因子,具有多种生物学功能,能够促进γ干扰素(IFN-γ)的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方而具有重要的作用。同时,白细胞介素18在作为天然的免疫调节剂,在集约化畜禽养殖业中,是一种可以替代传统疗法的新型免疫调节剂,具有巨大的应用前景。目前国内外对IL-18的研究主要集中在人和鼠等哺乳动物,而对鸡IL-18的研究报道不多,为此,本试验应用已成功开发使用的原核大肠杆菌表达体系及酵母表达系统对鸡IL-18进行了表达,并对其表达产物的生物学活性分别进行了分析,为进一步研究鸡IL-18的作用机理及其在鸡体内的生物学功能奠定了基础。第一部分:鸡IL-18在大肠杆菌BL21-ChIL-18中的表达、纯化及体外生物活性检测首先对重组菌BL21-ChIL-18的遗传稳定性进行了分析,筛选出了其最佳诱导表达条件,然后用Sephadex G-100对目的蛋白进行纯化,并以牛血清白蛋白为标准蛋白质,用Bradford法检测了纯化的目的蛋白的浓度,对其进行了定量。最后分别用Western bloting、MTT和ELISA等方法在体外分析了其生物学活性。结果表明该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18,在诱导温度37℃时,IPTG浓度为0.6 mmol/L时,诱导4 h目的蛋白相对表达量最高。纯化后的体外活性检测试验表明,其表达的鸡白介素18具有刺激淋巴细胞转化和诱导其分泌γ干扰素的活性。第二部分:鸡IL-18在真核毕赤酵母的表达、纯化和体外生物学活性检测首先应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33中,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达。表达产物用Western bloting鉴定正确后,对其遗传稳定性进行分析,并对其表达条件进行优化,然后再其最佳诱导条件下对重组工程菌进行大量诱导表达并用Sephadex G-100对目的蛋白进行纯化,并用Bradford法检测纯化目的蛋白的浓度,对其进行定量,最后分别用MTT和ELISA等方法在体外对其生物学活性进行分析。结果,成功构建了鸡IL-18真核酵母表达载体,且该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18。其在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度为26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的体外活性检测试验表明,其表达的鸡白介素18具有刺激淋巴细胞转化和诱导淋巴细胞分泌r干扰素的活性。第三部分:重组鸡IL-18对新城疫疫苗免疫免疫效果的影响0日龄300只鸡随机分为6组,每组50只鸡,即空白对照组,新城疫疫苗组,新城疫疫苗+原核IL-18组,新城疫疫苗+原核空载体对照组,新城疫疫苗+真核IL-18组,新城疫疫苗+真核空载体对照组。所有免疫组均于8日龄分别免疫接种相应疫苗,并分别于免疫后的第3 d,7 d,14 d,21 d,28 d和35 d各组鸡随即抽取4只,对其血清的抗体效价、γ干扰素含量、外周血的T淋巴细胞转化水平及其NO分泌和免疫器官指数进行测定,18天后各组随机取20只鸡用于动物攻毒保护试验,。结果表明重组鸡IL-18蛋白增强了新城疫疫苗的免疫效果,提高了血清中抗体水平和γ干扰素含量、提高了T淋巴细胞的转化水平和巨噬细胞分泌NO的水平,促进了鸡免疫器官的生长发育和成熟,升高了其各免疫器官指数,且部分指标差异达到显著(0.01﹤P﹤0.05)或极显著水平(P<0.01)。综上所述,本研究成功的在原核细胞大肠杆菌BL21及真核细胞毕赤酵母X-33中分别表达了鸡IL-18,表达量均较高,且纯化后都具有生物学活性,对新城疫疫苗都有免疫增强作用。
杨珺[6]2005年在《重组人白细胞介素24的表达及其生物学活性鉴定》文中提出1995年P．B．Fisher用差减杂交技术发现一个新的与人黑色素瘤分化相关基因，当时称为mda-7(melanoma differentiation-associated gene 7)，并发现随着黑色素瘤细胞生长、发展和转移，mda-7的表达逐渐减少至最终消失，证实了其表达产物MDA-7具有抑制黑色素瘤细胞增生、促进黑色素瘤细胞终末分化的能力。随后，MDA-7一直作为肿瘤抑制物被研究。直到2002年，Caudell等研究证实了MDA-7的细胞因子属性，重新命名为人白细胞介素24(Human interleukin-24，hIL-24)。迄今为止，已有大量实验证明hIL-24具有显著的选择性抑制多种肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡的能力，这种抑制作用不依赖p53、Rb和p16等抑癌基因的状态，且对正常细胞没有影响。