赵炜[1]2002年在《人类Numb配体蛋白基因LNX的克隆和功能研究》文中研究指明不对称细胞分裂是指1个细胞分裂为2个具有不同发育潜能的细胞，是产生细胞多样性的基本途径。Numb蛋白是神经发育中第一个被发现呈不对称分布的蛋白，是产生不对称细胞分裂的重要因素之一。我们从人胎脑cDNA文库中得到一条与小鼠Numb配体蛋白基因Lnx（Ligand of Numb Protein-X）高度同源的新基因。根据HUGO命名委员会同意，我们将其命名为人类Numb配体蛋白基因LNX。该基因全长3737 bp，开放阅读框从236位到2134位，其编码蛋白含有4个PDZ结构域和1个与Numb蛋白的PTB结构域作用的LDNPAY基序。Northern杂交、RT-PCR和原位杂交显示，LNX mRNA在脑中的分布有一定的特异性，而且在胶质瘤组织中高表达。小鼠不同发育阶段的肾脏原位杂交显示，LNX mRNA 主要表达在肾脏髓质中，且随着肾脏的发育表达量逐渐减少。对基因芯片表达谱数据进行聚类分析，发现LNX基因的相关基因中包括FE65、Frizzled等信号传导相关基因。采用酵母双杂交系统，我们用LNX蛋白中的PDZ结构域为诱饵，筛选相互作用蛋白。我们发现Ski相互作用蛋白SKIP和PDZ结合激酶PBK可以和LNX结合，酵母结合试验、体外pulldown试验和体内免疫共沉淀试验验证了它们的相互作用。用荧光共聚焦显微镜观察发现，LNX蛋白可以分别和Numb蛋白、SKIP蛋白和PBK蛋白共定位于细胞核。我们推测，LNX蛋白可能通过其PDZ结构域募集相关蛋白到特定的细胞内区域组成蛋白复合体，参与包括Notch途径在内的信号传导途径。
郭正光[2]2012年在《两种高效研究泛素连接酶底物的新策略》文中认为泛素化是真核生物中最重要的翻译后修饰之一。泛素化过程除了参与蛋白酶体降解之外,还参与调节许多生物学过程,包括细胞内转运,DNA修复,信号传导和蛋白质蛋白质相互作用。泛素化过程通过多步酶促级联反应实现。在这一过程中,泛素连接酶(E3)决定了泛素化底物识别的特异性。然而多数E3的底物尚不清楚。鉴定这些底物是当前泛素化研究的主要难点。目前,多数底物的是在不同实验室用不同的方法逐一鉴定出来的,需要更好,更快,更经济的高通量方法鉴定E3底物。目前已经有几种高通量研究E3底物的方法,包括,1.利用蛋白质芯片作为底物高效筛选E3底物；2.体内(in vivo)非标记定量或SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino Acid)标记定量质谱的方法；3.体内GPSP (Global Proteins Stability profiling)的方法。在本研究中,我们建立了与上述方法不同的两种较高通量鉴定泛素连接酶底物的新策略。许多E3特异性识别底物是通过他们的蛋白质相互作用结构域实现的,在本论文的前一部分,我们建立了一套在蛋白质组水平上系统鉴定含蛋白质相互作用结构域的泛素连接酶底物的策略(见图1)。本策略通过筛选随机多肽文库鉴定蛋白质相互作用结构域的配体结合特性。通过构建了一系列人工底物(artificial degron),包括一个可以被泛素化的序列和一系列识别底物的序列用于体外泛素化实验。通过这一策略,除了底物之外还能鉴定到非底物调节蛋白。该策略还能鉴定到底物识别的详细机制,这对于药物的研发很有帮助。本课题中以LNX (Ligand of Numb protein X)家族E3(一组含有PDZ结构域的RING-type泛素连接酶)为例,来阐述和验证这一策略。我们鉴定到大量LNX1的潜在底物；在选出的9个候选底物中,8个在体外泛素化实验中被LNX1泛素化。在进一步的细胞内验证中,本研究验证出两个LNX1内源底物—-PBK和BCR。进一步实验证明LNX1催化PBK的泛素化和降解,抑制细胞增殖,促进阿霉素诱导的细胞死亡。我们还描述了LNX1识别底物的详细机制,即LNX1通过哪个PDZ结合底物。这一策略作为一个在蛋白质组水平上系统鉴定E3底物的有力工具,能够扩展到其他含有蛋白质相互作用结构域的泛素连接酶的研究。在本文的后一部分,我们建立了另一套较高通量鉴定E3底物的新策略(见图2)。该策略利用活噬菌体展示文库做为E3底物进行筛选。本研究以MDM2为例阐述和验证该策略。通过4次不同方法的筛选,本策略鉴定到MDM2的16个天然潜在底物和许多非天然潜在底物。有些底物可以在不同的实验中重复筛选到。在选出的12个候选底物中,10个在体外泛素化体系中被MDM2泛素化。在进一步的细胞内验证中,本实验验证出叁个MDM2的新底物蛋白——DX42,TP53RK和RPL36a。进一步的研究发现了MDM2促进TP53RK泛素化导致其被蛋白酶体的降解。在本策略中,除了多聚底物之外,还能鉴定到更多的MDM2单泛素化或寡聚泛素化底物。只要某一个E3适合体外泛素化系统,且不泛素化空噬菌体,这一策略就能够推广到该泛素连接酶底物的筛选中。
