林庆安, 罗文侗, 修清玉, 李惠萍[1]2000年在《上海部分地区肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶情况及药敏监测》文中认为目的 了解上海地区肠杆菌科细菌产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)的情况 ;比较产ESBLs菌与非产ESBLs菌对 11种抗生素的耐药率。方法 收集 1999年 3月～ 1999年 10月上海地区 4家医院分离的肠杆菌科细菌 10 2 6株 ,用双纸片协同扩散法检测ESBLs ,用Kirby Bauer琼脂扩散法作药敏试验。结果 10 2 6株肠杆菌科细菌中 ,共检出产ESBLs菌 35 2株 ,检出率为 34 31% ,其中肺炎克雷伯菌为 37 40 % ,大肠埃希菌为 30 2 1% ,阴沟肠杆菌为 41 82 % ;除亚胺培南 西司他丁和头孢美唑外 ,产ESBLs菌对其它 9种抗生素的耐药率均显著高于非产ESBLs菌 (P <0 0 1) ;亚胺培南 西司他丁对产ESBLs菌的耐药率最低。结论 上海地区肠杆菌科细菌产ESBLs情况严重 ,临床实验室有必要常规检测肠杆菌科细菌是否产ESBLs;产ESBLs菌对抗生素耐药性比非产ESBLs菌严重 ,亚胺培南 西司他丁和头孢美唑是治疗由产ESBLs菌引起感染的有效抗生素。
皮雁玲[2]2002年在《肠杆菌科三种主要细菌产超广谱β-内酰胺酶的检测及药敏分析》文中提出为了解肠杆菌科三种主要产超广谱 β内酰胺酶细菌的产酶率及耐药情况 ,采用双纸片协同法和NCCL推荐的标准纸片扩散法对 117株细菌进行检测 ,检出率分别为肺炎克雷伯氏菌 3 8.1%、大肠埃希氏菌2 8.5 %和肠杆菌属 2 4.3 %。药敏结果显示 ,产酶菌多重耐药现象较普遍 ,产酶株耐药率明显高于非产酶株 ;临床医师和实验室人员应对其有充分认识 ,并掌握本地区和本医院产酶菌的发生及耐药特点 ,对指导临床合理使用抗生素 ,控制耐药菌株的播散和流行有重要意义
马晓波[3]2007年在《肠杆菌科细菌qnrB介导的喹诺酮类药物耐药机制的研究》文中指出研究背景及目的：1998年Martinez-Martinez等最早发现在肺炎克雷伯菌UAB1上存在质粒介导的喹诺酮类耐药机制(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance，PMQR)。Qnr通过与DNA回旋酶及拓扑异构酶Ⅳ结合而抑制环丙沙星的作用从而导致大肠埃希菌J53接合子的耐药性升高。不少研究显示qnr在全球范围内存在。迄今已发现qnr多个亚型，如qnrA、qnrB、qnrS、qnrC。2006年美国学者发现的qnrB是一种全新的基因型，与qnrA1的核苷酸同源性仅为49．5％(氨基酸同源性39．5％)，其分布有待研究，来源尚不清楚。目前仅印度、美国、台湾和韩国有关于检出qnrB的报道，qnrB常与产SHV-12、CTX-M-15、IMP-8与DHA等β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌密切相关。我们对2005年10月至2006年4月间我院分离的120株头孢菌素耐药的肠杆菌科细菌进行PCR检测、接合验证等以研究qnrA、qnrB的分布，同时对qnr阳性菌株产SHV或CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶的情况进行初步分析，从而为PMQR的进一步研究提供实验依据。方法：1．细菌的鉴定和药敏采用Microscan Walkaway 40~(?)全自动细菌鉴定及药敏分析系统。2．采用碱裂解变性法(E．Z．N．A~(TM) plasmid mini Kit)提取细菌质粒DNA，PCR法检测qnr的存在，qnrA和qnrB的引物分别为A-F(5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG)、A-R(5’-GAGATTGGCATTGCTCCAGT)及MFQ1、MFQ2，产物大小分别为413bp、469bp，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳、成像。每次均设阳性对照和阴性对照，参考菌株Kpneumoniae UAB1(gnrA)及E．coli J53．plus pMG298(gnrB)由上海华山医院抗生素研究所王明贵教授和美国Lahey Clinic的G．A．