hIL-24作为细胞因子，不仅在激活免疫细胞、调节整个抗癌免疫反应和造血系统中起重要作用，还具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡和直接抑制肿瘤细胞的增殖、转移作用，其显著的抗肿瘤特性使之成为肿瘤治疗研究的新热点。2004年，Introgen公司研制的基因治疗制剂Ad．IL-24，即重组复制缺陷型腺病毒-IL-24，商品名为INGN 241，获美国FDA批准进入Ⅱ期临床试验，体内外试验和临床实验均证实了hIL-24显著的抗肿瘤效果。随着对hIL-24作用机制和基因治疗方面深入的研究，一方面肯定了hIL-24生物学功能和治疗效果，另一方面表现出对hIL-24的大量需求，所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度有活性的重组hIL-24成为必然。本研究分别采用大肠杆菌(原核)表达系统制备了融合蛋白Trx-IL-24，并用肠激酶酶切Trx-IL-24得到重组蛋白IL-24，以及采用毕赤酵母(真核)表达系统分泌表达了重组糖蛋白rIL-24，分析鉴定了三种重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性，为深入研究其诱导肿瘤细胞凋亡机制和肿瘤治疗应用奠定基础。 研究目的：构建hIL-24的大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统，获得三种重组蛋白Trx-IL-24、IL-24和rIL-24。建立Trx-IL-24和IL-24的制备、纯化及复性的中试生产工艺。筛选高效分泌表达rIL-24的重组毕赤酵母工程菌。鉴定三种重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。 研究方法： 1) 人白细胞介素24基因的克隆 采用RT-PCR和nested-PCR方法，从ConA刺激培养的人外周血单个核细胞中，克隆带信号肽的hIL-24编码序列(hmIL-24)和不带信号肽的hIL-24编码序列(hIL-24)。 2) 人白细胞介素24基因在大肠杆菌中的表达与纯化 为避免引入多余的氨基酸，利用载体pET32a(+)上的肠激酶识别位点编码碱基之前的Kpn I位点，及多克
牛春玲[7]2005年在《鸡IL-18基因的克隆、表达及其生物学活性检测》文中提出家禽传染性疾病是养禽业最大的威胁,给养殖业造成严重经济损失。应用传统免疫预防手段仍存在一些问题,如弱毒疫苗的潜在安全问题;灭活疫苗虽然安全有效,但免疫效力尤其细胞免疫作用受限制;基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗等虽具有应用潜力,但也需提高其免疫,尤其是细胞免疫效果。 IL-18是一种强有力IFN-γ诱导剂,具有重要的免疫调节功能,自发现以来一直是细胞因子研究中的热点之一,可望成为疫苗的一种重要的细胞免疫佐剂,以提高机体抗感染力,增强灭活苗或基因工程疫苗免疫效果。 本研究参照GenBank已发表的ChIL-18基因序列,在其编码区两侧设计一对引物,以丝裂原PHA活化的河南大面积饲养的60日龄固始鸡k系、固始鸡纯系及海兰鸡等几个品种鸡的脾淋巴细胞中提取的总RNA为模板,RT-PCR均扩增出大小约600bp的基因片段,并把它克隆到pGEM-T Easy Vector上,构建重组质粒pGEM-ChIL-18,经PCR、酶切鉴定及DNA测序验证,该基因为ChIL-18全基因,比较表明:3个品种ChIL-18全基因序列及推导氨基酸序列均为597bp,含一个开放阅读框,编码198个氨基酸,N端前29个氨基酸为信号肽序列,与Schneider等(2000)报告的ChIL-18基因序列基本符合;IL-18基因存在种的多样性,亲缘关系越近同源性越高,为其作为免疫佐剂应用于预防接种的研究奠定了基础。 在此基础上,我们把从pGEM-ChIL-18上获得的编码鸡IL-18成熟蛋白(mChIL-18)基因用EcoR Ⅰ+SalI双酶切,亚克隆到同样双酶切的大肠杆菌原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-mChIL-18,经PCR、酶切鉴定并进行确证性序列测定,结果表明,将mChIL-18的基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1的目的位点。重组质粒pGEX-mChIL-18转化受体菌BL21(DE3),然后用IPTG诱导,经SDS-PAGE电泳显示,表达的mChIL-18融合蛋白分子量约为49kDa,用0.6mmoL·L~(-1)IPTG于37℃诱导4h表达产物最佳,占总菌体蛋白约20.1%。pGEX-mChIL-18表达产物经分离、纯化、复性,并对其生物学活性进行初步试验,多采用鸡T淋巴细胞转化试验(MTT法),检测表明,mChIL-18具有明显促进鸡T细胞转化的生物学活性,为今后进一步进行mChIL-18的生物学功能研究及其应用奠定了基础。 与人和哺乳动物比较,鸡IL-18的研究相对来说比较滞后,利用体外表达技术研制重组mChIL-18蛋白以及抗鸡IL-18的多克隆和单克隆抗体并以此作为工具进行ChIL-18蛋白的生物学特性、免疫调节作用及其在比较免疫学中作用的研究具有重要的意义。