宋婀莉[3]2007年在《高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的建立及其应用》文中指出●结构域是蛋白质相互作用研究的一个简单高效的入手点在蛋白质组学规模上研究蛋白质相互作用网络是全面了解蛋白质功能、揭示疾病发病机制的有效手段之一。节点蛋白在相互作用网络中占据关键位置,在生命调控机制中发挥重要功能,可作为研究相互作用网络的一个有效突破点。很多蛋白由单个或多个结构域组成;绝大多数蛋白质相互作用是通过相互作用结构域(如PDZ,SH2,WW,SH3等)与其识别模体的结合完成的。深入研究节点蛋白的相互作用结构域,不仅可以了解详细的相互作用分子机制,为蛋白质相互作用的药物研发提供理论基础,而且可以在全蛋白质组水平上发现其所有的潜在配体蛋白,绘制以节点蛋白的相互作用为骨架的蛋白质相互作用网络图,从而系统地揭示蛋白质在复杂体系中的多样功能。本研究中,我们以最重要的蛋白质相互作用结构域之一的PDZ结构域作为入手点,建立了高效研究结构域结合特性的新策略,全面系统地研究了数个PDZ结构域的结合特性,发现了它们潜在的新配体蛋白。研究结果表明,PDZ结构域的结合特性同时具有较强的规律性和一定的多样性。由于我们研究的PDZ在多种组织和细胞结构中均有各种功能的潜在新配体被发现,提示PDZ蛋白在不同的体系中执行不同的功能具有生物化学基础,可能是一个相当普遍的现象。PDZ蛋白潜在的多功能性超过了我们的预期。我们猜想可能许多具有常见蛋白质相互作用结构域的蛋白也会具有超过我们以往估计的配体数量和功能多样性。这个猜想需要更多结构域的系统研究方法和大规模研究才能证实。●高效研究多肽结合结构域(peptide-binding domain)结合特性新策略的提出近年来常用的高通量研究结构域的方法主要有定向肽库(oriented peptidelibrary)、SPOT合成、噬菌体展示(phage display)和酵母双杂交(yeast two-hybrid)等。但是这些传统方法都是针对某一个特定结构域所进行的大规模筛选,相对费时费力。为了适应于在蛋白质组学规模上研究结构域的结合特性、提高研究通量和效率,我们提出了一种高效地验证性筛选目的结构域结合配体文库的新研究策略。先用目的结构域家族中有代表性的成员筛选随机多肽文库,收集得到的阳性克隆构建成一个配体库,其它成员直接验证筛选配体库研究其识别特性。根据验证筛选得到的阳性和阴性结合序列推知识别规律,再以此识别规律在蛋白质数据库中预测潜在的天然配体,最后在酵母双杂交系统中验证并发现新的配体蛋白。如果直接验证筛选配体库得到的阳性配体数量不足以得出某个结构域的识别特性,该结构域就从头筛选随机多肽文库,所获得的新阳性克隆添加到配体库,作为对配体库的补充,可提高以后通过直接验证筛选来研究此类PDZ的效率。另外在验证预测的天然配体时,构建的克隆也添加到配体库中,这也是对配体库的重要补充,这样直接验证筛选就有可能找到新的配体蛋白。验证筛选体系最大的优点是,与传统筛选相比研究效率得到了极大的提高,而且整个体系是动态发展的,配体库会在体系的应用过程中不断得到补充,扩充后的配体库又会进一步提高研究效率。●高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的建立我们首先将验证筛选的研究策略应用于PDZ结构域结合特性的研究。首先,我们收集ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ筛选随机多肽文库得到的阳性克隆,构建成一个初始的配体库。通过验证筛选该配体库快速研究了HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的识别特性。MAGI3 PDZ4等PDZ通过验证筛选没有得到满意的结果,因此从头筛选随机多肽文库研究其结合特性,并将得到的阳性克隆补充到配体库中,作为对配体库的补充和发展。在验证筛选体系建立和初步发展的过程中,我们对上述目的PDZ结构域的结合特性进行了详细的分析。研究结果不仅涵盖了以往大规模研究方法报道的结果,而且还发现了新的PDZ结构域识别特性,即:ZO-1 PDZ3在配体-5位偏好疏水性氨基酸,ZO-1PDZ3、LNX1 PDZ2和MAGI3 PDZ4在配体的0位可选择极性氨基酸,除MAGI3 PDZ4外的五个PDZ在配体-1位都强烈偏好芳香族氨基酸,除ZO-1 PDZ3和MAGI3 PDZ4外的四个PDZ都可识别Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ叁种类型的PDZ配体,HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的选择特异性都呈现出一定的前后氨基酸之间的连锁关系。