Jacoby教授馈赠。3．接合实验验证qnr的转移性，受体菌为E．coli J53(Azide resistant)，对接合子的选择采用含100μg╱mL氨苄西林、100μg／mL叠氮钠、8μg╱mL头孢噻肟的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)，将接合子分别接种至含与不含0．06μg／mL环丙沙星的TSA平板上观察喹诺酮类药物耐药性的转移。4．比较受体菌、供体菌及接合子的MIC值，包括多种喹诺酮类药物，采用琼脂对倍稀释法。5．PCR法分别检测qnrA、qnrB阳性菌株orf513或orf1005的存在。采用引物qnrB／B’-CDS扩增qnrB的全序列，由Invitrogen公司采用ABIPRISM~(TM) 3730XL DNA Analyzer测序，结果于www．ncbi．nlm．nih．gov上进行GenBank+EMBL+DDBJ比对。6．对来自同一患者的不同菌种进行检测以了解qnr在体内是否存在水平传播。一株鲍曼不动杆菌同时包含qnrA、qnrB，纯化PCR产物后连接到pMD-18T载体上，转化至E．coli DH5α感受态细胞内，采用抗生素平板筛选单克隆菌落。对经PCR鉴定的阳性克隆，提纯质粒DNA完成测序。7．采用Nitrocefin法检测供体菌产β-内酰胺酶情况，改良三维实验了解细菌产酶表型，Multiplex-PCR法检测bla_(SHV)、bla_(CTX-M)及多种质粒型AmpC酶的b／a基因(包括DHA、MOX、CIT、ACC、FOX等)。结果：1．qnr的检出：120株肠杆菌科细菌中，分别有37株含qnrA，33株含qnrB，其中13株同时检出qnrA、qnrB；其中肠杆菌属、克雷伯菌属细菌及大肠埃希菌qnr的检出率分别为52．9％、57．1％和50．0％。2．接合实验：除一株肺炎克雷伯菌外其余56株接合子均能在TSA选择平板上生长；而一株接合子在含环丙沙星的TSA上不能生长。3．MIC测定：各种抗菌药物对接合子的MIC值较受体菌均有不同程度提高。仅加替沙星、头孢吡肟对qnr阳性菌株的抗菌活性相对较好。4．orf513及orf1005检测：qnrA、qnrB阳性菌株中各有7株检测到Drf513或orf1005的存在。5．qnrB全序列扩增：18株细菌可扩增出681bp或645bp的全序列片段。部分菌株的qnrB序列与qnrB1(DQ351241)完全一致，但4株细菌的qnrB序列与qnrB3(DQ303920)相比，存在3个位点核苷酸序列突变(201 A→T，271位T→G，498位G→A)而导致相应编码蛋白的氨基酸存在两个位点差异：第67位、91位分别由赖氨酸、丝氨酸变成天冬酰胺及丙氨酸(K67N，S91A)。6．qnr在患者体内水平传播：5个患者在首次检出qnr后，相同患者后续分离到的其它菌种中(7株／5人)，仅1株不含qnr基因。且对于同一患者，后续分离到的菌株与首次检出株含有同一类型的qnr，也可能同时包含qnrA、qnrB。鲍曼不动杆菌的qnrB部分序列与qnrB1完全一致，qnrA部分序列与qnrA1相比有一个核苷酸改变(167位C→T)。7．供体菌β-内酰胺酶检测：所有细菌均可使Nitrocefin纸片变红色；33株细菌产ESBLs或AmpC酶。49株(89．1％)供体菌包含bla_(SHV)或bla_(CTX-M)；约70．0％的qnr阳性菌可检测到AmpCβ-内酰胺酶相关的bla基因，以DHA型及MIR-1T、ACT-1型为主。结论：1．2005年10月-2006年4月我院临床存在qnr阳性菌株的流行，本研究在国内首次发现qnrB介导的喹诺酮类药物的耐药机制；2．发现一种与qnrB3最为接近的新的qnrB样基因亚型；3．首次在聚团多源菌、鲍曼不动杆菌中检出qnr的存在；4．包含qnr菌株多为产ESBLs或AmpC型β-内酰胺酶的临床分离肠杆菌科细菌，qnrB常与bla_(SHV)或bla_(CTX-M)、bla_(DHA)关系密切。