樊欣迎[8]2009年在《IL-24和EGF受体干扰序列融合基因的克隆、表达及活性研究》文中认为IL-24(白细胞介素24)具有抑制肿瘤血管生成活性、刺激免疫系统应答和诱导肿瘤细胞凋亡的方式联合发挥抗肿瘤效应。大多数肿瘤细胞尤其是实体瘤细胞表面有大量EGFR (Epithelial Growth Factor Receptor,表皮生长因子受体)的表达。表皮生长因子肽段中的C环是EGFR特异性结合位点,称为EGF受体干扰序列(EGFRi,Epithelial Growth Factor Receptor interference)。EGFRi能与表皮生长因子特异性结合,但不具有刺激肿瘤细胞生长的作用,特异的肿瘤靶向性和IL-24独特免疫学作用的有机结合为肿瘤的细胞因子治疗提供了新的思路。本论文应用重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术将IL-24与EGFRi连接,并研究了该融合基因在大肠杆菌中的表达和对重组菌的发酵条件进行了优化,同时对纯化的融合蛋白进行抑瘤活性研究。主要研究内容和结果如下：1.IL-24的克隆及在大肠杆菌中表达以含有切除了N端信号肽的IL-24成熟肽基因的质粒PMAL-c2x-IL-24为模板,通过PCR技术获得IL-24,构建表达载体PET-22b-IL-24,将其电转化到E. coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后表达产物的相对分子质量与预期值(19 kD)一致。利用Ni2+亲合层析柱纯化诱导表达的的IL-24蛋白,MTT检测结果证实其具有体外抑瘤活性,利用Ni2+亲合层析柱纯化诱导表达的的IL-24蛋白,MTT检测结果证实其具有体外抑瘤活性。2.融合基因EGFRi-IL-24的克隆及在大肠杆菌中表达以含有切除了N端信号肽的IL-24成熟肽基因的质粒PET-22b-IL-24为模板,通过重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术获得了融合基因EGFRi-IL-24,构建克隆载体pUC-EGFRi-IL-24;构建表达载体PET-22b-EGFRi-IL-24,将其电转化到E. coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后表达产物的相对分子质量与预期值(22 kD)一致。3.融合蛋白的Ni2+亲合层析柱纯化利用Ni2+亲合层析柱纯化重组菌表达的融合蛋白,经SDS-PAGE检测,表达的融合蛋白纯化后纯度有了大幅度的提高,融合蛋白的纯度超过了80%。4.融合蛋白体外抑瘤活性的研究以MTT法初步评价融合蛋白对乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞A549的抗肿瘤活性,经相同浓度梯度的融合蛋白EGFRi-IL-24、IL-24蛋白处理后,培养的癌细胞均增殖缓慢。与相同浓度梯度的IL-24蛋白组相比,40 mg/L融合蛋白EGFRi-IL-24作用MCF-7细胞72h后,对MCF-7细胞的抑制率达到了72.1%,抑瘤效果明显优于IL-24蛋白(53.4%)；对乳腺癌MCF-7的抑制率优于对肺癌A549细胞的抑制率(64.7%)。
张秀丽[9]2011年在《靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究》文中研究表明背景与目的白血病的发生、治疗中耐药乃至白血病复发的根本原因在于患者体内存在着一群白血病干细胞(LSC)。它跟正常的干细胞一样具有自我更新和分化潜能。它在全血细胞中仅占0.25-1.0%。传统的白血病治疗通常是细胞毒药物的联合化疗配合造血干细胞移植,然而这种方法选择性差,在杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内某些类型的正常细胞,而且只能杀死大部分已分化的肿瘤细胞不能杀死肿瘤干细胞,因此造成肿瘤治疗效果的不理想。所以,只有靶向肿瘤干细胞的治疗才能使恶性肿瘤治愈。在白血病干细胞表面具有一些不同于正常干细胞的表面标志。针对这些表面标志的靶向治疗将有效地靶向肿瘤干细胞而对正常干细胞没有任何损伤。研究发现CD123是AML干细胞所特有的表面标志,其在正常造血干细胞(CD341,CD38-)的表达<1%,而在急性髓系白血病干细胞的的表达>99%。除此之外,CD123在其他白血病细胞的表面也有表达。