刘东[1]2003年在《S—受体激酶结合蛋白基因的克隆与序列分析及其作用机制探讨》文中研究表明芸薹属植物(Brassica)是我国栽培面积最大，产量最高的一类蔬菜与油料作物，在我国蔬菜和油料生产和供应中占有极其重要的地位，芸薹属作物也是杂种优势利用最为普遍的一类作物，其自交不亲和性的分子机理和雄性不育系的选育及其应用基础的研究深受人们重视。本文通过PCR和RT-PCR等一系列分子生物学方法克隆了芸薹属植物中的甘蓝和油菜自交不亲和信号传导过程中SRK底物蛋白基因ARC1、THL1和THL2，并使用各种相关生物信息学软件对SRK底物蛋白基因序列进行了分析，然后在Internet网上利用在线软件对蛋白质的结构和功能进行了预测和探讨，以期为芸薹属植物自交不亲和性的分子机理的研究提供新的内容。主要研究结果如下： 1．以甘蓝和油菜为材料，通过各种提取方法的比较分析，我们对提取植物基因组DNA和总RNA的CTAB法进行了改良，并取得了很理想的效果。 2．以甘蓝(200110197)和油菜(Y578-2)自交不亲和系的植株为材料，提取幼苗中的gDNA及花蕾期的柱头、子房、花瓣、叶片、根的mRNA，并对mRNA进行反转录合成cDNA，然后分别以gDNA与cDNA为模板扩增ARC1蛋白编码序列。将从gDNA与柱头cDNA中扩增出的产物测序。序列同源分析表明：在甘蓝中克隆的ARC1Boler基因与油菜的ARC1基因序列的同源性为94％。gDNA和cDNA的扩增产物的测序结果表明，在甘蓝中，ARC1蛋白编码序列只有一个单一的开放阅读框，无内含子存在。氨基酸序列的同源性分析表明，甘蓝的ARC1Boler基因编码的氨基酸序列与油菜和拟南芥的同源性分别为85％和52％。序列分析还表明在ARC1Boler、ARC1和ARC1At基因编码的蛋白质中均存在两种结构，Ubox结构和臂重复结构。这种Ubox结构均位于氨基酸序列的中间区域，这个区域有可能是蛋白质发生二聚化的区域或下一级组分的结合的位点。在ARCIBoler和ARC1基因编码的蛋白质C端存在5个臂重复区段，而在ARC1At基因编码的蛋白质中只有1个。这种差异的存在，也可能是ARC1At与ARCIBoler和ARC1功能不同的根本原因。酶切分析也表明在甘蓝和油菜中ARC1蛋白的C端区域有可能是ARC1蛋白的保守结构域。同时在ARC1蛋白质中还发现了拉链结构和多个磷酸化位点，包括cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、糖基化位点等，拉链结构为ARC1蛋白之间及与其它蛋白的相互作用提供了可能，而磷酸化位点是ARC1参与信号传导过程所必需的。在预测的ARC1蛋白质高级结构中，发现的大沟和小沟可能为其它蛋白质的结合提供了结合位点。 3．采用PCR和RT-PCR技术，从甘蓝和油菜基因组DNA和柱头总RNA中扩增获得了719bp的THL1基因和430bp的cDNA序列。序列分析首次表明，克隆的THL1基因有两个内含子，大小分别为207bp和82bp，碱基完全相同，cDNA序列编码117个氨基酸。酶切分析表明在THL1基因序列中各有一个BamHⅠ、HindⅢ、SacⅠ和SalⅠ酶切位点。甘蓝和油菜THL1基因序列有5个碱基的差异，而氨基酸仅有2个氨基酸的变异，同源性达99％。在THL1蛋白的氨基酸序列中发现了一个硫氧还蛋白家族的活性位点(CPPC)和多个磷酸化位点。尽管在自交不亲和中磷酸化位点可能没有发挥作用，但它们有可能参与其 西南农业大学硕士学位论文 摘 要它的生物学反应。 4．采用阿R和RTPCR技术，从甘蓝和油菜基因组和柱头总则A中扩增获得了THLZ基因，基因组中得到的基因大约为900hP和850hP，CDNA大约为477hP。在THLZ基因中首次发现了两个内含于，并且甘蓝和油菜THLZ基因的内含于序列同源性低于ICh，并且大小也有差异。甘蓝和油菜THLZ蛋白质中有5个氨基酸的差异，同源性为97％。酶切分析发现只在油菜 THLZ的第151个碱基处有一个Bgl酶切位点，而在甘蓝中没有发现一个常见的DNA限制性内切酶位点。在THLZ蛋白的氨基酸序列中也发现了一个疏氧还蛋白家族的活性位点和多个磷酸化位点。 5．以 2．5 u g的总 RNA为模板，进行定量 RT－PCR，结果分析表明 AM基因在甘蓝中的表达特异性和油菜一样，均是在花柱柱头表达的。THLI＄1 THLZ基因一样，在甘蓝和油菜各组织中均是组成性表达的。 本文对上述结果进行了必要的分析与讨论，阐明了它们在植物信号传导研究中的意义，并初步提出了下一步深入研究的方向与内容。
王茂广[2]2004年在《S-受体激酶信号传导元件THL2和MOD编码基因的克隆测序及生物信息学初探》文中指出在孢子体型自交不亲和的芸薹属中，已经鉴定出3个主要与S位点紧密连锁的基因，花粉中的配体SCR和柱头中的受体SLG与SRK：另外鉴定出4个不与S位点连锁的基因ARC1、THL1、THL2和MOD，它们被认为是SI反应的下游蛋白质因子，但是对它们的生物学功能了解的还比较少。自交不亲和反应是一种配体和受体相互识别的信号传导过程，在这一过程中，对配体和受体的研究已经取得突破性成果，而对下游的磷酸化蛋白研究相对上游受体来说要缓慢得多，所以对信号传导的下游组分研究显得尤为重要，特别是下游还有许多未分离到的组分，而分离到的组分其功能还不清楚。 本研究以西南农业大学繁育的高度自交不亲和的‘西园4号’甘蓝和‘2001817’油菜为试材，采用生物信息学的方法全面研究和探索性的分析了THL2基因和MOD基因的DNA与cDNA序列，首次从序列数据出发研究这两个编码基因的结构与遗传变异，以及在自交不亲和性信号转导中的作用机理．主要工作和结果如下： 1．THL2基因的克隆与序列分析 提取甘蓝和油菜的基因组DNA和柱头总RNA，采用PCR和RT-PCR技术扩增THL2 DNA和cDNA，对目的带进行回收，克隆并测序。序列分析表明，油菜中THL2 DNA长为888 bp，cDNA为524 bp：甘蓝中THL2 DNA长为879 bp，cDNA为516 bp，在THL2 DNA中首次发现了2个内含子。比较甘蓝和油菜的THL2 DNA，发现在编码区有4处碱基不同，其中有3个碱基的突变造成了氨基酸的变化。用MegAlign程序分析表明油菜与甘蓝中THL2在核苷酸水平上的同源性为96％。氨基酸水平上的同源性分析表明甘蓝THL2与油菜THL2和拟南芥中硫氧还蛋白TRX4同源性较高。分别达到97％和86％，进化分析也表明THL2和TRX4具有较高的亲缘关系。预测的THL2蛋白质高级结构中有一个βαβ结构，并且其与SRK结合的活性位点CPPC位于蛋白质的表面，这为THL2蛋白与SRK激酶结合提供了空间上的基础。 2．MOD基因的克隆与序列分析 以甘蓝和油菜的基因组DNA和柱头总RNA为模板，采用PCR和RT-PCR技术扩增MOD DNA和cDNA，电泳后对目的带进行回收、秃隆、两端验证，测序获得其DNA和cDNA序列。测序西南农业人学硕士学位论文结果表明，人介gD DXA大小为1378 bp，相对于eDNA 853 bp来说多了525 bp，在DNA中首次发现了3个内含子，大小分别为315 bp，123 bp和87 bp。 对甘蓝和油菜的五少口刀cDNA序列进行比较发现，它们之间有31处碱基差异，只有1处造成了氨基酸的变异。利用常见的限制性内切酶酶切分析表明，二者有不同的酶切位点和切点数。氨基酸水平上的同源性分析表明，MOD蛋白与拟南芥中的水孔蛋白PIPlb、PIPI.1、PIPI.3、}，JP一4、PIPI.5的同源性最高，分别达到9叽、9践、9钱、9钱、91%，而与拟南芥中液泡膜上的水孔蛋白TIPZ.l的同源性只有3踢，进化分析也得到了同样的结果。 利用在线蛋白质活性位点预侧分析程序Sca即rosite，首次在MOD蛋白中发现了多种磷酸化位点，包括c心P和cGMP依旗的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激醉C磷酸化位点、酪蛋白激酶H磷酸化位点、N一豆菠酸化位点等常见的激酶磷酸化位点。预侧的高级结构表明MOD蛋自有6个。螺旋二级结构，形成6次跨膜，为MOD履行水孔蛋白的功能奠定了结构基础。3.刀儿2匆初，D基因的表达模式分析提取甘蓝不同组织的总RNA，进行定量RT一PCR分析，结果表明刀泥刃基因和泪叼D基因在各组织中都有表达，都属于组成性表达基因。4.THLZ和MOD的生物信息学特点 利用在线服务器或生物软件研究了THLZ和MOD的生物信息学特点，包括同源性分析、蛋白质的进化关系、蛋白质模体分析以及预测蛋白质高级结构等。
