摘要：本项目采用不同溶解度的溶媒做为辅料，分别溶解十三种不同氨基酸组成的多肽（MP003），并按一定浓度比例配制成制剂，用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行分析方法验证及稳定性考察，从而确定准确度，精密度，重现性良好的检测大分子混合多肽的分析方法。
关键词：NASH；方法学验证；稳定性考察
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）已成为肝硬化，肝细胞癌和肝脏移植越来越重要的原因[1]。如今，NASH已经成为危害人类健康的杀手，针对于该疾病的治疗方法多有报导，各类创新性药物也在不断研发，不断试验，但截至目前为止，仍没有药物被批准用于治疗该疾病[2]。蛋白质多肽类药物具有特异性好，毒副作用小等特点[3]越来越受到关注和认可。但蛋白质及多肽类药物的吸收有明显的给药途径依赖性，口服给药会被胃酸，消化酶破坏[4]，导致其在体内的活性降低或消失。聚乙二醇（PEG）化是对多肽结构的一种修饰，即增加了多肽的分子量，又降低了肽键受蛋白酶降解的几率，从而增加其活性[5]。目前，一些PEG化的多肽正尝试治疗及诊断NASH疾病，并进入临床前毒理学评价阶段。
毒理学评价旨在通过对不同种属动物给药所产生的毒副作用综合评估并推测药物对接触人群的危险度，确保临床用药安全[6]。而给药制剂配方摸索是前期新药毒理评价不可或缺的一环，药物需要与合适溶媒混合，配制成混悬液或溶液等剂型，再通过设定不同的给药期限（急性毒性，长期毒性[7]等）与给药剂量最终用于动物给药，评估药物的毒性。合适的溶媒的选择对药物在动物体内吸收、分布、代谢和排泄也有重要的影响。此外，给药制剂分析方法开发与验证则是首先配制受试物与不同辅料、溶媒不同配比混合而成的制剂，考察其溶解性，均一性，稳定性，以及分析方法的专属性，样品浓度检测的准确性和重现性等。方法验证会为毒理试验给药剂量与浓度设定提供支持，并通过与不同辅料[8]的搭配，确立所配制剂能达到的最低与最高浓度，为毒理实验研究确立较宽范围的浓度窗，支持多样化给药剂量的设定，同时建立稳定的制剂储存条件以支持不同给药期限的毒理实验的开展。一般在毒理实验给药前，须完成给药制剂分析方法学验证[9]，为后期的毒理学研宄提供依据。
本文将针对NASH治疗所开发的一款多肽新药（MP003）进行制剂分析方法学开发及验证。MP003是由26-30个氨基酸组成的多肽，其半胱氨酸上经PEG化修饰而得。而根据氨基酸排列顺序的不同，研究对象包含13个不同的多肽序列，我们将采用不同溶解度的溶媒做为辅料，分别溶解13种多肽，并按一定浓度比例配制成制剂，用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行分析方法验证及稳定性考察，确定准确度，精密度，重现性良好的检测大分子混合多肽的分析方法，为毒理学研究提供实验数据和参考。
1实验材料
1.1试剂
PBS，pH7.4 （SeraCare），氢氧化钠（Sigma-Aldrich），二甲基亚砜（Sigma-Aldrich），生理盐水（辰欣药业股份有限公司），超纯水（密理博），乙腈（色谱级，Thermo Fisher），三氟乙酸（色谱级，TEDIA）
对照品：13个多肽对照品（P-001、P-002、P-003、P-004、P-005、P-006、P-007、P-008、P-009、P-010、P-011和P-012）都是由26-30个氨基酸按照不同序列组成，半胱氨酸上经PEG化修饰。纯度分别为：P-001 (91.5%)，P-002 (90.0%)，P-003(93.5%)，P-004 (92.5%)，P-005 (95.0%)，P-006 (95.7%)，P-007 (90.8%)，P-008 (91.4%)，P-009 (98.1%)，P-010 (97.8%)，P-011 (91.6%)，P-012 (97.6%) ，P-013 (95.4%)，冷冻保存，生产商为上海睿铂赛生物科技有限公司（中国，上海市漕河泾开发区宜山路1728号燎申宜山大厦305）