人白细胞介素3(IL-3)是CD123的配体,是造血干细胞增殖分化的正性调节因子,可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化。IL-3还可增强白血病细胞对某些化疗药物敏感性,能选择性地诱导白血病细胞进人细胞周期,使周期特异性化疗药物对急性粒细胞白血病(AML)细胞的毒性增强。此外IL-3还可与IL4协同作用,促进T淋巴细胞前体细胞的发育,诱导CD4+T淋巴细胞自分泌生长,IL3可直接或间接地影响细胞毒T淋巴细胞的成熟和增殖。基于外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte, PBL)的生物治疗已经成为重要的抗肿瘤策略之一。PBL中的T细胞可以通过与肿瘤细胞接触形成T细胞-肿瘤细胞突触样结构,直接对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。然而,T细胞识别过程的复杂给肿瘤细胞提供了很多机会来逃逸T细胞对其特异性识别,因此肿瘤细胞得以存活并增殖。CD3是T淋巴细胞表面特异分子,通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。本实验基于此构建了抗CD3抗体的Fv与IL3融合形成的抗CD3-IL3融合蛋白,并且通过改造获得了表达量高、稳定性好的抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白。为增强抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白的稳定性,在VL间VH引入了人二硫键,表达并纯化后测定它们体外生物学活性和介导效应细胞杀伤靶细胞的作用。方法用重叠PCR (Overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3/IL3,再用PCR法通过引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变,构建二硫键稳定的抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3*/IL3,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达。表达产物经6×His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及westen-blot鉴定。用同样的方法表达抗CD3*/m2IL3、抗CD3／m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测抗CD3*/m2IL3.抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白与CD123+ M07e细胞和CD3+ Jurkat细胞的结合活性,将4种融合蛋白在0.2%的人血清白蛋白中37℃温育不同时间点至72h后,通过间接免疫荧光法FACS检测其结合活性,并比较二者的稳定性。利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL)作为效应细胞,首先以TF1细胞或M07e或AML病人干细胞(CD34+CD38-CD123+为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度设组,以PBS,抗CD3/抗CD19双功能抗体为对照,另设CD123一的k562细胞为非相关靶细胞组,比较融合蛋白介导的特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25：1,融合蛋白浓度500ng/ml各组,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)的释放。结果基因重组质粒pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3.pAYZ CD3*/m2IL3.pAYZ CD3/ m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3经测序证实序列正确,构建成功。抗CD3*/IL3在原核表达系统中进行可溶性表达过程中发现,表达产物经6×His-tag蛋白纯化柱纯化,浓缩后,12%SDS-PAGE显示在27kD,30KD和57kD各有一条带,但western-blot显示在30KD和57kD均有带,与预测结果一致。但后续实验发现pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3的稳定性差,极易发生沉淀和降解。