阳晶[3]2008年在《沙田柚花柱自交不亲和相关基因的克隆与鉴定》文中认为本研究以高度自交不亲和的沙田柚(Citrus grandis var. Shatinyu Hort.)为试材,采用抑制性消减杂交技术,分别以沙田柚自交花柱cDNA为检测子,异交花柱cDNA为驱动子,构建了自交花柱正向消减cDNA文库,在沙田柚中克隆了与自交不亲和相关基因的EST。并运用菌液PCR技术、重组质粒提取和酶切相结合的方法对文库进行了筛选,从中随机挑取了部分阳性克隆进行测序。所测序列用NCBI-Blastx和Blastn在线软件分析,通过与Genbank中的序列数据库进行同源性比较,我们找到了一些与沙田柚自交不亲和相关的基因,为进一步阐明沙田柚自交不亲和的分子机理奠定了基础。研究结果如下:蓝白斑筛选实验表明,SSH文库重组率高于95%,共有247个独立克隆;PCR检测和重组质粒酶切结果表明,文库共获得128个阳性克隆,其插入片段的大小分布在0.1-1.0kb之间,主要集中在250-500bp之间;随机挑取的120个阳性克隆的测序结果显示,共获得30条独立的ESTs,其中23条具有明确的功能比对结果,占总数的76.7%。23条ESTs,通过Blastx搜索,找到两类与自交不亲和相关的基因:hect E3泛素连接酶和蛋白激酶表达基因,前者可能通过泛素/26S蛋白酶体途径介导沙田柚自交不亲和反应,后者可能通过蛋白质磷酸化与去磷酸化的细胞信号识别与转导途径介导沙田柚自交不亲和反应;还找到柱头表达蛋白、质膜H+ ATPase、rRNA内含子编码核酸内切酶以及膜关联蛋白表达基因,这些基因有可能为“膜受体”假说提供分子水平上的证据。另7条ESTs,通过Blastn搜索,发现其中两条与已报道的自交不亲和相关基因在核酸水平上有较高的同源性,即编码S1-RNase、S9-RNase的基因,相似度分别达到了88%和89%,这2条ESTs极有可能是决定沙田柚自交不亲和的S-基因。还有两条与泛素/26S蛋白酶体途经相关的基因和一些与自交不亲和信号转导相关的基因,以及与细胞凋亡、通道运输和分子伴侣相关的基因,它们可能直接或间接参与沙田柚的自交不亲和反应。为研究所获得的差异表达基因具有的生物学功能,我们把由Blastx搜索到的蛋白质信息按GO分类系统聚成了9类,根据所占比例的大小顺序排列如下:催化活性、结合类功能、生理学途径、细胞膜成分、分子伴侣、转录调控、调节酶活性、离子运输以及细胞凋亡。这些信息表明沙田柚自交不亲和反应可能是一个复杂的多基因协同作用过程。此外,还发现抗冻蛋白、柑橘腐根病病毒抗性、动力蛋白重链家族蛋白等与植物逆境胁迫和抗病性功能相关或在核酸水平上有较高同源性的基因。这些研究为下步克隆相关基因和阐明沙田柚自交不亲和机理的研究打下了良好基础。
罗兵[4]2011年在《甘蓝SRK-SCR相互作用研究及作用强度与酵母生长关系模型的构建》文中认为自交不亲和性(Self-incompatibility, SI)是植物防止自体受精,促进远缘杂交的一种遗传机制。甘蓝自交不亲和性中,花粉和柱头相互识别特异性受一个带有复等位基因的多态性S位点(S-locus)所控制。在S位点有3个高度多态性基因,即S-受体激酶(S receptor kinase, SRK)编码基因、S-富含半胱氨酸蛋白(S cystine rich,SCR)编码基因和S-糖蛋白(S glycoprotein, SLG)编码基因。其中,SRK和SCR分别为自交不亲和的雌雄决定因子,SLG是SRK识别SCR的辅助受体。受粉时,同一S单倍型的SRK与SCR相互结合导致自交不亲和性的发生。SRK胞外S结构域编码区(eSRK)负责与SCR相互识别,但eSRK与SCR的之间识别强度、识别模体及在此基础上的分子作用机制等目前还不清楚。对此,本研究以高度自交不亲和性结球甘蓝D3、B3、E1、A1、H1、230、240、243、N1和G1为材料,克隆了全部雌决定因子和部分雄性决定因子,利用巢式RT-PCR、酵母双杂交技术深入研究了SRK与SCR相互作用,主要研究内容和结果如下。1.SRK胞外域的克隆及其生物信息学分析采用巢式RT-PCR,以甘蓝D3、B3、E1、A1、H1、230、240、243、N1和G1的柱头和花粉cDNA为模板扩增了甘蓝的SRK胞外域序列(eSRK)。序列分析表明：eSRK D3和eSRK240的cDNA序列皆为1 303bp,分别编码434个氨基酸的蛋白；eSRK230, eSRK243, eSRKE1, eSRKGl和eSRKNl的cDNA序列都为1 309bp,分别编码436个氨基酸的蛋白；eSRK A1, eSRK B3和eSRK H1的cDNA序列皆为1312bp,分别编码437个氨基酸的蛋白。甘蓝eSRK蛋白氨基酸序列呈高度多态性,有叁个高变区,但其中12个半胱氨酸高度保守。生物信息学分析表明,不同材料eSRK的二级结构富含p-折迭和无规则卷曲,其叁级结构皆相似。克隆的eSRK皆含有信号肽,并且都含叁个明显的保守结构域,分别为B-Lectin结构域,SLG结构域以及PAN_APPLE结构域。甘蓝eSRK的进化速度快,不同S单倍型的eSRK遗传分支时间差异大。2.SCR基因的克隆及其生物信息学分析通过SCR信号肽保守氨基酸和mRNA的ploy A区设计引物,利用巢式PCR,以甘蓝cDNA为模板,克隆了3种甘蓝D3、E1和G1的SCR基因的部分cDNA序列,长度分别为319bp、311bp和377bp,包含3'-UTR区。叁者分别编码1个58,58和55个氨基酸的SCR蛋白。D3和E1的SCR分别与SCR3和SCR7的序列一致,而甘蓝G1的SCR为一个新的S单倍型基因。叁者皆是SCR的成熟肽编码区。叁种蛋白的叁维结构近似,都有一个α螺旋和3个β折叠,高变区富含碱性氨基酸。叁者都有潜在的磷酸化位点。在核苷酸和氨基酸水平上,SCRG1与SCRD3的相似性分别为69.5%和63.8%,与SCRE1的相似性分别为53.4%和46.6%。SCRD3与SCRE1间分别有55.7%和48.3%的相似性。G1与D3的SCR在演化过程中分支时间较晚,而二者与E1的SCR在进化上分支时间较早。3.S受体激酶识别SCR的生物信息学分析以S3、S7、S8、S12、S13、S24、S29、S39和S64单倍型eSRK和SCR为材料,利用蛋白质遗传进化图和作用位点预测等方法分析了SRK中SCR识别位点。结果表明,eSRK与相应S单倍型SCR的遗传进化图很相似；HVⅠ、HVII和HVIII作为整体的遗传进化图与eSRK的遗传进化图高度相似。单独的高变区的遗传进化图与eSRK的遗传进化图相差比较大,其中HVC相差最大。