这些新的PDZ结合特性的揭示,为PDZ结构域的重新定义和分类提供了有价值的信息。同时,我们发现了以此六个目的PDZ结构域为节点的40对新的蛋白质相互作用,为深入研究这些PDZ蛋白的生物学功能提供了重要线索。●高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的应用LNX蛋白是第一个被发现的含有PDZ结构域的RING类型的泛素连接酶E3,但是其PDZ结构域的生物学功能还不清楚。为了揭示LNX PDZ结构域的功能,我们应用已建立的高效验证筛选体系对人类LNX家族的4个蛋白含有的9个PDZ结构域的结合特性和相互作用蛋白进行了系统的研究。LNX1 PDZ1、LNX1 PDZ2、LNX1 PDZ3、LNX2 PDZ2和LNX4 PDZ通过验证筛选和/或随机多肽文库筛选得到的阳性配体在C末端呈现明显的规律,经分析发现这5个PDZ结构域的结合特性有共性但也有显着的不同。同时,我们发现了LNX家族PDZ结构域之间的叁对相互作用,即:LNX1 PDZ1和LNX1 PDZ4、LNX1 PDZ1和LNX2 PDZ4、LNX2 PDZ1和LNX2 PDZ4之间的相互作用。另外,根据总结的LNXPDZ结构域的识别规律,我们在人类蛋白质组水平上发现了新的LNX配体蛋白。这些配体蛋白种类多样且分布广泛,提示LNX可能在多种复杂体系中发挥多样的功能。同时,在PDZ结构域高效验证筛选体系应用的过程中,我们对原PDZ配体库又补充了新的配体,这是对配体库的再次发展,将会使验证筛选体系的高效性在更大规模的PDZ结构域研究中得以体现。●Liddle综合症分子治疗的初步探索Liddle综合症是一种上皮细胞钠离子通道相关的遗传性疾病,是1963年由Liddle等人首先发现的一种常染色体显性、盐敏感型的高血压综合症。Liddle综合症的分子发病机制现已较为明确地认为是上皮钠离子通道(epithelial Na~+ channel,ENaC)的β亚基或γ亚基的胞质侧羧基端的PY模体低频率的点突变或缺失突变,使其与泛素连接酶Nedd4的WW结构域之间的相互作用被打断,导致ENaC不能正常泛素化和降解,因而在质膜上的半寿期延长、活性增加,导致钠离子重吸收的增加,引起Liddle综合症。由于Liddle综合症的发病机制已经研究的比较清楚,而且仅是单基因的突变所致,这为分子治疗提供了可能。我们提出了一种从分子水平上治疗Liddle综合症的设想,即构建一种可识别Liddle病人中ENaC蛋白突变的PY模体的人工泛素连接酶E3,使其结合并降解突变的ENaC蛋白,从而使质膜上ENaC的表达数量和活性恢复到正常水平。而可识别PY突变体的E3,可通过用病人中的PY突变体筛选随机多肽库获得与之结合的随机肽段,然后用其替换PY模体天然配体蛋白Nedd4中的WW结构域,从而得到一个新的人工E3。本论文中,我们以一种Liddle综合症突变体Y620H为诱饵蛋白,通过筛选随机多肽文库获得了一个至少能与两种PY突变体(Y620H和P618L)特异性结合的随机肽段。为下一步的深入研究和探索积累了实验数据。
陈菊祥, 卢亦成, 胡国汉, 孙克华, 骆纯[4]2005年在《人LNX新基因克隆及组织分布和在脑胶质瘤中的表达》文中指出目的探讨人脑胶质瘤相关LNX新基因克隆、组织分布和在不同级别星形细胞瘤中的表达及其参与胶质瘤信号途径的分子机制。方法构建胎脑cDNA文库并测序获得全长LNX新基因;人多组织文库(MTC)为模板研究LNX的正常人体组织分布;应用含13 939种人类基因表达谱芯片检测LNX新基因在脑星形细胞瘤中的表达;Northern杂交验证LNX新基因在不同级别胶质瘤中的表达;酵母双杂交研究与LNX新基因相互作用的蛋白,应用免疫共沉淀方法验证LNX与Numb蛋白和SK IP蛋白的相互作用。结果人胎脑文库中克隆的LNX新基因长约3.7 kb,含1 899 bp开放阅读框,编码632氨基酸蛋白,相对分子质量约70 000,登录号AF237782;LNX新基因在脑、肾和胰腺中表达较高,在心、胎盘、肺、肝、脾、胸腺和前列腺中也有表达;但LNX在胶质瘤组织中表达均降低,与肿瘤发生密切相关;酵母双杂交筛选到LNX新基因与肿瘤Notch信号途径中的Numb和SK IP蛋白有相互作用,免疫共沉淀发现LNX新基因与SK IP蛋白相互作用,可影响Numb的亚细胞定位,从而影响Notch信号途径Numb结合位点。结论表达谱芯片可快速高效锁定与胶质瘤密切相关的基因和寻找肿瘤标志物,LNX新基因与胶质瘤密切相关,通过Notch信号传导途径参与脑胶质瘤发生发展,可成为胶质瘤潜在的治疗靶标。
