张译文 徐明研*
（牡丹江医学院附属红旗医院；黑龙江牡丹江157000）
【摘要】目的讨论：探讨尼古丁对β-淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡的影响。方法：本实验是将小胶质细胞培养后分组、为正常对照组、Aβ组、尼古丁组、Aβ+尼古丁组。24h后通过MTT台盼蓝计数，Hoechst染色的方法，检测小胶质细胞加入不同剂量尼古丁后，小细胞增殖存活的情况。结果：Aβ能激活小胶质细胞凋亡，但尼古丁能明显抑制Aβ诱导的小胶质细胞凋亡，对小胶质细胞产生保护作用。结论：1.β-淀粉样蛋白促进小胶质细胞凋亡；2.尼古丁抑制β-淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡；
关键词：小胶质细胞；β—淀粉样蛋白；尼古丁；α-7 nAChRs；
小胶质细胞在神经系统中发挥重要的作用，在神经系统中分布广泛。其技能介导吞噬功能，吞噬如β-淀粉样蛋白等有害的炎症沉积物，又能分泌炎症因子，促进炎症反应。且越来越多的研究表明，小胶质细胞介导的炎症在许多与年龄相关的退行性神经疾病中发挥重要的作用，如帕金森病，阿尔兹海默病等。且认为尼古丁受体α-7 nAChRs的激活为小胶质细胞发挥作用有很大的关系，本课题主要检测尼古丁受体对小胶质细胞有保护作用。
1.材料与方法
1.1材料
Nicotine(Sigma), DMEM(GIBCO), MTT Solution（Sigma）,DMSO(Sigma).BV-2小胶质细胞系。96孔板，75ml细胞培养瓶，.025%胰酶，PBS缓冲液（自配），尼古丁，β-淀粉样蛋白，台盼蓝，Hoechst 33258荧光染色试剂，二甲基亚砜，无水酒精，冰醋酸，37℃水浴锅。
1.2方法
小胶质细胞系传代后，种植在96孔板，培养24h，小胶质细胞形成单层细胞后，观察生长良好的细胞开始加药。实验分为5组，第一组为对照组，第二组为0.2umol/L尼古丁组，第三组为1umol/LAβ组，第四组为5umol/L尼古丁加Aβ组，第五组为10umol/Lα-7 nAChRs组。取生长良好的小胶质细胞，调整浓度后，接种与96孔板中。每孔置37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，待细胞贴壁后轻轻吸出上清，通过MTT、台盼蓝计数，Hoechst染色的方法，进行计数。（重复三次）。
1.3统计学处理
所有统计分析均用SPSS 16.0统计软件分析。数据均采用均数士标准差表示，，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA )，方差不齐时用Welch法。组间两两比较时，若方差齐性，则采用最小显著性差异法(LSD法);若方差不齐，则采用Dunnett' T3方法。P<0.05表示差异具有显著性意义，P<0.01表示差异具有非常显著性意义。
2.实验结果
2.1 Aβ对小胶质细胞凋亡的影响
加入不同浓度的Aβ，24h后，发现与对照组比较（见图1），浓度5um时，凋亡最为严重（见图2）。
图2 Aβ显著增加小胶质细胞的凋亡比率
2.2尼古丁对Aβ促进小胶质细胞凋亡的影响
加入不同浓度的尼古丁和Aβ，24h后发现小胶质细胞数目减少明显减轻，(图3)。进一步观察Aβ和尼古丁对小胶质细胞凋亡的影响。24h后，发现与对照组比较，发现5umAβ的细胞凋亡明显增多。与Aβ单独作用比较，发现有尼古丁作用与小胶质细胞凋亡明显减少（见图4）。
为探讨尼古丁减轻Aβ促进小胶质细胞凋亡的作用是否通过α7-N型乙酰胆碱受体实现，我们在24孔细胞培养板培养的小胶质细胞，加入α-银环蛇毒、尼古丁和Aβ 24 h小时后，通过Hoechst 33258荧光染色检测凋亡，发现α-银环蛇毒可阻断尼古丁对Aβ诱导体外培养小胶质细胞凋亡的抑制作用（图6）。
图6 α-银环蛇毒阻断尼古丁减轻Aβ促进小胶质细胞凋亡的作用。小胶质细胞转入24孔细胞培养板培养。分别或同时加入α-银环蛇毒 10 nM、尼古丁10uM、β-淀粉样蛋白10 uM，细胞固定染色做免疫荧光照相并计数。A，对照；B，单独加入β-淀粉样蛋白10 uM ；C，入α-银环蛇毒 10 nM、尼古丁10uM；D，入α-银环蛇毒 10 nM、尼古丁10uM、β-淀粉样蛋白10 uM。
3.讨 论
阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄有关的慢性神经元进行性丢失和认知障碍中枢神经退行性疾病[7]。病理改变为Aβ沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等[8]。各种发病机制假说中Aβ级联学说占主要地位，该学说认为AD患者可能是由于淀粉样蛋白前体基因和早老素基因等的突变，导致Aβ异常分泌和产生过多，在脑组织内沉积，对周围的突触和神经元具有毒性作用，可破坏突触膜，最终引起神经细胞死亡[9]。Aβ沉积导致AD的病理变化，是AD发病的核心环节。减少Aβ的形成，抑制Aβ的沉积，是预防和治疗AD的根本途径[10]。
为了探讨尼古丁在小胶质细胞炎性反应中的作用，本实验首先观察Aβ对小胶质细胞作用，24h后发现浓度5um时，小胶质细胞凋亡最为严重。加入不同浓度的尼古丁和Aβ，24h后，发现尼古丁减轻Aβ加重小胶质细胞凋亡的作用。将尼古丁和Aβ与小胶质细胞共同培养，用尼古丁竞争性抑制，小胶质细胞表面的尼古丁受体，抑制小胶质细胞的活化，降低炎症反应，从而对小胶质细胞凋亡起到保护作用。在炎症反应的过程中，尼古丁通过α7尼古丁型乙酰胆碱能受体的作用，启动“胆碱能抗炎途径”抑制促炎性细胞因子基因的表达，减少炎性因子的释放，从而发挥抗炎的作用。
综上所诉：.β-淀粉样蛋白促进小胶质细胞凋亡；尼古丁抑制β-淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡。α-7 nAChRs阻断剂拮抗尼古丁抑制β-淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡的作用。因此，尼古丁通过α-7 nAChRs抑制β-淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡作用。此实验能够开创治疗与研究的新思路，更能够为临床新药治疗靶点提供实验依据。
参 考 文 献
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基金项目：国家自然科学基金面上项目（81871041，81371463）；黑龙江省科学基金面上项目（H2017076)
作者简介：张译文（1988--），女，硕士研究生；通讯作者:*徐明研，xumingyan0826@qq.com
论文作者:张译文,徐明研*
论文发表刊物:《医师在线》2019年5月9期
论文发表时间:2019/9/23
标签：胶质论文; 尼古丁论文; 细胞论文; 凋亡论文; 淀粉论文; 蛋白论文; 作用论文; 《医师在线》2019年5月9期论文;