表明eSRK的高变区(HVⅠHVⅡ和HVⅢ)是SCR的识别位点。在线预测表明,所有的eSRK的HVⅠ皆有蛋白质作用位点,而N端亚结构域(B-lectin结构域)没有任何蛋白质作用位点。进一步说明高变区是SCR的识别区域。不同S单倍型蛋白作用位点不同,氨基酸种类也不同,但其中Glu、Arg和Trp出现的概率最大。预测结果为实验研究提供了理论基础。4.利用酵母双杂交法检测甘蓝SCR与SRK之间的相互作用以具有典型自交不亲和性的甘蓝D3和E1为材料,利用巢式PCR分别扩增SRK胞外域(eSRK)和SCR,通过酵母双杂交检测二者之间的相互作用。并利用同源重组技术分别将eSRK与GAL4报告基因DNA活化域融合(pGADT7eSRK)以及SCR分别与GAL4报告基因DNA结合域融合(pGBKT7SCR)。重组质粒(pGADT7eSRKD3)和(pGADT7eSRKE1)分别转化酵母Y187,重组质粒(pGBKT7SCR D3)和(pGBKT7SCR E1)分别转化酵母Y2HGold。转化酵母皆未出现自激活现象。融合的二倍体酵母(pGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR D3)和(pGADT7eSRK E1xpGBKT7SCR E1)均能在选择性固体培养基(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA)上生长,并且菌落呈蓝色。但融合的二倍体酵母(pGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR E1)和(pGADT7eSRK E1xpGBKT7SCR D3)均不能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA培养基上生长。结果表明,eSRK D3与SCR D3蛋白之间以及eSRK E1与SCR E1蛋白之间能够相互结合,但eSRK E1与SCR D3蛋白之间以及eSRK D3与SCR El蛋白之间不相互结合,为深入研究eSRK-SCR作用位点成功建立了一个技术平台。5.S受体激酶SCR识别模体的研究以甘蓝D3为材料,系统地克隆了eSRK的不同亚结构域,并利用同源重组技术分别将eSRK的不同亚结构域与酵母表达载体pGADT7连接,记为pGADT7eSRKn(n=1,2......15),重组质粒pGADT7eSRKn分别分别转化酵母Y187,转化酵母皆未出现自激活现象。所有的二倍体酵母(pGADT7eSRKnxpGBKT7SCRD3)均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固体培养基上生长,但以X-gal为底物检测时,二倍体酵母(pGADT7eSRK5xpGBKT7SCR D3)、(pGADT7eSRK6xpGBKT7SCR D3)、(pGADT7eSRK7xpGBKT7SCR D3)和(pGADT7eSRK10xpGBKT7SCR D3)不显蓝色。结果表明,SCR的结合域是eSRK的高变II区和III区。为了验证酵母双杂交的结果,以甘蓝D3为材料,克隆了eSRK的高变区(HVII+HVIII)亚结构域(eSRKv)和SCR,并分别与原核表达载体pGEX-6P-3和pET-22b (+)连接。IPTG能够诱导融合蛋白eSRKv-GST和SCR-HIS的表达,并且eSRKv-GST与SCR-HIS在体外能够相互作用。进一步证实了HVII和HVIII参与结合SCR, HVII和HVIII为相互作用的模体。6.蛋白质作用强度与酵母生长的关系以二倍体酵母：(eSRKD3×SCRD3)、(eSRK2×SCRD3)、(eSRK3×SCRD3)、(eSRK4×SCRD3)、(eSRK8×SCRD3)、(eSRK9×SCRD3)、(eSRK11×SCRD3)、(eSRK12×SCRD3)、(eSRK13×SCRD3)、(eSRK14×SCRD3)、(eSRK15×SCRD3)和(eSRKE1×SCRE1)为材料,分析了酵母生长与eSRK-SCR作用强度的关系。构建了3种SRK-SCR作用强度与酵母生长的关系模型。第一种模型为：SRK-SCR作用强度与酵母生长之间呈正向显着相关。该模型为构建二者的定量关系模型奠定了基础。第二种模型为：以SRK-SCR作用强度为自变量时,模型为：Y=0.0358+0.011X更为合理。该模型为以后实验提供了依据。第叁种模型为：以酵母生长量为自变量时,模型为：Y=-11.929+60.387X更为合理。该模型构建不但可以降低实验成本,而且建立了芸苔属自交不亲和性的全新测定方法。
曾建斌[5]2011年在《烟草全长cDNA文库的构建和LRR类受体蛋白激酶基因的克隆及表达分析》文中研究说明烟草(Nicotiana tabacum)是一种特殊的经济作物,在我国国民经济中占有重要的地位。烟草的栽培过程,除受到低温、干旱等影响外,还受各种病害的危害,这些不利因素严重影响了烟叶的产量与品质。烟草的产业化发展,对烟草的产量和品质提出了更高的要求。分离鉴定烟草抗逆、抗病相关功能基因,有利于揭示烟草抗逆、抗病的分子机制,同时对烟草的遗传改良具有重要的意义。现已发现,富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLK)具有调节植物生长发育、参与抗逆反应和防卫反应等生理功能。本实验室借助罗氏454测序技术已获得了两个预测为LRR-RLK类基因的部分序列,在此基础上,本文研究了这两个基因的全长序列和表达特征。同时,为搭建烟草功能基因组学研究平台,本文构建了五个优质烤烟全长cDNA文库:包括根、茎、叶、花四个器官全长cDNA文库,一个烟草经激素(SA、ABA、乙烯利)诱导处理和环境胁迫(低温、干旱)下的混合全长cDNA文库。研究结果如下:1.从烟草454测序结果出发,以RACE的方法克隆得到了一个富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLK)基因,命名为NtRLK1。经分析,cDNA序列全长为3456 bp,包含3150 bp开放阅读框,编码1049个氨基酸残基。功能域预测包含LRR-RLK类蛋白的叁个结构域: LRR胞外域、一个跨膜区和一个胞内激酶区,同源分析比对胞内激酶区相对保守。RT-PCR分析,该基因具有组织表达差异性,在叶片中的表达量最大;受SA、乙烯利、低温诱导上调表达,干旱诱导下调表达,ABA诱导不明显。2.一个预测的富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLK)为候选基因,以RACE的方法克隆得到了该基因的可能两个不同拷贝,暂命名为NtRLK2a和NtRLK2b。NtRLK2a的ORF长度为1941 bp,编码646个氨基酸;NtRLK2b的ORF长度为1947 bp,编码648个氨基酸。生物信息学分析该基因编码蛋白的理化特征和结构特征。同源比对发现,胞内激酶催化区相对保守。RT-PCR分析,该基因具有组织表达差异性,在叶片中的表达量最大;主要受SA和低温诱导表达。3.以优质烤烟品种不同生长时期的根混合为材料,按经修改的Creator~(TM) SMART~(TM) cDNA Library Construction kit的方法,成功构建了一个根全长cDNA文库。原始文库库容为3.15×10~6,重组率达到100%,插入片段集中在750-2000 bp之间,平均长度超过1000 bp。