林庆安[4]2000年在《上海地区肠杆菌科细菌产超广谱β内酰胺酶情况及药敏监测》文中指出【目的］了解上海地区肠杆菌科细菌产超广谱β-内酞胺酶 （ESBLs）情况；了解产ESBLs菌对11种常见抗生素的耐药情 况；比较并评价双纸片协同扩散法、Etest法和双纸片增效法对 ESBLs的检出率。 [方法] 收集 1999年 3月～1999年 10月上海地区 4家医院 分离的肠杆菌科细菌 1026株，用Kirby-Bauer法作药敏试验；用 双纸片协同扩散法检测ESBLs；分别用双纸片协同扩散法、Etest 法和双纸片增效法三种方法对10株参考产ESBLs菌株与200株 临床肺炎克雷伯杆菌和大肠埃希菌菌株检测ESBLs。 [结果] 常规药敏试验结果显示，在 11种抗生素中耐药率最 低的是亚胺培南（0．10％）和头孢美唑（13．84％） 耐药率最高的 是环丙沙星（47．56％）和头孢呋新（43．96％） 其中环丙沙星对大 肠埃希菌的耐药率高达68．88％；除头孢他啶外，其它第三代头 孢菌素和氨曲南的耐药率均在 30％以上，高于阿米卡星的耐药率 （2．26％）；在所有肠杆菌科细菌中，阴沟肠杆菌的耐药问题尤 为严重，仅亚胺培南和阿米卡星敏感性较好，分别为 100％和 70．91％。在 1026株肠杆菌科细菌中，用双纸片协同扩散法共检 出产ESBLs菌352株，检出率为34．31％，其中肺炎克雷伯杆菌 为37．40％，大肠埃希菌为30．21％,阴沟肠杆菌为41．82％，产气 肠杆菌和枸橼酸杆菌也分别检测到产ESBLs菌；各种来源标本 上躇站互厂方亦杆勿q产走广办p－o 份况和矽仪士肘－ 肠杆茵科细菌产ESBLs率无显著差异，各种杭生素纸片对ESBLs 的检出率也无显著差异；除亚胺培南和头抱美哇外，产ESBLs 菌对其它 9种抗生素的耐药率显著高于非产 ESBLs菌（P＜0．of）， 亚胺培南和头抱美哇对产 ESBLS菌的敏感性最高，分别为 100O 和 84．66o。在 10株参考产 ESBLs菌株中，用双纸片协同扩散法、 Etest法和双纸片增效法三种方法分别检出 9株、9株和 10株， 检出率分别为 90％、90％和 100％。i种方法对 200株临床菌株 中产ESBLs菌的检出率分别为刀％、75％和79％，三种方法间 无显著差异。 l结论］上海地区肠杆菌科细菌中产 ESBLs菌流行情况严 重，上海地区临床实验室有必要常规检测肠杆菌科细菌是否产 田＊L引 上海地区肠杆菌科细菌耐药问题严重，产田＊k菌对大 多数抗生素的耐药性比非产ESBLs菌严重得多，亚胺培南和头 袍美哩是治疗由产ESBLs菌引起感染的有效抗生素；双纸片协 同扩散法和双纸片增效法敏感性高、经济、操作简便易行，适宜 在各级医院临床实验室推广普及。
姚闯[5]2007年在《肠杆菌科细菌的分离鉴定，抗生素耐药性分析以及其超广谱β-内酰胺酶检测》文中研究说明抗生素的应用,虽然能给人类有效的治疗疾病,但抗生素的不合理使用也给人类带来一定的麻烦。随着抗生素的广泛使用,抗生素耐药已经成为日益突出的问题。尤其是近年来第三代头孢菌素的广泛应用,它诱导产生了超广谱β-内酰胺酶,此酶使细菌耐药性增强。超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌耐药的主要机制之一。因此,肠杆菌科细菌耐药成为人们关注的焦点。本文通过对临床感染性细菌进行分离鉴定,并对其进行药物敏感试验,选出对头孢菌素类和青霉素类耐药的细菌进行超广谱β-内酰胺酶检测。具体试验路线如下:1.对临床感染性细菌分离鉴定出肠杆菌科细菌。2.对分离鉴定出的肠杆菌科细菌用平皿二倍稀释法进行药物敏感试验。3.选出对头孢菌素类和青霉素类耐药的细菌进行超广谱β-内酰胺酶检测。
刘丹, 李安荣, 徐波, 胡久红, 陈光[6]2018年在《我院肠杆菌科细菌的分布及耐药性研究》文中提出目的了解肠杆菌科细菌的临床分布及耐药性,为临床合理用药提供依据。方法收集常规培养检出的3 467株肠杆菌科细菌,采用细菌全自动鉴定/药敏分析仪进行细菌鉴定及微生物敏感性试验。结果检出3 467株肠杆菌科细菌,标本分布主要以尿液(33.5%)为主;其次为痰(29.4%)、血液(12.1%)、脓液(9.8%),科室分布主要为泌尿外科病房(11.4%),其次为ICU病房(9.8%),分离的肠杆菌科细菌中主要为埃希菌属(42.8%)和克雷伯菌属(34.8%),埃希菌属和克雷伯菌属产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性率分别为61.5%和35.9%,肠杆菌科细菌微生物敏感性试验总体耐药率较高,对氨苄西林(89.8%)和头孢唑林(94.9%)耐药率最高,其次为哌拉西林(57.0%)和四环素(55.1%),对复方新诺明、环丙沙星、头孢噻肟、氨苄西林/舒巴坦耐药率在40%~50%,对阿米卡星(4.1%)、哌拉西林/他唑巴坦(8.9%)、亚胺培南(3.1%)、美罗培南(2.0%)耐药率较低,产超广谱β-内酰胺酶(50.5%)和产碳青霉烯酶(3.1%)的肠杆菌科细菌耐药率更高,并呈现多重耐药。结论我院肠杆菌科细菌主要引起泌尿系和下呼吸道感染,总体耐药现象日趋严重,尤其是产超广谱β-内酰胺酶和产碳青霉烯酶的肠杆菌科,细菌的耐药性监测对临床合理使用抗菌药有着重要指导意义,加大控制抗菌药合理应用的力度,以减少耐药株的上升。