周剑[5]2014年在《LNX2通过Numb/Notch信号通路调控破骨细胞的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景在人体内骨的内稳态是由骨重建维持的,骨重建包括陈旧的或者受损的骨由破骨细胞清除和成骨细胞生成新骨代替两部分。当骨重建失去平衡时会导致骨量减少,如骨质疏松,风湿性关节炎,Paget病等;或者骨量紊乱增加,形成骨硬化症等。破骨细胞和成骨细胞活性的调节是由全身激素,在骨显微环境中相邻细胞分泌的细胞因子和生长因子等共同完成的。Notch信号通路广泛表达于胚胎和成熟个体组织,是高度保守的信号通路,对于调控胚胎发育、成熟组织器官稳态及免疫细胞发挥功能等方面具有重要作用。Notch信号通路包括Notch配体、受体以及下游信号传导分子及调节分子。Notch受体蛋白经过furin-like蛋白酶,整合素金属蛋白酶(ADAM)和γ-分泌酶多蛋白复合体介导的叁次酶切,释放了具有活性的细胞内区(NICD)。NICD随后进入细胞核,激活CSL介导的Notch信号通路及下游的Hes1基因。在人类和小鼠的基因方面的研究表明,Notch信号通路在骨的生长发育及代谢中扮演着重要的角色。Notch信号通路在诱导分化的早期可以刺激间充质细胞向软骨分化,但是在分化的后期Notch信号通路却抑制了进一步的分化,在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化早期,Notch信号可以维持干细胞处于未分化状态。Notch信号通路也可以通过多种方式调节破骨细胞的分化。Notch信号通路既可以直接抑制破骨细胞生成,也可以通过降低成骨细胞分泌M-CSF和RANKL等抑制破骨细胞生成。Notch信号通路对于骨重建的调节作用复杂,具有时效性。Numb是膜相关受体蛋白,是一种细胞命运决定因子,Numb可以招募E3泛素连接酶,介导NICD内吞至溶酶体降解,拮抗Notch信号通路影响不同细胞的发育命运。LNX蛋白(Ligand of Numb-protein X)是第一种被描述的含有PDZ结构的环指-E3泛素连接酶家族成员。LNX作为含有PDZ结构的泛素连接酶,在泛素连接酶和协调信号通路等方面都发挥重要作用。LNX蛋白可以连接泛素和Numb,使其发生蛋白酶依赖性的降解。LNX和Numb在破骨细胞中的表达水平,以及他们是否调节Notch信号通路在破骨细胞中尚未有研究和报道,有待进一步的研究。实验共分叁大部分:第一部分目的:确定LNX在破骨细胞诱导分化过程中的表达水平的变化。方法:采用Rankl体外诱导骨髓单核-巨噬细胞分化的方法生成破骨细胞,并检测破骨细胞活性,用RT-PCR检测LNX基因在诱导形成破骨细胞过程中表达水平。结果:用Rankl体外诱导骨髓单核-巨噬细胞分化的方法可以生成具有骨吸收能力的破骨细胞,随着破骨细胞的分化,LNX1和LNX2基因水平均有上升,而LNX2表达水平明显高于LNX1,有显着性差异。结论:LNX2可能对于破骨细胞分化有重要调节作用。第二部分目的:观察沉默LNX2对于破骨细胞分化和功能的影响;了解LNX2调控破骨细胞分化和功能的可能机制。方法:构建含LNX2 sh RNA的慢病毒,转染骨髓单核-巨噬细胞并诱导向破骨细胞分化,观察沉默LNX2基因后对于破骨细胞分化和功能的影响。用Western Blot,RT-PCR,免疫荧光等研究LNX2相关的Numb和Notch信号通路的改变。结果:沉默LNX2后,破骨细胞的分化及功能被有效抑制,破骨细胞标记物基因和蛋白水平降低;沉默LNX2会使得Numb蛋白水平上升,免疫荧光显示Numb荧光表达量明显升高,在细胞膜及细胞核周围均有大量分布;降低了LNX 2的表达水平同时会降低了NICD 1和NICD 2的表达水平。免疫荧光显示Notch 2荧光表达量明显降低,在细胞核周围只有少量分布且Notch信号通路下游的Hes1基因表达水平有较大水平的降低。结论:LNX2是破骨细胞分化所必需的关键性蛋白;LNX2可能通过Numb和Notch信号通路影响了破骨细胞的分化。第叁部分目的:观察过表达h LNX2对于破骨细胞分化和功能的影响;了解LNX2调控破骨细胞分化和功能的可能机制。方法:构建含人全长LNX2 DNA的逆病毒,转染骨髓单核-巨噬细胞并诱导向破骨细胞分化,观察过表达LNX2基因后对于破骨细胞分化和功能的影响;用Western Blot,RT-PCR等研究Numb蛋白水平的改变。结果:过表达人全长LNX2后,破骨细胞的分化受到部分抑制,但是受抑制程度远低于沉默LNX2时受抑制程度,破骨细胞标记物和蛋白水平部分降低,Numb蛋白表达水平部分上升。结论:过表达人全长LNX2使小鼠Numb水平部分升高,破骨细胞的分化受到影响。总结:沉默LNX2基因影响了Numb水平,抑制了Notch信号通路,影响了破骨细胞的分化,表明LNX2是破骨细胞分化的关键性蛋白。而过表达h LNX2使得Numb水平部分升高,破骨细胞分化部分受抑制,可能还存在其他的机制,需要进一步研究。