随机挑取25个克隆进行双向测序,经BlastN分析,所测序的25个克隆中有19个是在烟草上未报道的基因;全长基因有13个,占52%;19条序列具有GOs功能注释,占76%。4.构建了一个烟草茎全长cDNA文库。原始文库的库容为5.64×10~6,重组率达99%以上,插入片段大小集中在0.75-2 kb之间,平均长度约为1.2 kb。随机挑取部分克隆进行测序,并进行生物信息学分析,37.5%的序列与烟草同源性最高,62.5%属在烟草未报道的基因,45.8%是未知功能的基因。5.构建了一个烟草叶片全长cDNA文库。原始文库库容为3.85×10~6,重组率为100%,重组子插入片段集中在750-2000 bp之间。随机挑取25个克隆测序后,经生物信息学分析表明,与烟草同源性最高的基因序列占10条,11条为全长基因序列;20条序列有功能注释。6.构建了一个烟草花器官全长cDNA文库。经鉴定,初级文库库容为4.05×10~6个克隆,重组率达到95%,插入片段集中在1000-2500 bp之间,平均长度约为1400 bp,经扩增后的文库滴度为6.75×10~9 pfu/mL。随机挑取24个克隆进行测序,获得有效序列22条,利用Blast2GO软件进行初步分析,其中18条序列具有不同数量的功能注释。7.构建了一个烟草在SA、ABA、乙烯利、低温和干旱处理下的混合全长cDNA文库。经鉴定,文库初始库容量为5×10~6,重组子的插入片段平均长度约为1500 bp,文库重组率为100%。随机挑选25个克隆测序,经BlastX分析,9条序列是烟草已经登录或跟烟草序列相似性最高的序列,与其它科属同源基因占了64%。2个为未知功能蛋白基因,23个为已知功能蛋白基因,包括热激蛋白90、F-box家族成员、蛋白激酶家族、TLP类转录因子、LRR类蛋白等,这些蛋白很可能与逆境胁迫相关。上述结果为深入研究烟草LRR-RLK类基因的功能和高效克隆、筛选烟草组织器官特异性基因及抗性相关基因奠定了基础。
毕云龙[6]2016年在《基于转录组分析的PUB蛋白与甘蓝S-位点受体激酶的相互作用研究》文中研究指明自交不亲和(Self-incompatibility,SI)是显花植物防止自交、促进杂交,保持物种遗传多样性的重要机制之一。甘蓝等芸薹属(Brassica)植物属于典型孢子体型自交不亲和植物,其自交不亲和性由S位点(S-locus)上的复等位基因所控制。当自花授粉时,花粉落到柱头上,花粉中SCR可与柱头上SRK胞外域识别并特异性结合,引起SRK构象的变化和自体磷酸化,使其释放结合在SRK激酶结构域的类硫氧还蛋白1/2(THL1/2),随后ARC1结合到SRK胞内激酶域上,并被磷酸化,ARC1是E3泛素连接酶,通过泛素化作用向下继续传导细胞信号,最终导致自交不亲和。最近研究表明,在琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)中通过反义抑制柱头内的ARC1基因表达,只能部分地打破材料的不亲和性;在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,ARC1直系同源基因是假性遗传因子,仅仅转入SRK-SCR基因后,拟南芥植株也能呈现出自交不亲和性。由此说明ARC1可能并非SRK唯一的下游信号蛋白,柱头内可能存在其他未知底物与SRK作用,在柱头内继续传递SI信号。在甘蓝自花授粉的过程中,柱头内PUB蛋白的活性急剧增高,由此我们推测柱头内可能存在其他的泛素蛋白与SRK作用,因此前期对甘蓝高代自交不亲和A4的花期柱头做了自花授粉0 min和自花授粉30 min两种处理,提取了柱头总RNA后进行转录组测序分析,发现25条表达差异明显的PUB蛋白基因。我们挑取了4条表达差异最为明显的PUB蛋白进行后续研究,分别命名为BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11;随后,运用qRT-PCR筛选出自花授粉后甘蓝柱头内基因表达水平发生变化的PUB蛋白。参照PUB蛋白基因的同源序列设计扩增引物,以甘蓝A4 cDNA为模板来扩增基因片段,构建T载体克隆并测序。为探究这些泛素蛋白能否SRK发生相互作用,我们利用酵母双杂交技术和GST pull-down技术检测PUB蛋白和SRK胞内域之间的相互作用。主要结果如下:(1)基于转录组分析和qrt-pcr的甘蓝柱头pub蛋白基因的筛选在转录组测序分析中,甘蓝柱头经过自花授粉0min与自花授粉30min两种处理,bosu03、bosu05、bosu07的基因表达量上升,bosu11的基因表达量下降。为更精确的探究自花授粉后甘蓝柱头中泛素蛋白的时空表达特异性,我们以未授粉、自花授粉15min、30min、60min的柱头cdna为模板,进行荧光定量pcr反应,实验结果显示,自花授粉后,arc1的表达量有所下降,同时bosu03、bosu05、bosu07、bosu11的基因表达量相较于未授粉时也都在下降。我们注意到,bosu11在荧光定量pcr中的基因表达量变化与在转录组测序分析中变化趋势一致,但是bosu03、bosu05、bosu07的基因表达量在荧光定量pcr中是下降的,与转录组测序分析中对应时间点变化趋势不一致,这可能是因为转录组和荧光定量分析时获取自花授粉0min柱头的时间点存在差异所导致。但是自花授粉后bosu03、bosu05、bosu07、bosu11的基因差异表达进一步说明了bosu03、bosu05、bosu07、bosu11可能响应了自花授粉后柱头内的自交不亲和反应。因此,我们将继续将bosu03、bosu05、bosu07和bosu11作为目标基因,探究其是否与srk发生相互作用。(2)甘蓝pub蛋白基因的克隆和序列分析根据转录组测序所得的pub基因片段序列,结合芸薹属基因数据库和甘蓝基因数据库,设计扩增基因引物。我们对bosu03、bosu05、bosu07、bosu11的全长cds序列进行生物信息学分析,发现其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;这4个pub蛋白不含有跨膜结构域和核定位信号;在线分析这些泛素蛋白的理化性质和功能性位点,这4个pub蛋白氨基酸序列都含有多个n-糖基化位点、camp或cgmp依赖性磷酸化位点、蛋白激酶c磷酸化位点和酪蛋白Ⅱ磷酸化位点等功能性位点;bosu07、bosu11和arc1一样不仅具有arm臂重复结构,还含有u-box结构域;但是bosu03、bosu05仅含有arm臂重复结构域,而不具备u-box结构域。(3)酵母双杂交系统检验甘蓝pub蛋白与srk胞内域之间相互作用因为srk的胞内域与arc1的u-box结构域之间没有相互作用,而与其arm臂重复结构域之间存在相互作用,故设计引物时摒除了泛素蛋白的u-box区段,并在引物上下两端分别加入限制性酶切位点,构建甘蓝泛素蛋白基因、arc1和srk的酵母表达载体:pgadt7-bosu03、pgadt7-bosu05、pgadt7-bosu07、pgadt7-bosu11、pgadt7-arc1、pgbkt7-srk,通过毒性检测和自激活检测,发现构建的表达载体对酵母细胞没有毒性作用,也没有自激活作用;将pub蛋白、ARC1的酵母表达载体分别和pGBKT7-SRK共转化酵母感受态AH109,观察共转化酵母在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT固体培养基上的生长状态,以此检测这些泛素蛋白与SRK之间的相互作用。