刘艳洁, 张灵利[7]2018年在《产ESBLs肠杆菌科细菌检测及药敏分析》文中研究指明目的监测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株在本院的分离率和耐药率,以便指导临床合理用药和预防控制院内感染。方法采用上海星佰BIOJOSUN-Ⅱ微生物鉴定药敏分析仪对本院2016年1~12月住院患者送检的各种标本进行细菌鉴定及药物敏感试验,对仪器提示为产ESBLs的菌株,用双纸片协同法进行ESBLs的确证试验。结果2016年1~12月共检出大肠埃希菌677株,其中产ESBLs237株,占35.0%;检出克雷伯菌属276株,产ESBLs116株,占42.0%;检出变形杆菌46株,其中产ESBLs20株,占43.5%。根据药敏试验结果显示,产酶株比非产酶株的耐药率高。结论随着广谱抗菌药物广泛应用,产ESBLs菌株越来越多,产酶株比非产酶株的耐药性明显增强,可供选用的药物越来越少,给临床抗感染治疗带来巨大挑战和困难。各实验室对革兰阴性杆菌ESBLs检测显得更加重要,及时准确地报告产ESBLs菌株,对指导临床合理用药,延缓细菌耐药性产生,抑制耐药菌株的播散具有重要意义。
邓树琴, 李熙建, 龙琴, 刘影, 谭同均[8]2012年在《几种产超广谱β-内酰胺酶细菌耐药性的动态分析》文中研究表明目的对我院2008～2010年几种常见的产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)细菌的检出、分布,耐药性等状况进行统计分析,为临床用药和控制感染提供依据。方法收集我院近三年来分离的非重复性的1331株肠杆菌科细菌,采用Vitek-2 Compact全自动细菌鉴定/药敏分析系统进行鉴定及药敏试验,采用WHONE5.5软件进行药敏结果分析。结果在分析的肠杆菌科细菌中,检测出产ESBL菌有513株(49.51%)。泌尿外科、呼吸内科、新生儿科、普通外科等科室分布靠前。呼吸道、尿液、分泌物等标本检出比例较大。近三年产ESBL菌株检出率均有不同程度的升高。药敏试验结果显示,产ESBL阳性菌株的敏感率明显低于ESBL阴性菌株。对ESBL阳性菌株而言,亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星的敏感性较高;而对头孢菌素三代、喹诺酮类、氨苄西林/舒巴坦等敏感性较低。结论细菌耐药性在目前仍呈增长趋势,产ESBL细菌的耐药性增长尤为明显,加强耐药性的监测,对临床合理选用抗菌药有较积极的作用。
朱于娟[9]2017年在《RICU和呼吸科普通病房主要肠杆菌科细菌下呼吸道感染的细菌耐药性的比较分析》文中研究表明背景:医院感染是当前影响患者安全和治疗效果最重要的危险因素。随着抗菌药的广泛应用,耐药菌株不断增加,医院感染的防控形势严峻。呼吸道感染是临床上最常见的感染性疾病之一,在所有感染性疾病的死亡原因中排首位,下呼吸道感染(LRTI)在医院感染中的发病率排第二位,病死率30-70%,是导致原有疾病治疗失败、经济负担加重的重要原因。20世纪60年代以后,革兰氏阴性菌已成为医院感染及LRTI的主要致病菌。目的:通过比较呼吸重症监护病房(RICU)和呼吸科普通病房肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌LRTI的构成比及其耐药性特点,寻求在呼吸科不同医疗单元RICU和呼吸科普通病房,针对该两种细菌的有效治疗方案。方法:以2013年1月~2016年6月苏州大学附属第一医院RICU与呼吸科普通病房诊断为LRTI的患者为研究对象,以不同病区进行分组。细菌学结果来源于痰液标本、下呼吸道分泌液刷检物或支气管肺泡冲洗液标本(经下呼吸道分泌液刷检或支气管肺泡冲洗(LRT-SB-BW)获得的标本)及血液标本。对分离到肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的LRTI患者的标本来源构成、细菌构成及常用抗菌药的药敏结果等细菌学相关数据进行了回顾性分析。结果:(1)RICU与呼吸科普通病房痰液标本、LRT-SB-BW标本、血液标本检出肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌该两种肠杆菌的构成比差异无统计学意义(P>0.05)。