（浙江中医药大学附属第一医院全科医学科 浙江 杭州 310019）
【摘要】目的：探讨高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein,HMGB1)在促使人肾系膜细胞(human renal mesangial cell, HRMCs)增殖及分泌纤维化相关因子中的作用。方法：用不同浓度梯度的重组HMGB1刺激体外培养的人肾系膜细胞，以CCK-8测定人人肾系膜细胞增殖情况，以ELISA方法检测培养上清液中纤维化相关因子TGF-β1的分泌量，以real-time PCR法测定细胞周期蛋白cyclinD、PNCA蛋白的表达。结果：一定浓度的HMGB1可刺激人肾小球系膜细胞的增殖，细胞内细胞周期蛋白cyclinD、PNCA基因表达增加，细胞培养上清液中TGF-β1浓度增高。结论：HMGB1通过刺激人肾小球系膜细胞增殖并分泌TGF-β1参与了肾脏纤维化过程。
【关键词】高迁移率族蛋白1；人系膜细胞；纤维化；TGF-β1；增殖；细胞因子
【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）36-0023-03
Effect rHGMB1 on proliferation of human renal mesangial cells and secretion of fibrosis-related cytokines.
Zhou Jianguang,Chen Yu.
Department of General Medicine, The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310019, China.
【Abstract】Objective To investigate the role of HMGB1 in inducing human renal mesangial cells (HMCs) to proliferate and secret fibrosis-related cytokines. Methods Recombinant protein HMGB1 (rHMGB1) was incubated with HMCs and then proliferation assay was carried out with CCK-8; cyclinD and PCNA genes were determined with real time PCR; supernate of cultured HRMCs with rHMGB1 was examined for detection of TGF-β1 with ELISA method. Results HMGB1 promoted proliferation of HRMCs; HMGB1 increased expression of cyclinD and PCNA genes involving cell proliferation; rHMGB1 increased secretion of TGF-β1 in supernate of cultured HMCs. Conclusion rHMGB1 was involved in fibrosis of kidney by inducing HRMCs to proliferate and secret fibrosis-related cytokines.
【Key words】HMGB1; Human renal mesangial cells; Fibrosis; Cytokines; Proliferation; TGF-β1
肾脏纤维化是多种疾病导致肾功能衰竭的共同通路。肾脏系膜细胞的增殖，纤维化相关因子对肾脏固有细胞的刺激，是肾脏纤维化的两个重要因素。慢性的炎症反应又是导致肾脏纤维化的另一重要因素。高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein, HMGB1)是晚期炎症因子，可诱发和促进炎症反应，也和多个脏器的纤维化有关。狼疮性肾炎的主要病理表现为增生性肾小球肾炎。我们在前期狼疮小鼠的研究中发现，系膜增生明显的小鼠肾脏组织HMGB1表达明显升高。据此推测HMGB1可能促进人肾系膜细胞的增殖，后者分泌纤维化相关因子，促使肾脏纤维化的进程。本实验拟通过体外细胞学实验观察重组HMGB1对人肾系膜细胞增殖和纤维化相关因子分泌的影响。
1.材料和方法
1.1 材料和试剂
CCK-8试剂盒购买自江苏碧云天生物有限公司，逆转录试剂盒以及Real time-PCR试剂盒购自TAKARA公司。ELISA试剂盒（TGFbeta1）购自RD公司。人肾系膜细胞株购自上海信裕生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 人肾系膜细胞株，于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液、5%CO2、37℃的孵箱中传代培养。生长至80%融合时，饥饿培养24小时，使细胞同步。按照处理因素不同进行分组：加入低中高不同浓度（据预实验）的HMGB1刺激后进行下一步实验，设置空白对照组。
1.2.2 CKK-8检测细胞增殖 培养于96孔培养板的经过相关因素处理的系膜细胞，每孔加入10μl CCK-8，放置于孵箱中2小时后，置于分光光密度仪570nm读取吸光度。每个浓度设置5个复孔，重复实验3次。
1.2.3用ELISA方法检测培养上清液中的纤维化相关因子 购买TGFβ1的ELISA试剂盒，留取经相关因素处理的系膜细胞培养上清液，按照试剂盒步骤检测相关因子。
1.2.4 Real time PCR法检测cyclin D、PCNA基因表达水平经相关因素处理的系膜细胞，用1ml Trizol总RNA提取试剂盒提取总RNA。取2μg提取的总RNA，用TAKARA试剂盒逆转录为cDNA，并进行Real time PCR检测。cyclin D的引物序列为5’-GGATGCTGGAGGTCTGCGA-3’(正向)5’-AGAGGCCACGAACATGCAAG-3’(反向),PCNA的引物序列5’-CGCGGATCCATGTTCGAGGCGCGCCTG-3’(正向)，5’-CCGCTCGAGCTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC-3’(反向)。