1.2实验仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪（配备紫外检测器），BRANSON5510超声波清洗仪，XS205型电子分析天平（METTLER TOLEDO，d=0.01mg），IKA GENIUS 3涡旋仪，Fisher Scientific ISO temp磁力搅拌器，生物安全柜，多通道重复移液器（Appendorf），容量瓶（具备A级检定证书）
1.3色谱条件
色谱柱：Agilent PLRP-S 300A HPLC (8µm4. 6×250 mm)，柱温30°C，进样盘温度 4°C，流动相：A： 0.1%三氟乙酸水溶液，B: 0.1%三氟乙酸乙腈溶液，检测波长220 nm，流速1.0 mL·min-1，进样量20 µL。
1.4溶媒制备
溶媒1：100mL 10×PBS与900mL超纯水混合。
溶媒2：100µL 1mol/L 氢氧化钠与100mL溶媒1混合。
溶媒3：DMSO。
溶媒4：生理盐水
1.5制剂制备
高浓度制剂储备液制备：精密称量41.81 mg P001，42.55 mg P002，40.7 mg P003，41.81 mg P004，39.96 mg P005，39.59 mg P006，25.08 mg P007，41.81 mg P008，39.22 mg P009，38.85 mg P010，38.08 mg P011，38.85 mg P012，其中，P001，P002，P003，P004，P005，P010用溶媒1定容至1mL；P006用DMSO定容到1mL；P007，P012用溶媒2定容至1mL；P011，P013用生理盐水定容至1mL。超声，搅拌溶解。
高浓度制剂制备：按如下次序转移0.5mL储备液至一玻璃瓶中，加入下一溶剂前必须确保之前两种储备液已经混匀。次序：P001，P002，P003，P004，P005，P010，P012，P011，P008，P013，最后将P006缓慢加入混合溶剂，得到MP-003高浓度制剂。
低浓度储备液及制剂制备：用高浓度制剂储备液稀释，得低浓度制剂储备液，按相同的配制方法混合可得MP003低浓度制剂。
1.6方法考察样品制备
样品稀释液：800 mL超纯水与200 mL乙腈混合。
对照品储备液：精密称量P001至P013各约20 mg至20mL容量瓶中，加入样
品稀释液，定容，超声溶解。另精密量取1 mL各组分储备液至玻璃容器中，涡
旋混匀。即得多肽混合物（MP003）标准品储备液。
系统适用性样品：用移液枪准确量取0.6 mL对照品储备液至10mL容量瓶中，用样品稀释液定容，涡旋混匀，转移部分至进样瓶。
准确度与精密度样品：平行取6份1mL MP003制剂高浓度样本和6份1mL MP003制剂低浓度样本，分别用样品稀释液稀释100倍和500倍，涡旋混匀后所有样本转移适量至进样瓶。
制剂稳定性样品：取6份1mL MP003制剂高浓度样本和6份1mL MP003制剂低浓度样本，储存于室温（15 至 30°C）条件下保存，另取6份1mL MP003制剂高浓度样本和6份1mL MP003制剂低浓度样本于冷藏（2 至 8°C）条件保存。
工作标准液稳定性样品：配制低浓度工作标准溶液与高浓度工作标准溶液，转移至进样瓶中于冷藏（2 至 8°C）条件下保存。
样品稀释液稳定性样品：将配制好的MP003制剂高浓度样本稀释后溶液与MP003制剂低浓度样本稀释后溶液，转移至进样瓶中于冷藏（2 至 8°C）条件下保存。
2实验方法与结果
2.1系统适用性试验
多肽新药MP003的13个多肽样品由于氨基酸组成相同，只是其中个别氨基酸排列顺序不同，在RPLC中用梯度分析，13个多肽在同一时间出峰（见图1）。将系统适用性样本放入高效液相色谱仪进样盘中进样，对称性为0.91，理论塔板数为6124。系统充分平衡后，重复进样三针，RSD为1.9%，批量进样，在不少于十二针样品之间插入系统适用性样本进样，总RSD为1.7%。
2.2专属性试验
实验考查了溶媒空白和样品稀释液空白对分离的影响。
将62.5 mL溶媒1，18.75mL 溶媒2,6.25 mL DMSO和12.5mL的生理盐水加入到烧杯中，搅拌混匀。取0.5mL至50mL容量瓶中，用样品稀释液定容，混匀后取适量至进样瓶中；另将样品稀释液取适量至进样瓶中。将两份样品放入高效液相色谱仪进样盘中进样。受试物保留时间处无干扰峰。