(2)RICU的肺炎克雷伯氏菌的检出率为80.7%,明显高于大肠埃希氏菌的19.3%;呼吸科普通病房的肺炎克雷伯氏菌检出率也恰为80.7%,明显高于大肠埃希氏菌。(3)RICU与呼吸科普通病房常见的两种肠杆菌肺炎克雷伯氏菌及大肠埃希氏菌构成比差别无统计学意义(P>0.05)。(4)RICU与呼吸科普通病房的肺炎克雷伯氏菌对多种抗菌药的耐药率两两比较差异有统计学意义。耐药率低于50%的仅有头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、亚胺培南,其中后两者低于30%;而对于呼吸科普通病房,除氨苄青霉素、头孢唑啉,其他抗菌药耐药率均低于50%;丁胺卡那、亚胺培南的耐药率低于10%。(5)RICU与呼吸科普通病房的大肠埃希氏菌对多种抗菌药的耐药率两两比较差异无统计学意义。在RICU,对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、亚胺培南的耐药率均低于50%,除头孢吡肟,与肺炎克雷伯氏菌较为相似。对于呼吸科普通病房,头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、亚胺培南对大肠埃希氏菌耐药率均低于20%。结论:1、RICU的LRTI的常见病原体肺炎克雷伯氏菌及大肠埃希氏菌的构成比,与呼吸科普通病房比较,两者之间没有明显差异。2、无论是RICU还是呼吸科普通病房,肺炎克雷伯氏菌检出率要明显高于大肠埃希氏菌的检出率。3、对于RICU及呼吸科普通病房的肺炎克雷伯氏菌所致的LRTI,经验治疗可选择亚胺培南或亚胺培南联合丁胺卡那的方案;而对于RICU及呼吸科普通病房的大肠埃希氏菌所致LRTI,β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂(如头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦),或亚胺培南,或两者分别联合丁胺卡那可作为经验治疗的选择方案。
胡付品[10]2010年在《碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制及其所致医院感染控制研究》文中研究表明肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌等,是引起医院感染最常见的病原菌。据历年上海地区和CHINET全国细菌耐药性监测结果显示,肠杆菌科细菌占所有革兰阴性菌的60-70%。碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等是临床治疗肠杆菌科细菌尤其是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶等多重耐药菌株引起感染的最有效的抗菌药物。然而,随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用,耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae, CRE)正在医院内悄悄出现。如在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的耐药率也已经由早年的零上升到1%；在肠杆菌科的其他一些菌属已经有7.0%的耐药率。在非发酵菌的某些菌属的耐药率也已经上升为20%-30%。由于大多数对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌同时也对许多临床常用的抗生素耐药,成为泛耐药菌株,对病人的生命构成极大的威胁。该类药物在临床的应用受到严峻的挑战。对2005年-2009年华山医院所有分离的CRE菌株临床资料的分析结果发现,同一病床的不同时间入院患者均能分离到CRE菌株,如神经外科病房的某一床位,2005年8月、2006年1月、2007年3月和2007年9月分别从四位不同的患者分离到碳青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括3株弗劳地柠檬酸杆菌和1株肺炎克雷伯菌;同一患者亦能分离到不同菌属的CRE菌株,如鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌组、弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌组、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌组等。