1.3 统计学处理
使用SPSS19统计软件进行分析，组间差异用t检验，P<0.05提示具有统计学意义。
2.结果
2.1 高浓度HMGB1能够显著促进人系膜细胞HMCs增殖
我们将HMC细胞培养在不同浓度的HMGB1培养基内，观察期48h后细胞增殖情况。HMGB1浓度分比为0ng、20ng、50ng、100ng和500ng。利用MTT法检测，我们发现48h后，随着HMGB1浓度增加，细胞的数量随之增加20ng、50ng、100ng和500ng依次增加，同时相互之间差别显著（P<0.05），见图1。
Fig.1 Proliferation of HMCs with different concentration of rHMGB1
图1 不同浓度的rHMGB1促进HMCs细胞增殖
2.2 HMGB1增加细胞增殖相关基因PCNA和cyclin D的表达
利用real time PCR法，我们检测PCNA和cyclin D的mRNA在不同浓度rHMBG1处理后的表达情况。
如图2和3所示，rHGMB1可以上调PCNA和cyclin D mRNA的表达（GB200），和空白对照组（con）相比具有统计学意义(P<0.05)
Fig.4 Level of TGFβ1 in supernate of cultured HMCs stimulated by rHMGB1
图4 TGFβ1在培养上清中的表达水平随着rHMGB1浓度增加而升高
3.讨论
在本研究中，我们以人系膜细胞为模型，HMGB1为刺激因子，研究HMGB1在肾脏纤维化中的作用。我们发现经过重组HMGB1的刺激，HMCs增生，细胞内增殖相关基因PCNA和cyclin D基因的表达也增加，同时细胞培养上清液中TGF-β1表达水平随着HMGB1增加而增加。
各种肾脏疾病的终末表现几乎都是肾脏纤维化。肾小球系膜细胞的增殖，纤维化相关因子对肾脏固有细胞的刺激，是肾脏纤维化的两个重要因素。肾小球系膜细胞增生及基质增多是多种类型肾小球疾病常见而又突出的病理形态学特征。系膜细胞是多种细胞因子的分泌源，同时又是多种细胞因子作用的主要靶细胞。在病理情况下，系膜细胞可通过自分泌或旁分泌形式释放多种细胞因子，使细胞外基质产生增加，而某些高浓度的细胞因子又反过来促进系膜细胞的增殖，进而加重肾小球的损害[1]。系膜细胞是分泌产生细胞外基质的主要细胞之一，而系膜基质聚集则是肾小球纤维化甚至硬化的关键。
在前期研究中我们发现HMGB1在系膜细胞增生明显的狼疮鼠肾脏组织中高表达，在本研究中我们又发现rHMGB1可刺激体外HMCs的增生，并提高细胞周期相关基因的表达，提示HMGB1可能通过刺激HMCs的增生参与了肾脏的纤维化过程。
越来越多的研究表明，纤维化相关细胞因子在肾脏纤维化发展过程中起重要作用。其中研究最多的致纤维化细胞因子是转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），TGF-β1是一个独立的、关键的致纤维化因子[2]，它能够刺激系膜细胞、间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞转分化而成的成纤维细胞增殖并分泌细胞外基质[3]。TGF-β1/Smad信号途径是目前研究最为透彻的致肾纤维化途径[4]。通过阻断TGF-β1/Smad信号途径可以抑制系膜细胞的增生，延缓肾小球纤维化[5]。TGF-β1是直接或间接整合其他多种纤维化因素的共同途径[2]。我们在本研究中发现HMCs培养上清液中的TGF-1的浓度随着加入HMGB1浓度的增加而升高，提示HMGB1可促进HMCs分泌TGF-β1而参与肾脏纤维化过程。
高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)是20世纪70年代发现的存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)中迁移速度快而得名。HMGB-1传统角色是非组蛋白染色体结合蛋白。在核内，HMGB-1参与核小体的构建和稳定、协助基因的转录，调节类固醇受体活性。1999年，Wang等人发现了核外HMGB-1的重要致炎作用[6]。大量体内外研究表明，HMGB1作为晚期促炎因子在炎症过程中具有潜在的中心作用，这使HMGB1成为抗炎治疗的新靶向分子，尤其是在慢性持续性炎症过程中发挥了重要作用。而大部分非感染性肾脏疾病均表现为慢性持续性炎症，晚期炎症介质在其中发挥了重要作用。HMGB1通过TLR4信号传导途径激活炎症反应和免疫反应，导致肾脏的缺血再灌注损伤[7]，若能中和HMGB1的细胞外释放，则损伤可以减轻[8]。慢性炎症过程又是导致纤维化的重要因素之一。HMGB1参与了多个脏器的纤维化过程，如肺部[9]、肝脏[10]、心脏[11]和肾脏[12,13]。HMGB1在肾脏疾病中的致纤维化作用，在以往的研究主要集中在肾小管和间质：HMGB1可以促进肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子和TGFβ[14]，也可以通过改变巨噬细胞的多态性而加速肾小管间质的纤维化过程[13]。
而在我们的研究中则发现HMGB1可以促进人系膜细胞的增殖，并分泌纤维化相关因子。因此HMGB1在慢性肾脏病中，不仅仅是一个募集炎症细胞至肾小球使炎症持续存在的促炎因子，也可能是一个促肾脏纤维化的分子。HMGB1致肾脏纤维化的具体机制值得进一步探索。
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基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LQ13H100004）
通讯作者：周健光，E-mail:zhoujian-guang@163.com
论文作者:周健光（通讯作者）,陈瑜
论文发表刊物:《医药前沿》2017年12月第36期
论文发表时间:2018/3/20
标签：细胞论文; 肾脏论文; 因子论文; 肾小球论文; 浓度论文; 炎症论文; 细胞因子论文; 《医药前沿》2017年12月第36期论文;