窦同海[6]2005年在《Insulin/IGF途径基因共进化分析及人类基因酵母双杂结果的共进化分析》文中指出生物学上的所谓进化或者演化(Evolution)，是指生物在变异、遗传与自然选择作用下的演变发展、物种淘汰和物种产生过程，它是生物重要的基本特征。而关系密切的生物，如花和采粉的动物、寄生虫和寄主、捕食者和被捕者等，一方成为另一方的选择力量，因而在进化上发展了互相适应的特性。这种互相适应进化的现象称为协同进化或共进化(co-evolution)，是进化中的有趣的环节之一。在分子水平，核酸与蛋白质序列的突变通常被认为是中性的，相应发生变化的基因的功能与最终命运决定于其突变以及随机漂变的情况。不过一些功能关联基因的进化则不同于正常的方式。为了维持较好的互作关系以行使其生理功能，它们在特定的时间内相互影响，相互适应，协同变化，这种情况称为分子共进化。分子共进化体现了功能关联的基因所经历的相似进化历程，具体特征可以表现在不同的方面，比如基因组水平、序列水平和表达水平等。分析目标基因的这些共进化特征可以促进相应的基因功能研究。基因组水平的分子共进化特征分析已经在原核生物基因研究中得到一定的应用，而对于高等真核生物，其基因组结构与原核生物有很大不同，相对而言，基于序列信息的量化的分子进化树比较分析显得更为适合。Insulin/IGF(胰岛素/类胰岛素)信号途径存在于不同进化水平的物种中(从酵母到人类)，这个进化保守的途径与许多重要的功能调节有关，比如生长发育、代谢调控、血糖控制等等，最新的研究认为该途径还和寿命长短有关。我们采用量化的分子进化树比较的方法对不同物种中的胰岛素/类胰岛素内分泌调节途径的相关基因进行了共进化分析。所选择的物种包括人、黑猩猩、大小鼠、鸡和鱼等高等真核生物，所分析的基因包括INS、IGF-I、IR，IGF-IR、IRS等各物种共有的该途径关键基因。通过序列收集，进化距离矩阵构建以及进化相关性分析，我们得到了该途径中不同基因间的共进化关系。结果显示一些已知的存在互作关系的蛋白间的共进化关系比较紧密，具体表现在进化相关性很大；而不直接互作的蛋白之间的共进化关系较为松散，具体表现在进化相关性较小；无功能关联关系的途径基因间以及所选择的无互作关系的阴性参照基因与途径基因间的进化相关性则显着较低。同时基于进化相关性，我们对一些功能未知的基因如鱼类中的复制基因，鸡中的可能的IRS基因进行了功能预测分析。以此为基础，我们对人类DUSP18、PP2Ck、LNX这叁个基因进行了类似的共进化分析。这叁个新基因是由本实验室克隆报道，并已经做了酵母双杂交实验来寻找相互作用蛋白。针对DUSP18、PP2Ck、LNX，我们选择了十一个高等真核物种的相关序列，计算了它们与各自的酵母双杂交筛选阳性基因间的共进化相关性。根据有功能关联的基因其共进化相关性较高的原则，我们将酵母双杂阳性基因进行了排序，得到了一些相关性很高的基因，同时按一定阈值排除了一些相关性较低的基因。结合别的已有的功能研究，我们预测了一些可能存在特别的功能关联的基因作为进一步实验的候选目标。
牟一[7]2012年在《PDZ结构域结合中间序列结合特性的研究》文中指出·第一部分研究了PDZ结构域结合中间序列的结合特性蛋白质-蛋白质相互作用在生命活动中广泛存在,主要由蛋白质结构域来高效介导。大规模的蛋白质相互作用可以通过研究结构域的结合特性来实现。PDZ、SH3、WW等结构域通过一个或多个识别“口袋”来识别和结合配体蛋白的一段保守的短肽序列。然而蛋白质相互作用可能比我们现在认识到的复杂,还有很多的相互作用未被研究清楚。就PDZ结构域而言,它通常结合配体蛋白C末端4-5个氨基酸残基,近来研究发现其也能够结合配体蛋白的中间序列,与自身或其他结构域聚合,或与膜上的脂类结合。这些结合方式使蛋白质的相互作用呈现出多样性与复杂性。首先,为了系统地高通量地研究PDZ结构域结合中间序列的结合特性,我们在酵母双杂交系统中构建了中间序列随机八肽文库。文库的构建策略是将所有序列的C末端设计成相同的序列,从而保证PDZ结构域结合的是中间序列。而后,使用文库筛选了24个PDZ结构域,其中包括已知文献报道的能够结合中间序列的PDZ结构域；实验室已经构建好的PDZ结构域和一些能够结合脂类的PDZ结构域。