因此,我们推测CRE菌株在医院范围内广泛播散的机制主要有以下两种：①水平传播：携带碳青霉烯酶如KPC-2型酶的质粒在不同细菌间进行直接转移；使敏感株成为耐药株；②克隆传播：CRE菌株通过各种方式在不同患者间克隆传播而导致医院感染暴发流行的发生。尽管CRE菌株已逐年增加且呈暴发流行的趋势,但目前国内的的研究大多集中于耐药机制的研究,对该类菌株如何在不同种属细菌间广泛播散的传播机制尚缺乏深入的研究,对该类菌株引起的医院感染的危害性亦未得到足够的重视。Kochar等人通过加强手卫生和环境表面消毒成功减少碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的传播。但有关此方面的研究国内尚未见报道。由于CRE菌株引起的感染大多为重症感染且目前临床并无有效的治疗药物可供选择,尤其是对于CRE菌株引起的中枢神经系统感染更是如此。与往年相比,2009年碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌的发生率在快速的上升,如再不采取有效的医院感染控制措施加以控制,该类菌株引起的大爆发流行所给患者带来的灾难性后果将不可避免。因此,了解CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的机制,采取有效的措施控制该类菌株引起的医院感染的发生及暴发流行已是迫在眉睫。本课题旨在通过分子生物学技术与临床流行病学调查相结合的方式揭示CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的机制,为采取行之有效的医院感染控制措施以及时遏制该类菌株引起的持续感染和暴发流行提供实验室和临床依据,这对促进临床抗感染治疗的合理用药以及患者的康复将产生积极的影响,同时也将带来极大的社会效益和经济效益。本研究内容共包括以下四部分。细菌产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯类耐药的主要机制之一,文献报道,该类菌株还可产生超广谱β内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases, ESBLs)和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白缺失等。为检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶,美国临床实验室标准化研究所(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)于2009年推荐了改良Hodge试验,用于肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测。该法最初是由Wavell hodge建立的一种用于检测产青霉素酶淋病奈瑟菌的试验。之后多位学者用此方法或进行改良用于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中金属酶的检测以及大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的CMY-1型AmpC酶的检测。华山医院于2005年首次出现CRE菌株,随后我们通过细菌耐药监测系统连续对此类菌株的出现进行了监测。2005年1月-2009年12月间我们共分离到220株对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,包括克雷伯菌属161株(其中肺炎克雷伯菌158株,产酸克雷伯菌3株)、柠檬酸杆菌属41株(其中弗劳地柠檬酸杆菌35株,其他柠檬酸杆菌6株)、大肠埃希菌6株、阴沟肠杆菌4株、奇异变形杆菌3株、粘质沙雷菌2株、产气肠杆菌1株、支气管博得特菌1株和斯氏普罗威登菌1株。纸片扩散法药敏试验结果显示,2005年-2008年华山医院临床分离的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南等抗菌药的耐药率在2%以下,但2009年快速上升至16%左右；弗劳地柠檬酸杆菌2005年对碳青霉烯类抗生素的耐药率在10%,2006年快速上升至45%左右,2007年-2009年维持在35%左右。