实验结果显示,BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11、和ARC1与SRK的组合在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT固体培养基上能够生长,且显现出蓝色反应,表明BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11可能与SRK发生相互作用。用Yeastβ-Galactosidase Assay Kit能够定量测量YPDA液体培养基中转化酵母的β-半乳糖苷酶活性,β-半乳糖苷酶活性值能够直接反应泛素蛋白与SRK之间的相互作用反应强度。SRK/ARC1转化酵母的β-半乳糖苷酶活性值为11.19 Miller Units,而SRK/BoSU03、SRK/BoSU05、SRK/BoSU07、SRK/BoSU11的β-半乳糖苷酶活性值分别为15.37 Miller Units、12.71Miller Units、15.36 Miller Units、15.61Miller Units,要大于阴性对照的β-半乳糖苷酶活性值2.76 Miller Units,同时也要比ARC1的β-半乳糖苷酶活性值11.19 Miller Units。这表示SRK/BoSU03、SRK/BoSU05、SRK/BoSU07、SRK/BoSU11的共转化酵母都能激活报告基因,进一步说明了SRK与BoSU03、BoSU05、Bo SU07、BoSU11之间存在相互作用。(4)BoSU07、BoSU11与SRK相互作用的GST pull-down技术体外检测依据共沉淀法鉴定蛋白质相互作用原理,通过研究Promega蛋白纯化试剂盒原理来进行蛋白质间相互作用的检测。利用pET43.1a作为表达载体表达BoSU07和BoSU11,利用pET43.1a-BoSU07、pET43.1a-BoSU11融合蛋白序列中的6×His标签与Ni+结合,结合的复合物作为诱饵蛋白,把体外表达的pGEX-4T-1-SRK融合蛋白作为靶蛋白,pET43.1a-BoSU07、pET43.1a-BoSU11上结合的Ni+,孵育后利用其与磁力架吸附性将诱饵蛋白和靶蛋白的复合体纯化出来。SDS-PAGE试验结果显示,pET43.1a-BoSU07和pET43.1a-BoSU11融合蛋白都能够与pGEX-4T-1-SRK融合蛋白相互结合形成稳定的复合体,而与Ni+一起被洗脱下来,表明BoSU07、BoSU11都能与SRK胞内域发生相互作用。我们推测BoSU07、BoSU11作为PUB蛋白家族成员,很有可能通过与SRK相互作用,向下游传递自交不亲和信号,参与构成自花授粉后甘蓝柱头内的自交不亲和信号通路。筛选出新的与SRK相互作用的蛋白,对于进一步阐述SRK下游信号传导途径有重要的价值,同时为自交不亲和性的理论研究提供了新内容,为植物受体激酶作用机制的研究提供了新发现。
牛义[7]2009年在《甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1、SRK的克隆与体外表达及其相互作用研究》文中研究指明植物的自交不亲和性(self-incompatibility,SI)在植物界中普遍存在,是植物为了防止近亲繁殖、促进物种分化、保持遗传多样性,而在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要机制。它实质上是一种雌蕊识别自体花粉和异体花粉,阻止自体花粉萌发的信号传导过程,涉及从授粉到受精过程中发生的花粉和雌蕊之间的相互作用,几乎一半以上的显花植物具有自交不亲和性,涉及到70多个科、250多个属。甘蓝是典型的具有孢子体型自交不亲和性的芸薹属植物,这类SI在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S基因座所控制。最近几年,对芸薹属自交不亲和性的决定性因子研究方面,取得了长足的进步。迄今为止,已分离到3类与S位点连锁的基因,分别编码SLG(S-locusglycoprotein,S位点糖蛋白)、S位点富半胱氨酸蛋白SCR(S-locus cystein-rich protein)/SPll(S-locus protein 11,S位点蛋白11)和SRK(S-locus receptor kinase,S位点受体激酶)。叁个基因(SLG、SRK、SCR)的相继分离与鉴定,意味着由SRK介导的自交不亲和信号传导的上游事件越来越清晰了。来自花粉中的SCR/SP11在SLG的协助下与柱头上的跨膜蛋白SRK的胞外域相互识别,当两者具有相同单倍型时,SRK发生自我磷酸化,引起细胞内信号的级联反应,最后抑制自花花粉的萌发、水合或花粉管伸长。但是,对SRK介导的细胞信号传导下游磷酸化蛋白研究相对于上游受体来说要缓慢得多。在整个信号传导途径中,ARC1是下游事件中最为感兴趣的蛋白之一,它能够与SRK相互作用,并将信号传递给下游因子。因此在自交不亲和信号传导过程,SRK与ARC1的结合与否以及复合体的存在和变化是证实这个分子过程和调控自交不亲和反应的关键。为了探索这些问题,必须首先鉴定ARC1与SRK之间的相互作用,调控二者的解离与聚合,深入分析二者的作用机理,建立相互作用化控试剂的筛选平台,从而为下一步筛选ARC1的下游因子创造条件。本研究以高度自交不亲和性甘蓝E1为材料,克隆了自交不亲和信号传导元件ARC1和SRK基因,并进行了表达分析。体外证实了ARC1与SRK的相互作用,建立了适用于SRK和ARC1相互作用的体外检测体系,为进一步的化学调控试剂的筛选,实现SRK-ARC1复合体聚合与解离的人为调控提供理论和技术基础。主要工作及结果总结如下:1甘蓝ARC1臂重复蛋白编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达1.1 ARC1基因的克隆与序列分析采用PCR和RT-PCR技术,以甘蓝E1基因组DNA和柱头总RNA为模板,扩增了ARC1的DNA和cDNA序列,经测序和序列分析表明,DNA序列无内含子存在,扩增ARC1基因的编码序列为1 992 bp,编码663个氨基酸残基,分子量为73.5 kD。序列同源性分析表明,甘蓝E1的ARC1基因(B.oleracea E1 ARC1)与羽衣甘蓝ARC1基因(B.oleracea kale ARC1,NCBI登录号:EU344909)、油菜ARC1基因(B.napus ARC1,NCBI登录号:AF024625)、甘蓝20010197 ARC1基因(B.oleracea ARC1 20010197~([188]))、甘蓝ARC1基因(B.oleracea ARC1,NCBI登录号:AJ417335)、拟南芥中泛素蛋白连接酶(A.thaliana PUB17,NCBI登录号:NM102674)、水芹ARC1基因(A.thaliana cress ARC1,NCBI登录号:AY150512)的同源性分别为97%、94%、93%、95%、70%和70%。作为芸薹属5个基因,B.oleracea E1 ARC1、B.oleracea kale ARC1、B.oleracea ARC1 20010197、B.oleracea ARC1、B.napus ARC1之间的碱基差异很小,而作为十字花科中不同属的两个基因B.oleracea E1 ARC1和A.thaliana ARC1,在碱基上却存在相对较大的差异,编码的碱基差异大多数集中在ARC1的N端,说明ARC1基因存在较强的保守性,而且C端区域的保守性强于N端。