实验表明有14个结构域具有结合中间序列的特性,其中6个结构域未曾被报道。序列具有偏好性,偏好较强的具有一致序列。与C末端序列的结合特性相比,中间序列的结合特性表现出多样性,只有ZO1-PDZ1结构域的中间序列特性与其C末端特性相似。筛选结果也反映出PDZ结构域对于中间序列和C末端序列的偏好性。另外,HtrA2-PDZ的偏好性较弱,没有一致序列,表现为结合疏水多肽。中间序列的筛选结果说明有更多的PDZ结构域可以结合中间序列。此外,应用中间序列的结合特性可以来寻找已知相互作用的结合位点,也可以利用中间序列或一致序列来搜索数据库发掘潜在的天然相互作用蛋白。·第二部分研究了日本血吸虫蛋白GIPC3的分子特征及其PDZ结构域的配体结合特性血吸虫病仍然是一个全球性的严重的公共卫生问题,流行于77个国家和地区,感染者超过2.3亿。依赖于单一药物吡喹酮大规模长期治疗引起对抗药性问题的关注。PDZ结构域蛋白被认为是下一代药物开发的潜在靶点。在本论文的第二部分主要研究日本血吸虫PDZ结构域蛋白SjGIPC3的分子特征及利用随机多肽文库探索其PDZ结构域的结合特性。SjGIPC3是含有单个PDZ结构域的蛋白。多重序列比对分析显示SjGIPC3与其同源物在GH1与PDZ结构域相对保守,但PDZ结构域中的C末端结合环处并不保守,其中的经典的GLGF模体被SFGL替代。进化分析表明日本血吸虫SjGIPC3与吸虫同源物形成一分支,而与其他物种相距较远。分期转录分析显示,SjGIPC3基因在侵入宿主后转录水平显着升高；在雄性成虫的转录水平为最高。在酵母双杂交系统中,我们初步探索了SjGIPC3-PDZ结合C末端序列的结合特性。用SjGIPC3全长蛋白或其PDZ结构域为诱饵蛋白,筛选了本室利用人基因组构建的新型随机多肽文库,实验表明SjGIPC3PDZ结构域主要结合Ⅰ类和Ⅱ类配体,但以结合Ⅰ类配体为主；用SjGIPC3全长蛋白为诱饵筛选文库得到的C末端序列比用PDZ结构域为诱饵得到的序列的规律性更强,提示SjGIPC3蛋白的N端和C端区域可能对PDZ结构域的配体结合特性产生影响。根据PDZ结构域的结合规律,利用本室开发的Tailfit软件预测并在酵母双杂交系统中验证了4个潜在的SjGIPC3的天然配体,其中之一为NMDA受体。
郑丹[8]2009年在《人类LNX调节信号传导和细胞周期的分子机制研究》文中研究指明LNX蛋白(Ligand of Numb-protein X)是最初作为发育过程中细胞命运决定因子Numb的相互作用蛋白而被分离出来。随后研究证实,LNX蛋白包括如下结构：N端的环指结构域(RING finger domain), LDNPAY基序,和C端的4个PDZ结构域。它能作为RING finger类型的泛素连接酶,导致Numb蛋白的泛素化和降解。LNX蛋白是第一个被发现的含有PDZ结构域的RING finger家族E3泛素连接酶成员。近年来的研究证实,LNX蛋白不仅参与信号传导(比如Notch信号通路),而且在肿瘤发生中扮演重要作用。但LNX发挥作用的分子机制仍未完全阐明。LNX包含4个PDZ结构域,这使得它在协调不同细胞信号组件方面发挥重要作用。之前已通过酵母双杂交实验筛选可能与LNX相互作用的蛋白质,其中一个候选蛋白就是RhoC。RhoC蛋白是Ras家族成员之一,它促进肌动蛋白细胞骨架的重新组织,调节细胞形态、附着和运动。我们通过免疫共沉淀实验结果证实LNX能与RhoC相互作用,也证实LNX的第一个PDZ结构域对于LNX和RhoC的结合是不可缺少的。荧光共定位实验显示,当与LNX共转染时,RhoC蛋白改变其细胞亚定位,从全细胞定位改变为细胞核定位。此外,我们还发现过表达LNX对AP-1转录活性有上调作用,而当LNX和RhoC共转染时,AP-1转录活性受到抑制。我们推测LNX和RhoC是大型的蛋白复合物的组成部分,调节AP-1转录活性,也在信号传导过程中发挥重要作用。我们应用流式细胞仪检测发现siRNA介导的LNX基因表达抑制可以导致细胞周期阻滞于G0/G1期。为了进一步解析LNX基因沉默后导致的细胞周期停滞的分子机制,我们应用Illumina microarray技术分析了LNX表达抑制细胞和对照组细胞内全基因组mRNA表达谱的变化,并通过荧光定量PCR实验验证了近30条microarray实验中的细胞周期相关的差异表达的候选基因。结合在线的数据库中关于相关基因功能、信号通路和细胞周期机制的信息,详细的分析了内源性LNX影响细胞周期可能的作用模式和调控网络。综合所有结果,提示LNX表达下调导致的细胞周期G0/G1阻滞和LNX表达下调后导致的β-catenin、MAPK、c-Myc、NF-κB依赖性通路抑制和TGF-β、p53-依赖性通路激活有关。这项研究有助于全面的深入了解内源性LNX蛋白对细胞周期的影响和调控作用；并且为研究LNX的多效性分子生物学功能(比如：脚手架功能和泛素连接酶功能)及在肿瘤发生中的作用提供了新的思路和线索。