2.3线性和最低定量限
将对照品储备液用样品稀释液稀释成20，40，60，80，100 µg/mL 线性浓度标准溶液。以标准溶液各线性浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y= 67.608X－0.1543，相关系数r=0.99982；结果表明MP003稀释在20%乙腈水溶液浓度范围为20～100 µg/mL内线性关系良好，满足测定要求。
将20 µg/mL的对照溶液做为最低定量限于高效液相色谱仪进样，信噪比（S/N）为270.4。
2.4准确度和精密度试验
将低浓度准确度/精密度样本和高浓度准确度/精密度样本放入HPLC进样盘中进样。用标准曲线定量最终准确度与精密度结果见下表。
试验结果表明：MB003低浓度制剂平均回收率为100.0%，相对标准偏差为2.8%，MB003高浓度制剂平均回收率为99.0%，相对标准偏差为1.5%，准确度和精密度结果良好，满足制剂检测要求。
2.5稳定性试验
对照品储备液稳定性：取两份0.6mL对照品储备液样品，一份当天稀释后进样，另一份冷藏条件下储存，10天后稀释进样。结果见下表。
对照品储备液稳定性样品浓度与初始零点样品浓度比值为101.9%，储备液稳定性良好。
2.5.1样品稀释液稳定性：从低浓度制剂和高浓度制剂稀释后的样品溶液中各取两份样品，一份当天进样，另一份冷藏条件下储存，24小时后进样。
低浓度制剂样品稀释液浓度与初始零点样品浓度比值为96.1%，高浓度制剂样品稀释液浓度与初始零点样品浓度比值为95.0%，结果表明，6 mg/mL至36mg/mL浓度区间内制剂样品稀释液稳定性良好。
2.5.2制剂稳定性：从低浓度制剂和高浓度制剂中各取三个样品组，每个样品组共3×1mL份样品，一个样品组室温冷藏条件下储存，24小时后进样。一个样品组冷藏条件下储存，5天后进样。一个样品组冷藏条件下储存，7天后进样。结果满足要求，见下表。
给药制剂在6.0mg/mL至36mg/mL浓度范围内室温条件下可储存24小时，冷藏条件下可储存7天。
3结果讨论
MB003是由多个多肽按一定浓度比例混合发挥治疗作用，故本文基于临床的多肽组分配比对依此配制的高低浓度动物给药制剂进行系统的方法学验证，结果表明该方法准确度，精密度良好，灵敏度，系统适用性均可满足要求，适用于后续毒理试验该浓度窗下给药制剂的浓度检测。
4参考文献
[1] 许炎煌，范建高，非酒精性脂肪性肝炎的药物治疗现状与对策[J]，国际消化病病杂志，2019，39（1）：4-8
[2]李静，唐洁婷，茅益民，非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎治疗的现状与未来[J]，中国肝脏病杂志，2018，23（9）：756-759
[3]奚涛，聚焦蛋白质与多肽类药物，药学进展，2015，39（9）：641
[4]杨梦雪，蛋白质和多肽药物稳定性研究进展[J]，当代化工研究，2017，11：133-134
[5]姚金凤，白露，宋亚芳，薛明，多肽类药物代谢研究进展[J]，中国药理学通报，2013，29（7）：895-898
[6]庄镇华，对新药临床前毒理学评价的一些看法和建议，第九届制药工业药理学术交流会：19-20
[7]张冬梅，刘延珍，曲宝恩，新药安全性评价指导原则中有关毒理学问题的实践与思考[J]，食品与药品，2013，15（4）：260-261
[8]邓家桂，李蓓芸，新药开发中的药物毒理学与药理学[J]，长江大学学报，2013，10（33）：154-156
[9]贾瑞，杨梿，给药制剂分析工作中色谱方法的建立，2015年（第五届）药物毒理学年会论文集，2015，6：267-268
论文作者:1.卢长亮 2.闫超,, 王彦*
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第13期
论文发表时间:2019/9/4
标签：制剂论文; 样品论文; 多肽论文; 溶媒论文; 稀释液论文; 浓度论文; 给药论文; 《医师在线（学术版）》2019年第13期论文;