在甘蓝与油菜的序列中均存在碱基的缺失,但这种缺失往往是以密码子形式的缺失,并没有引起移码突变。同源氨基酸序列进行比对显示,B.oleracea E1 ARC1基因编码的氨基酸序列与B.oleracea kale ARC1、B.oleraceaARC1 20010197、B.napus ARC1、A.thaliana ARC1所编码的氨基酸序列相似性分别为97.9%、97.6%、93.2%和53.2%。建立进化树后分析发现,B.oleracea E1 ARC1与B.oleracea kale ARC1、B.oleracea ARC1 20010197、B.oleracea ARC1的亲缘关系较近,而与B.napus ARC1、A.thalianaPUB17、A.thaliana cress ARC1的亲缘关系较远,更充分说明了ARC1基因的较强保守性,而且种间的保守性高于属间的保守性。在甘蓝E1的ARC1蛋白质序列中有一个U-box结构,5个臂重复序列。U-box结构位于第282个氨基酸和第347个氨基酸之间,臂重复序列编码42个氨基酸残基,油菜ARC1的U-box结构位于第283个氨基酸和第347个氨基酸之间。而在拟南芥中臂重复序列只有1个,这种较大的差异可能是导致ARC1作为与自交不亲和信号传导有关的基因在两个不同属之间的功能有所不同的原因。对甘蓝E1的ARC1蛋白的活性位点分析发现,ARC1蛋白中具有犰狳的ARM活性位点,该位点在芸薹属中的保守性很差,同时还发现其它磷酸化活性位点,包括10个蛋白激酶C磷酸化位点、1个亮氨酸拉链位点、2个基于cAMP-和cGMP蛋白激酶林磷酸化位点、11个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-糖基化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个氨基化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点,这些位点的存在与ARC1蛋白参与信号传导过程中依赖的磷酸化作用是相辅相成的。另外,拉链结构的存在,可能与ARC1的二聚化有关,或者是下一级信号传导元件的结合位点。ARC1蛋白的叁维图形覆盖了400个氨基酸(第264位到第663位氨基酸),该段蛋白的结构整体上是右手螺旋,形成了类似海马状构型,腹部中空,形成大沟,背部形成小沟,小沟区域正是ARM结构域,可能为它与其他蛋白的结合提供了相应位点。1.2 ARC1在大肠杆菌中的表达提取pMD18-T-ARC1和pET43.1a质粒,经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切,纯化回收ARC1和pET43.1a片段,用T4 DNA Ligase连接以构建表达质粒pET43.1a-ARC1,经PCR以及EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定。提取pET43.1a-ARC1质粒,转化表达宿主菌BL21,IPTG诱导表达ARC1融合蛋白,表达产物的SDS-PAGE结果显示,在约135 kD处有重组蛋白表达特异带出现,其蛋白质相对分子质量与预计值相符。在诱导的过程中,IPTG浓度影响不大,但诱导温度(℃)对ARC1蛋白的表达影响很大,最佳诱导条件为:温度32℃;IPTG 1.0 mmol·L;时间4 h。诱导表达的融合蛋白ARC1主要是以包涵体的形式存在,但通过细胞破碎及蛋白纯化试剂盒纯化后,纯化产物经SDS-PAGE检测,泳道基本没有杂蛋白条带,纯化结果比较理想。2甘蓝SRK激酶结构域编码序列的克隆与其在大肠杆菌中的表达2.1 SRK_(K1)基因的克隆与序列分析以甘蓝E1为材料,特异扩增SRK激酶结构域编码区序列(SRK_(E1))。测序结果显示扩增的DNA序列和cDNA序列分别为1 711 bp和1 241 bp,DNA序列包含6个外显子、5个内含子,内含子大小分别为89 bp、107 bp、89bp、102 bp和78 bp。5个内含子的5'和3'端完全符合经典的GT-AG法则。同源氨基酸序列比对表明,SRK_(E1)与sRK_6、SRK_(910)、SRK_(18)、SRK_(29)氨基酸序列同源性分别为88.2%、85.7%、87.2%和85.7%。SRK_(E1)的氨基酸序列包含了跨膜结构域的后16个氨基酸和整个激酶结构域,跨膜结构域的Cys和激酶活性位点Lys并没有发生突变。用Blastp程序对SRK_(E1)的氨基酸序列进行保守结构域分析发现,该序列中存在蛋白激酶结构域和酪氨酸激酶结构域。蛋白激酶结构域位于第78位氨基酸和第361位氨基酸之间,编码284个氨基酸。在系统进化分析中发现,不同单元型SRK依据序列同源性高低分为两类(ClassⅠ和ClassⅡ),ClassⅠ表现为高度自交不亲和,ClassⅡ(SRK_(15)、SRK_(60)、SRK_2、SRK_(29)和SRK_5)的自交不亲和性较弱,SRK_(E1)与SRK_(45)、SRK_3聚类在一起。因此,依据不同单元型SRK序列的多态性从分子层面上证明了E1材料的高度自交不亲和性。2.2 SRK_(E1)在大肠杆菌中的表达提取pMD18-T-SRK_(E1)和pET43.1a质粒,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,纯化回收SRK_(E1)和pET43.1a片段,用T4 DNA Ligase连接以构建表达质粒pET43.1a-SRK_(E1),经PCR以及BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。提取pET43.1a-SRK_(E1)质粒,转化表达宿主菌BL21,IPTG诱导表达SRK_(E1)融合蛋白,表达产物的SDS-PAGE结果显示,在约107 kD处有重组蛋白表达特异带出现,IPTG的浓度和诱导温度对该蛋白表达量的影响不大,且表达的SRK_(E1)融合蛋白主要包涵体形式存在。SRK_(E1)融合蛋白最佳的诱导表达条件为:温度37℃;IPTG 0.5 mmol·L~(-1);时间4h。3 ARC1与SRK_(E1)体外相互作用的方法建立免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用原理表明,蛋白质X与蛋白质Y相互作用,如蛋白质X与其抗体免疫沉淀,则蛋白Y会与蛋白质X及其抗体一起沉淀下来。依据该原理利用pET43.1a作为表达载体表达ARC1、SRK_(E1),巧妙利用了pET43.1a-ARC1、pET43.1a-SRK_(E1)融合蛋白序列中的6×His标签与Ni~+相结合的特点,探索性地建立了体外检测蛋白质间相互作用的新方法。将pET43.1a-SRK_(E1)融合蛋白与Ni~+结合,结合后的复合物作为“诱饵蛋白”,把体外表达的ARC1融合蛋白溶于适于相互作用的缓冲液中作为“靶蛋白”溶液,两者4℃条件下孵育后利用pET43.1a-SRK_(E1)上结合的Ni~+与磁力架吸附性将“诱饵蛋白”与靶蛋白的复合体纯化出来。本研究对ARC1与SRK_(E1)相互作用的检测,条带清楚,明确证实了两者相互作用,得到了理想的结果,说明我们建立的体外检测蛋白相互作用方法是可行的。本方法与免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用相比,不需要制备抗体,简化了实验操作,避免了因抗体特异性不强可能带来的假阳性结果。另外本文建立的检测体系可作为ARC1与SRK相互作用的化控试剂筛选平台,从而为深入分析两者相互作用的机理以及分离和鉴定自交不亲和未知的下游信号传导元件提供新的信息与线索。4 ARC1与SRK_(E1)相互作用的体外检测将在大肠杆菌BL21中诱导表达的pET43.1a-SRK_(E1)融合蛋白Ni~+结合,结合后的复合物作为“诱饵蛋白”。将在大肠杆菌BL21中诱导表达的pET43.1a-ARC1融合蛋白作为“靶蛋白”,并溶解在适于相互作用的缓冲液中,“诱饵蛋白”和“靶蛋白”溶液在4℃条件下孵育2 h,每隔15 min轻轻翻转混匀一次,然后利用pET43.1a-SRK_(E1)融合蛋白结合的Ni~+与磁力架吸附性将诱饵蛋白和蛋白的复合体纯化出来,产物经SDS-PAGE检测,结果表明ARC1蛋白与SRK_(E1)蛋白在体外能够相互结合,可能形成稳定的复合体,同时也说明二者的相互作用并非产生于瞬间的结合。