流式检测发现该蛋白与CD3单抗HIT3A有竞争活性,但与抗CD123单抗竞争活性很弱；ELISA检测结果发现,纯化蛋白中活性IL3的含量很低,约为蛋白定量结果的104分之一,所以我们推测IL3的一端发生了断裂或蛋白构象发生了变化。改造后的抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3非还原性SDS-PAGE中,在57KD、30kD和27KD有条,western-blot在57KD和30KD显示有带；还原性SDS-PAGE显示57KD带消失,在30kD和27kD各有一条带,western-blot在30kD显示有带,这些均与理论相符。57KD为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成30kD和27kD的2条带。表达产物经纯化定量抗CD3*-m2IL3可达1mg/L,抗CD3*-⊿IL3可达2mg/LFACS检测四种融合蛋白均可与CD123+M07e细胞和CD3+Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制单抗AntiCD123和HIT3a与上述细胞的结合。体外血清稳定性实验结果抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3 37℃72h后活性基本不变,而抗CD3-m2IL3、抗CD3-⊿IL3则递减至消失,证明引入二硫键可增加蛋白的稳定性。抗CD3*-m2IL3、抗CD3-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3、抗CD3-⊿IL3体外介导T细胞杀伤靶细胞TF1、M07e细胞的效果比对照组明显(p<0.05),激活T细胞释放Perforin和Granzyme A的量均明显高于对照组(p<0.05)。结论本实验成功构建了pAYZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZ CD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3的表达载体并获得了可溶性表达,改造后的抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m3IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3,其稳定性或活性均有明显提高。二硫键稳定的CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3融合蛋白与抗CD3/ m2IL3,抗CD3/⊿IL3相比稳定性有明显提高,且抗原结合活性和体外介导T细胞发挥杀伤效应的能力没有明显改变。
田兆菊[10]2007年在《牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备》文中指出白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是Okamura等(1995)从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等(2003)研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着奶牛业的发展,奶牛病特别是奶牛乳腺炎呈上升趋势,迫切需要新型疫苗与疫苗佐剂的研发。鉴于此,本实验室对牛白介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)进行了克隆表达,旨在探索利用BoIL-18能促进机体免疫功能的特性,将其应用于奶牛病的预防及临床治疗。本试验针对如何获得高效表达且具有生物学活性的BoIL-18蛋白及利用表达的蛋白如何制备BoIL-18单克隆抗体这些问题进行了探讨,主要包括以下四部分:第一部分:牛IL-18成熟蛋白基因的原核表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中获得重组菌株,将该重组菌在IPTG的诱导下进行表达,用SDS-PAGE、Western blot分析表达情况;用谷胱甘肽琼脂糖(GST)亲和层析树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳分析获得了一条表达条带,分子量约为44KD,凝胶薄层扫描分析显示,表达的蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;生物学活性测定表明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对外周血单个核细胞(PBMC)有明显的增殖作用;BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强;BoIL-18融合蛋白诱导脾淋巴细胞产生的IFN-γ有抑制水泡性口炎病毒(VSV)产生细胞病变的作用,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第二部分:牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb中,构建重组转移载体质粒pFastBac HTb-BoIL18,将其转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid(Bacmid-BoIL18)。