琼脂稀释法检测2005年-2009年中的78株CRE菌株的药敏试验结果显示,对亚胺培南、美罗培南、厄他培南和粘菌素的敏感率分别为16.4%、17.9%、1.3%和96.0%。上述药物对78株CRE菌株的MIC50/MIC90分别为32/256 mg/L、64/>256mg/L、128/>256mg/L和1/1mg/L。改良Hodge试验对78株CRE菌株中的碳青霉烯酶进行了检测。结果显示：93.6%(73/78)的菌株为阳性,提示这些菌株可能产碳青霉烯酶。采用PCR法对78株CRE菌株进行了各种碳青霉烯酶基因、ESBLs和质粒AmpC酶基因的检测及DNA测序结果显示,33.3%(26/78)的菌株产KPC-2型碳青霉烯酶,且其中分别有7.7%(2/26)、7.7%(2/26)、3.8%(1/26)的菌株同时伴有VIM-1、IMP-2和IMP-1型金属酶。6.4%(5/78)、5.1%(4/78)、3.8%(3/78)、6.4%(5/78)和12.8%(10/78)的菌株分别产VIM-1、IMP-1、IMP-2、GIM和OXA-69型碳青霉烯酶基因。多重PCR检测结果显示,20.5%(16/78)的菌株产OXA-23like、OXA-51like或OXA-58like型碳青霉烯酶。VIM-2、SPM、NMC、IMI、IND、OXA-48、OXA-50、OXA-55、OXA-60和OXA-24like碳青霉烯酶基因检测结果全为阴性。PFGE同源性分析：按Tenover标准,25株弗劳地柠檬酸杆菌分为3种不同的DNA谱型(A-C),其中15株产KPC-2型酶的菌株为同一谱型(A),提示存在克隆菌株传播流行可能。43株肺炎克雷伯菌分为10个不同的DNA谱型(A-J),9株产KPC-2型酶菌株中7株为同一谱型(J),其余2株为同一谱型(I)；不产KPC-2型酶的CRE菌株间亦存在克隆菌株的传播流行。外膜孔蛋白分析：SDS-PAGE电泳结果显示,与敏感菌株相比,29.5%(23/78)的CRE菌株至少缺失OmpK35和OmpK36中的1条或两者全部缺失,60.3%(47/78)的菌株外膜孔蛋白均存在表达下降现象,提示外膜蛋白在CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药过程中发挥了重要作用。接合试验：对产KPC-2型碳青霉烯酶基因的6株肺炎克雷伯菌(其中2株同时产VIM-1型金属酶)和3株弗劳地柠檬酸杆菌的接合试验结果显示,所有9株细菌均在选择性平板上获得转移接合子。药敏试验及β内酰胺酶基因PCR检测结果显示,供体菌中所含的ESBL基因均成功转移至受体菌中,转移接合子均表现为对第三代头孢菌素耐药。但KPC-2型碳青霉烯酶或VIM-1型金属酶基因均未能从供体菌转移至受体菌。转化试验亦未能将此两种碳青霉烯酶基因转移至受体菌,推测该耐药基因可能位于染色体上,或可能含有KPC-2型碳青霉烯酶基因的质粒过大而导致接合或转化试验失败。同一病床的不同时间入院患者均能分离到CRE菌株,同一患者亦能分离到不同种属的CRE菌株,以及在某些患者身上,经常看到这样一种现象：最初分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素是敏感的,但经过一段时间的治疗后变得对碳青霉烯类抗生素耐药。为在体外模拟体内菌株出现的上述现象,我们采用接合试验尝试对这一演变过程进行复制,以期能够初步解释CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的现象。本研究对同一患者临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌A1979和碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌K1980进行了接合试验,利用厄他培南和舒巴坦作为接合子菌株筛选药物,成功筛选到了鲍曼不动杆菌A1979和肺炎克雷伯菌K1980菌株的接合子,药敏试验结果证实接合子菌株对厄他培南、亚胺培南和美罗培南均表现为耐药。ERIC-PCR和PFGE试验均证实对碳青霉烯类药物抗生素耐药的接合子菌株与敏感的受体菌的ERIC-PCR和PFGE谱型完全一致。由于此次选择的供体菌鲍曼不动杆菌A1979其产金属酶的种类尚未知晓,因此接合子菌株中含有哪一种金属酶基因仍有待进一步的研究。在后续的进一步研究中,我们将选择更多的菌株进行类似的直接的接合试验。