赵永斌[8]2005年在《S受体激酶信号传导因子SSP和MLPK编码基因的克隆与序列分析》文中研究表明杂种优势在农业生产中的广泛应用,促使在自交不亲和(SI)研究领域不断涌现出新的科研成果,对于孢子体自交不亲和反应机理的研究,芸薹属植物无疑是研究最多、机理最为清楚的一类作物。继发现并阐明了由S-locus基因编码的引发SI信号传导途径的功能因子及其功能之后,又先后发现了几类与SI信号传导途径相关疑似为该途径下游组分的蛋白质,对其功能的研究已经取得了一定的成果,但尚有很多问题亟待解决。目前普遍认为,当具有相同单倍型时,来自花粉中的半胱氨酸富含蛋白SCR/SP11与柱头上的跨膜蛋白SRK相互识别,启动SRK自磷酸化反应,从而引发SI信号传导过程,而SRK下游信号由ARC1、THL1/THL2、MOD等因子传递,最终导致花粉不能在柱头上萌发。2003年,吴能表博士从自交不亲和甘蓝中分离出一分子量为22.2KD未知蛋白,2004年Murase在芜菁中发现了MLPK蛋白,他们虽然功能还不很清楚,但无疑为自交不亲和机理的研究提供了新的内容。本研究以西南农业大学繁育的高度自交不亲和的甘蓝E1为试验材料,采用PCR、RT-PCR以及3'RACE方法克隆了SSP和MLPK基因的核DNA与cDNA序列,并利用生物学软件对其序列进行分析,利用生物信息学方法预测和探讨了蛋白质的结构和功能,以期为芸薹属植物自交不亲和性的分子机理的研究提供新的内容。主要工作与结果如下: 1.SSP基因的克降与序列分析 以甘蓝的基因组DNA和柱头总RNA为模板,采用3'RACE和PCR技术扩增SSP核DNA和cDNA。对目的片段进行回收、克隆并测序。序列分析表明,获得的SSPcDNA序列片段长度为825bp,核DNA序列片段长度为778bp,序列比对时发现SSP包含一个由654个碱基组成的外显子,没有发现内含子,编码217个氨基酸。BLAST同源性搜索显示,发现与SSP同源的核苷酸序列很少。但SSP核苷酸序列与拟南芥肽酶M28家族蛋白的核苷酸序列相似性最高达到67%,而SSP氨基酸序列同样也与拟南芥肽酶M28家族蛋白的氨酸序列相似性最高达到62%,其与水稻肽酶蛋白的序列相似性达到41.8%,与拟南芥谷氨酸羧肽酶的序列相似性达到40%。对甘蓝SSP氨基酸序列进行保守结构域搜索,结果表明SSP中含有一个TFR_dimer(Transferrin receptor-like dimerisation domain)结构域,但没有发现M28家族所具有的HEXXH
杨永军[9]2012年在《甘蓝SCR、THL与SRK交替作用的酵母双杂交检测》文中研究表明植物的自交不亲和性(self-incompatibility, SI)是为了避免白花受精而进化出的重要遗传机制。甘蓝SI的分子过程是由存在于花粉中的S-位点富含半胱氨酸蛋白(S-locus cystein-rich protein, SCR)亦称为S位点蛋白11(S-locus protein11,SPll)识别结合柱头上的S受体激酶基因(S receptor kinase gene, SRK)启动,将原本结合于SRK上的负调控因子类硫氧还蛋白(Thioredoxin—like protein, THL)释放出来,然后通过目前尚未完全知晓的分子过程,实现自交不亲和性。SRK(S位点受体激酶)、SCR/SP11(S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11)和THL1(类硫氧还蛋白)是甘蓝自交不亲和性信号传导过程的重要的叁个元件。本研究利用酵母双杂交技术探讨甘蓝SCR、THL与SRK交替相互作用的关系。本研究利用PCR技术获得两种甘蓝SCR2(class Ⅱ)、eSRK2(class Ⅱ)、THL1、 SRKJ(class Ⅰ, SRK6激酶域)和eSRK28(class1)的编码序列,并分别构建以pGBKT7为载体的SCR2、THL1的重组“诱饵”质粒和以pGADT7为载体的eSRK2、eSRK28、 SRKJ的重组“猎物”质粒。利用酵母双杂交系统验证eSRK2-SCR2, eSRK28-SCR2, SRKJ-THL1的相互作用。重组质粒在宿主细胞中未产生毒性及自激活作用,表明重组表达载体构建成功；试验组合Y2HGold[pGBKT7-SCR2]xY187[pGADT7-eSRK2]在叁缺平板(SD/-Trp-Leu-His/x-a-gal/AbA, TDO/x/A)上生长出蓝色克隆,激活了报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3;实验组合Y2HGold[pGBKT7-SCR2]xY187[pGADT7-eSRK28]能够在二缺平板(SD/-Trp-Leu)生长,但在叁缺平扳培养基上不生长,表明不同单倍型SRK-SCR可能不发生相互作用；实验组Y187[pGADT7-SRKJ]xY2HGold[pGBKT7-THL1]能够在四缺平板培养基上生长,激活了4种报告基因(AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2)。相同的单倍型SRK与SCR之问能够相互作用,不同的单倍型之间不会发生相互作用；酵母中报告基因表达的数目和类型的差异所反映了class II型内部的SCR-SRK和class I的SCR-SRK互作强度,I型高于II型；THL与SRK之间存在较高的互作强度。这为I型和II型不同的自交不亲和性表型所依赖的叁个起始信号传导元件之间的识别程度差异提供了直接证据和新内容。主要研究结果总结如下：1.I型和II型的SCR2及eSRK2的基因克隆及序列分析扩增的eSRK2位于第一个外显子的74bp-1321bp之间,编码了416个氨基酸。Vector NTI Advance分析I和II型的SRK氨基酸序列,发现class II型的eSRK之间的相似性要高于class I型。class II型中的S-2、S-5和S一15之间的序列相似性达到93%-97.3%；class I型的S-1、S-7、S-8、S-14、S-11、S-24和S-29之间氨基酸序列相似性比class II型要低一些。比对分析发现I和II型的氨基酸序列在219-330的氨基酸区间和446～460的氨基酸区间呈现较大的差异,class I型的氨基酸存在部分缺失。本研究扩增的是SCR2的第二个外显子,共编码65个氨基酸。应用Vector NTI Advance分析不同的SCR氨基酸序列显示了拟南芥和甘蓝氨基酸序列的趋异。