在转染试剂Cellfectin的作用下,将Bacmid-BoIL18转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后在不同时间收获sf9细胞及培养上清,应用SDS-PAGE电泳、Western blot分析表达情况;用Ni-NTA树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞sf9中获得了表达,表达的目的条带分子量为26KD,经薄层凝胶扫描分析证实,表达量占总蛋白的21.3%;生物学活性分析表明,BoIL-18蛋白浓度大于0.05 mg/L时,具有明显加强PBMC的增殖的作用;当其浓度大于0.10 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着BoIL-18蛋白浓度的增加,诱导产生IFN-γ的量随之增加;通过诱导牛脾细胞产生IFN-γ,间接地抑制VSV产生细胞病变,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第三部分:BoIL-18单克隆抗体的制备。本试验将第一部分中获得的BoIL-18的原核表达产物作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾与骨髓瘤细胞sp2/0在PEG的作用下进行融合;将第二部分中获得的BoIL-18在昆虫细胞sf9中的表达产物作为筛选抗原,利用间接ELISA方法反复筛选,应用有限稀释法进行多次克隆化后,最终获得了两株可分泌BoIL-18单克隆抗体的阳性细胞克隆。Western-blot证实,获得的单克隆抗体具有良好的特异性;间接ELISA试验检测单克隆抗体5G8和7B3的效价分别为1×105和1×106。对已经冻存的杂交瘤细胞株分别在第3月复苏,用间接ELISA检测杂交瘤细胞株的抗体效价不变,表明所获得的杂交瘤细胞株具有良好的稳定性。两株细胞克隆亚类均为IgG l。第四部分:牛IL-18成熟蛋白基因在家蚕幼虫中的表达。设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pET-BoIL-18中进行PCR扩增,然后将其亚克隆至转移载体pVL1393中,在转染试剂Lipofectin的作用下,与线性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞Bm5,用蓝白斑法筛选出重组病毒BmBacPAK-BoIL-18,经PCR鉴定正确后将重组病毒接种至5龄家蚕幼虫体内,饲养一段时间,取家蚕血淋巴进行SDS-PAGE电泳分析与Western blot印迹测定,分析表达情况。结果表明,BoIL-18在家蚕幼虫体内成功地获得了表达,经凝胶薄层扫描分析显示,表达的目的条带占蚕血淋巴总蛋白的16.7%,Western blot分析证明,在相对分子质量(Mr)为18 000处有一特异性表达条带。
参考文献：
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[3]. 重组人白细胞介素-29突变体的真核表达及抑制肿瘤细胞增殖分析[D]. 李利云. 江南大学. 2016
[4]. 重组人白细胞介素-15的原核表达和治疗肿瘤的研究[D]. 唐峰. 中国协和医科大学. 2005
[5]. 鸡白介素18在原核和真核中的表达与生物学活性的检测[D]. 赵敏. 西北农林科技大学. 2009
[6]. 重组人白细胞介素24的表达及其生物学活性鉴定[D]. 杨珺. 重庆大学. 2005
[7]. 鸡IL-18基因的克隆、表达及其生物学活性检测[D]. 牛春玲. 河南农业大学. 2005
[8]. IL-24和EGF受体干扰序列融合基因的克隆、表达及活性研究[D]. 樊欣迎. 天津科技大学. 2009
[9]. 靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究[D]. 张秀丽. 北京协和医学院. 2011
[10]. 牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备[D]. 田兆菊. 山东农业大学. 2007
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