并对接合试验所获得的接合子菌株以及供体菌和受体菌中的耐药质粒DNA分别进行测序分析,以从分子生物学水平解释碳青霉烯酶在不同种属细菌间转移的机制。我们对神经外科病房某一床位进行了调查。该床位频繁地住过CRE菌株感染患者或定植者。采用含1片厄他培南(10μg)纸片的5毫升MH肉汤的增菌法从患者肛周标本、尿道口标本以及氧气湿化瓶中的水样标本中均分离到了对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌。PFGE同源性分析证实分离自这3份标本中的3株菌株为同一PFGE谱型。同时采集该病房7位患者床头的氧气湿化瓶中的水样标本,结果发现从其中5名患者的湿化瓶水样中分离出了对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括2株肺炎克雷伯菌、3株鲍曼不动杆菌和1株嗜麦芽窄食单胞菌等。而对神经外科某一病房的环境标本及工作人员的一次集中采样筛选CRE菌株结果显示,病床左右栏杆及桌子台面的环境标本,护士的手上以及输液泵屏幕上均存在碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌。提示氧气湿化瓶和医院环境中存在的CRE菌株可能是在医院环境中引起各种感染尤其是呼吸道感染的关键传播源头之一。对78株CRE菌株感染患者的病史资料回顾性调查分析结果显示,发现多种抗菌药物的应用以及引流管包括导尿管和脑脊液引流管的留置可能是导致CRE菌株感染和难以清除的危险因素；CRE菌株携带或感染患者在不同床位和病房之间的频繁轮流更换可能是导致CRE菌株在医院范围内广泛播散的关键因素。通过上述研究,得出以下结论：1.药敏试验结果显示,自华山医院分离的肠杆菌科细菌,包括肺炎克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌等菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的耐药率高。其中CRE菌株绝大多数为对碳青霉烯类抗生素高度耐药株。亚胺培南、美罗培南和厄他培南对其的的MIC90均≥256 mg/L。这些CRE菌株绝大多数分离于神经外科病房患者,并以尿液标本与呼吸道标本的分离株为主。2.改良Hodge试验对78株CRE菌株中的碳青霉烯酶检测的结果显示,93.6%(73/78)的菌株为碳青霉烯酶产生株。与PCR法检测碳青霉烯酶基因结果相比,其检测灵敏度和特异性分别为97.9%、12.9%。3.PCR检测耐药基因结果及SDS-PAGE电泳分析外膜孔蛋白结果显示,60.3%(47/78)的菌株产碳青霉烯酶,其中33.3%(26/78)产KPC-2型酶。产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制之一。35.9%(28/78)的菌株至少丢失1条外膜孔蛋白,提示产生ESBLs和/或质粒AmpC酶且同时合并外膜孔蛋白丢失是导致CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的另一个重要的耐药机制。4.虽经多次接合试验和转化试验,但编码KPC-2型碳青霉烯酶的基因始终无法从供体菌转移至敏感菌中,但供体菌中的ESBLs基因却在接合的过程中进行了转移。推测编码KPC-2型碳青霉烯酶的基因可能位于染色体上,或与ESBLs基因分别存在于不同的耐药质粒上。5. PFGE同源性分析结果显示,碳青霉烯类抗生素耐药的弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌均存在克隆菌株在不同病房之间的流行和传播。6.含1片厄他培南(10μg)纸片的5毫升MH肉汤增菌法可提高从各类标本中筛选碳青霉烯类抗生素耐药菌株的检测率,可作为医院感染调查的推荐检测方法。7.流行病学调查研究结果显示,神经外科病房多数氧气湿化瓶中均检测到碳青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌等。病床周围、医护人员手部以及患者肛周均携带有CRE菌株。上述因素可能是导致CRE菌株在医院环境广泛播散引起各种感染尤其是呼吸道感染的关键传播源头。8.本研究调查初步结果显示,手卫生和加强医院环境消毒卫生将是阻断碳青霉烯类药物耐药菌株在医院环境内广泛播散的关键措施。及时采取有效地医院感染控制措施限制耐药菌株尤其是碳青霉烯类药物耐药菌株的播散将成为当务之急。
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