在class-I型中不同单倍型SCR氨基酸的相似度为20～76%；class-II型中不同单倍型SCR蛋白质序列两两之间的相似度达到63～94%。class-I型SCR的4个半胱氨酸残基高度保守,另外4个半胱氨酸残基所处的位置略有差异；而class-II型SCR的8个半胱氨酸残基高度保守2.诱饵蛋白毒性及其自激活检测分析和pGADT7-SRK毒性检测分析pGBKT7-SCR2质粒的菌落出现在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal平板上为白色菌落；pGBKT7-THL1质粒在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal的平板上出现了生长状态良好,菌斑与空载pGBKT7大小相近、菌斑密度均无明显差异,证明转入的表达蛋白对酵母无毒害作用。pGBKT7-SCR2和pGBKT7-THL1在SD/-Trp/x-a-gal/AbA平板上没有菌落生长。pGBKT7-SCR2和pGBKT7-THL1质粒的酵母细胞中没有激活报告基因AUR1-C和MEL1,没有发生自身的转录激活作用。pGADT7-SRKJ和pGADT7-eSRK2在SD/-Leu平板上生长状念良好。而且其对照pGADT7斑点大小及生长时间与pGADT7-eSRK2和pGADT7-SRKJ一致,说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。3.SCR2与eSRK2; eSRK28与SCR2; SRKJ与THLl相互作用检测Y187[pGADT7-SRKJ]xY2HGold[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR2]x Y187[pGADT7-eSRK2]都能在DDO/x/A平板上长出明显的蓝色菌落,激活了报告基因AUR1-C和MEL1; Y2HGold[pGBKT7-SCR2]xY187[pGADT7-eSRK28]在DDO/x/A平板上未长出蓝色菌落,初步判断没有相互作用。为更进一步检测相互作用的可能性,排除假阳性和假阴悱的出现；而后将DDO/x/A平板上的蓝色克隆划线至TDO/x/A和QDO/x/A平板上,4天后发现涂有Y2HGold[pGBKT7-SCR2]xY187[pGADT7-eSRK2]的TDO/x/A在平板上呈蓝色,而QDO/x/A平板上酵母菌株没有生长的迹象,由此可表明报告基因HIS3也能被激活,而报告基因ADE未激活。而Y187[pGADT7-SRKJ] xY2HGold[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR28]xY187[pGADT7-eSRK28]在TDO/x/A和QDO/x/A在平板上都呈蓝色,由此可表明报告基因HIS3和ADE被激活Y2HGold[pGBKT7-SCR2]xY187[pGADT7-eSRK28]的融合株的融合株在叁缺平板和四缺平板上都没有生长,证明了不同单倍型之间没有相互作用。
李娜[10]2013年在《高压静电场对羽衣甘蓝种子萌发过程DNA甲基化的影响》文中研究表明羽衣甘蓝为典型的异花授粉植物,杂交优势十分明显,利用羽衣甘蓝的自交不亲和性,通过自交纯化选育出综合性状良好的自交不亲和系,以其作为杂交亲本,可培育出良好新品种。但是羽衣甘蓝经过多代自交后,自交不亲和系后代有严重退化现象,种子的千粒重几乎是亲和系种子的一半,且生长势衰退,易感病。这些不利因素,都给杂交育种带来困难,严重影响了羽衣甘蓝新品种的创新。因此寻找延迟及恢复自交不亲和系自交后代退化种子的生长势、有效保持自交后代品质的手段是亟待解决的难题,这对自交不亲和系亲本的繁殖及杂交育种具有重要的意义。DNA甲基化在植物的生长发育中具有重要的调控作用,它是植物正常生长发育所必需的,本试验采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术,以羽衣甘蓝自交不亲和系9号种子、自交亲和系14号种子为研究对象,从表观遗传学的角度,对其生长发育过程以及高压静电场处理条件下基因组DNA甲基化水平及模式变化情况进行研究,探讨自交不亲和系种子退化现象与表观遗传规律的相关性,研究结果如下1.对9号种子萌发过程不同时期基因组DNA甲基化状态进行分析,结果显示,DNA甲基化修饰贯穿于种子萌发的整个过程,基因组CCGG位点发牛甲基化的方式以双链内侧胞嘧啶甲基化为主。同时检测到甲基化与去甲基化事件,从整个萌发阶段来看,主要发生去甲基化事件。在萌发前期(0-48h)发牛甲基化位点数目持续增多,但在萌发后期(48h-8d)发牛去甲基化的数目大量增加,最终导致去甲基化位点数目是甲基化位点数目的11倍。在种子萌发过程中,DNA甲基化模式类型众多、变化频繁、涉及位点也较多,存在同一位点甲基化模式的反复变化,证明了DNA甲基化修饰是9号种子萌发过程中基因表达的重要的调控方式。2.对分别萌发0h和48h的9号和14号种子基因组DNA甲基化差异的研究,显示两个品系之间表现出了较大的甲基化状态差异。在相同发育时期,9号在总甲基化、全甲基化、半甲基化水平上均不同程度高于14号。随着种子的萌发,9号与14号甲基化状态的差异也表现出来,9号全甲基化水平明显上升,半甲基化水平几乎不变;而14号变化趋势相反,半甲基化水平明显上升,全甲基化水平几乎不变。3.通过记录和计算种子在萌发过程中的各项宏观指标,结果表明高压静电场可促进9号种子的萌发和幼苗的生长发育,改善种子品质,表明高压静电场处理是恢复或延迟羽衣甘蓝自交不亲和系退化种子生长势,保持自交后代品质的有效手段之一。电场强度4kV/cm,处理时间30min是电场处理最适宜剂量。4.利用MSAP,从表观遗传学角度解释高压静电场促进种子萌发和幼苗生长发育的分子机理。自交不亲和系9号种子经高压静电场处理后,总甲基化水平下降,其中全甲基化水平略有升高,半甲基化水平下降显着。有19.64%的甲基化位点发生了甲基化状态的改变,同时发生甲基化与去甲基化事件,以去甲基化为主。5.对羽衣甘蓝基因组甲基化修饰位点差异片段进行回收、测序、比对分析,从中鉴定出许多与植物生长发育密切相关的基因,涉及信号转导、生长代谢、细胞器结构建立、转录因子、激酶等生物学过程,试验结果丰富了十字花科基因组甲基化检出位点的多样性。这些与植物生长发育相关的基因或许都直接或间接的受到了甲基化和去甲基化过程的调控,为在分子水平上解释羽衣甘蓝自交不亲和系9号种子存在植株退化、生长势衰退现象提供理论依据。
参考文献：
[1]. S—受体激酶结合蛋白基因的克隆与序列分析及其作用机制探讨[D]. 刘东. 西南农业大学. 2003
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[7]. 甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1、SRK的克隆与体外表达及其相互作用研究[D]. 牛义. 西南大学. 2009
[8]. S受体激酶信号传导因子SSP和MLPK编码基因的克隆与序列分析[D]. 赵永斌. 西南农业大学. 2005
[9]. 甘蓝SCR、THL与SRK交替作用的酵母双杂交检测[D]. 杨永军. 西南大学. 2012
[10]. 高压静电场对羽衣甘蓝种子萌发过程DNA甲基化的影响[D]. 李娜. 东北林业大学. 2013
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