玛依拉·阿布都克力木[9]2016年在《胆固醇吸收关键基因Numb与冠心病及血脂水平的关联分析研究》文中研究表明目的:(1)识别胆固醇关键基因变异与疾病的关联研究,为新疆地区汉族、维族、哈族人群心血管疾病高危人群制定和防止疾病最佳治疗方案提供帮助。(2)探讨Numb基因多态性与胆固醇吸收的分子机制研究。(3)探讨新疆汉族、维吾尔族人群Numb基因多态性与冠心病及血脂的相关性研究。方法:(1)收集民族、性别、年龄均匹配的健康患者共349例并根据低密度脂蛋白-胆固醇水平(LDL-C),分极高、极低组,采用多重酶联免疫法PCR的方法,对32条胆固醇相关基因,共635个外显子片段进行高通量二代测序,分析基因变异位点与血脂的关系。(2)采用Numb基因的所有外显子和外显子-内含子连接区域测序的方法,对671例血脂LDL-C极高,极低组患者进行分析,发现Numb基因新的突变位点,利用细胞实验对Numb变异位点与胆固醇吸收的分子机制进行研究。(3)采用病例-对照研究,选择经冠状动脉造影确诊的冠心病患者890例和造影阴性的健康人群对照组786例,利用Taqman技术,对Numb基因多态性进行基因分型以及单体型构建,分析Numb基因标签SNPs和突变位点与冠心病及血脂的关系。结果:(1)本研究利用人类胆固醇关键基因外显子测序的方法对新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族人群进行差异性筛选并筛查获得胆固醇基因表达差异32条。汉族相较于其他两个民族独有的1条差异基因;维吾尔族相较于其他两个民族独有的胆固醇相关基因差异有6条;哈萨克族相较于其他两个民族独有的1条差异基因,说明民族间基因差异表达,对于防治心血管疾病提供了一定的基础。(2)对新疆地区筛选的671例患者中进行Numb基因外显子测序,发现基因编码区的两个非同义突变和八个同义突变,两个非同义突变(A587T和Q533K)均分布在血浆低密度脂蛋白-胆固醇水平极低组。(3)对Numb变异位点进行胆固醇响应、蛋白定位、亲和力及稳定性等实验,进一步在细胞水平上验证两个突变体在胆固醇循环中的作用,发现与野生型相比,Numb A587T和Q533K变异均对胆固醇响应和稳定性检测无明显差别,而细胞定位较少和相关蛋白亲和力的作用减弱。(4)Numb基因标签SNP的位点(rs2108552)与冠心病的发病具有相关性。在新疆汉族总体和男性人群中Numb基因rs2108552的显性模型与冠心病具有关联性,在调整了体质指数(BMI)、甘油叁酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高血压、糖尿病及吸烟等危险因素的影响,rs2108552的显性模型在总体和男性人群中仍存在差异并有统计学意义(总:OR:1.876,95%CI:1.482~1.979,P=0.004;男:OR:1.498,95%CI:1.305~1.815,P=0.006),而在女性人群中差别无统计学意义。在维吾尔族人群中未发现此位点与冠心病具有相关性。另外,Numb基因两个突变位点(A587T和Q533K)在汉族、维吾尔族人群中未发现与冠心病具有相关性。(5)Numb基因3个标签SNPs位点在汉族和维吾尔族人群中共建立5个单体型。在汉族总体、男性人群中,G-G-T单体型对照组中的频率显着高于CAD组(P=0.007,OR=0.616;P=0.013,OR=0.701),而T-C-T单体型在病例组频率显着高于对照组(P=0.002,OR=1.482;P=0.004,OR=1.334),而在女性人群中差别无统计学意义。在维吾尔族人群中,冠心病组和对照组单体型频率未发现差别有统计学意义。(6)在调整性别、年龄、民族、肥胖、吸烟等因素前后rs12435797基因型均与TC水平,rs2108552基因型与TC、LDL-C水平,rs1019075与TC水平具有关联性且差别有统计学意义(均P<0.05)。另外,Numb基因两个突变位点(A587T和Q533K)等位基因与TC、LDL-C、HDL-C具有关联性且差别有统计学意义(均P=0.000)。结论:(1)基因外显子测序结果表明血脂相关基因在民族间有差异表达变化,特别是维吾尔族和哈萨克族;发现与胆固醇吸收关键基因NPC1L1,Numb,SOAT2及基因突变位点。(2)新发现的Numb基因的两个非同义突变A587T和Q533K可能对Numb蛋白胆固醇吸收的功能有影响。(3)Numb基因rs2108552的CC基因型以及叁个单核苷酸多态性的单体型T-C-T可能是汉族男性人群中冠心病发病的危险因素,G-G-T单体型是冠心病发病的保护因素。(4)Numb基因3个SNPs基因型和2个突变位点与一个或两个以上的血脂指标具有关联性且突变型的TC和LDL-C水平较低,而HDL-C水平较高。
石宁[10]2003年在《两种DOK蛋白PTB结构域晶体结构及其相关功能的研究》文中认为dok蛋白是胞质中一类接头蛋白(adaptor)，它可募集、结合特异的信号传递分子，并使其活化，调节信号传导。dok家族蛋白N末端都有一个pleckstrin同源的PH结构域和一个能结合磷酸化酪氨酸的PTB结构域。PH结构域可与磷脂酰肌醇结合，介导与胞膜的相互作用；PTB结构域可结合具有特定磷酸化酪氨酸motif的蛋白序列，是dok蛋白识别上游靶信号的区域；dok蛋白的C末端有一些保守的酪氨酸位点，它们是酪氨酸激酶的潜在靶位点，被磷酸化活化后，可成为许多信号分子的停泊位点，介导形成信号传递复合物，活化下游分子，使细胞产生应答。了解dok蛋白是如何特异地与受体酪氨酸激酶作用的对理解其功能有重要意义。 我们通过规模化测序，从人胎脑cDNA文库中分离克隆了一个新的全长cDNA，编码一分子量36kDa的蛋白质。该基因现命名为dok5。多组织Nothern杂交显示：人源dok5在骨骼肌中表达最高，在心脏和大脑中也有表达，而鼠源dok5只特异地表达于脑。dok家族蛋白现已发现dok1—5五个成员，dok1—3特异表达在血液来源细胞，它们对细胞增殖都有负调节作用，其中dok1、2是通过与rasGAP结合抑制MAP激酶通路的；dok4表达广泛；dok5主要在骨骼肌、心脏和大脑中表达，不与rasGAP结合，对细胞增殖具正调节作用。我们克隆表达了dok1和dok5蛋白，并表达纯化了dok1和dok5的PTB结构域。经Biacore实验发现，dok1 PTB结构域可特异识别来自Ret的磷酸肽，但不与Shc和Irs1 PTB识别的TrkA和IL-4R磷酸肽结合；dok5 PTB结构域与叁种磷酸肽都不结合。为了发现dok PTB结构域识别底物的结构基础，我们用纯化的dok1和dok5的PTB结构域重组蛋白得到了各自的蛋白晶体和dok1PTB结构域与Ret磷酸肽的复合物晶体，并用Se原子多波长反常散射法(MAD)成功地解析了它们各自的叁维结构，用分子置换法解析了复合物的结构。dok1和dok5的PTB结构域的晶体结构与胰岛素受体底物(hirs1)很相似，都是由一个紧密的7β片层三明治和一个C末端的长α螺旋组成，Ret磷酸肽的近C端形成一个β转角，结合在dok1PTB结构域C末端的长α螺旋与β片层之间的L型裂缝中。通过分析发现在dok和irs蛋白中都保守的一些氨基酸为识别磷酸化酪氨酸和磷酸肽motif上的疏水残基所必需。一些dok蛋白PTB结构域上特有的残基可能决定了它的底物特异性。这些结构所提供的精确信息为我们进一步深入研究dok蛋白在信号传导中的作用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 人类Numb配体蛋白基因LNX的克隆和功能研究[D]. 赵炜. 复旦大学. 2002
[2]. 两种高效研究泛素连接酶底物的新策略[D]. 郭正光. 北京协和医学院. 2012
[3]. 高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的建立及其应用[D]. 宋婀莉. 中国协和医科大学. 2007
[4]. 人LNX新基因克隆及组织分布和在脑胶质瘤中的表达[J]. 陈菊祥, 卢亦成, 胡国汉, 孙克华, 骆纯. 中华医学杂志. 2005
[5]. LNX2通过Numb/Notch信号通路调控破骨细胞的机制研究[D]. 周剑. 上海交通大学. 2014
[6]. Insulin/IGF途径基因共进化分析及人类基因酵母双杂结果的共进化分析[D]. 窦同海. 复旦大学. 2005
[7]. PDZ结构域结合中间序列结合特性的研究[D]. 牟一. 北京协和医学院. 2012
[8]. 人类LNX调节信号传导和细胞周期的分子机制研究[D]. 郑丹. 复旦大学. 2009
[9]. 胆固醇吸收关键基因Numb与冠心病及血脂水平的关联分析研究[D]. 玛依拉·阿布都克力木. 新疆医科大学. 2016
[10]. 两种DOK蛋白PTB结构域晶体结构及其相关功能的研究[D]. 石宁. 中国协和医科大学. 2003
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