王惠[1]2004年在《灰葡萄孢生物活性代谢产物的研究》文中提出灰葡萄孢是一种分布广、致病性强的植物病原真菌。对其致病性的研究较多，但涉及应用的报道甚少。从开发利用真菌资源，创制环境和谐农药的目的出发，本研究选灰葡萄孢为目标真菌，在筛选菌株及其培养条件的基础上，测定了高活性菌株代谢产物的农药活性和安全性，进而对活性成分进行分离和结构鉴定。 １． 从 １１ 种菌株中筛选出 ＢＣ４ 菌株为高活性菌株，反枝苋为其敏感植物。同时确定了在 ｐＨ ３－４ 的改良－Ｆｒｉｅｓ 培养基中，在 ２５℃黑暗条件下静止培养 １５－３５ｄ 得到的培养滤液活性最高。 ２． 分别用生长速率法和抑菌圈法测定培养滤液对部分植物病原真菌和细菌的抑菌活性，用浸渍法测定其杀虫活性，以杂草种子萌发和幼苗生长受阻为指标测定其除草活性。结果表明稀释 ３ 倍的灰葡萄孢培养滤液对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑制率分别为 ６６．２％、６１．６％和 ５６．４％；对黄瓜角斑病菌、马铃薯环腐病菌和白菜软腐烂病菌的抑菌圈直径分别为 １ｍｍ、６ ｍｍ 和 ９ｍｍ；稀释 ２０ 倍的培养滤液对杂草种子发芽有明显抑制作用；在出苗 ３ｄ 后的供试植物叶面上喷施原液，２４ｈ 对反枝苋和牵牛花等双子叶杂草幼苗毒杀活性达 １００％，而对禾本科的作物影响很小；培养滤液对黏虫、小菜蛾和菜青虫的杀伤活性很小。表明灰葡萄孢培养滤液中含有除草和抑菌活性成分。 ３． 以种子根芽生长抑制率为指标，测定培养滤液对小麦和玉米种子发芽的安全性；以叶面喷施后测定幼苗高度抑制率的方法，探讨培养滤液对作物幼苗生长的安全性；以收获时作物的株高，穗粒数、千粒重及穗重等为指标，测定培养滤液对小麦和玉米产量的影响。结果发现，稀释 ２０ 倍的培养滤液对小麦、玉米种子萌发均有抑制作用，但对幼苗生长几乎无影响；将培养滤液浓缩 １２ 倍，在小麦和玉米一芯一叶期叶面喷施，收获前小麦和玉米的结穗大小和籽粒饱满程度与对照没有明显差异。表明灰葡萄孢发酵液可以作为小麦和玉米的苗后除草剂或杀菌剂开发利用。 ４． 以反枝苋等植物作为活性跟踪的指示植物，用薄层层析法、柱层析和 ＨＰＬＣ 法等方法，从培养滤液中分离到 ４ 个农药活性化合物。其中 ３ 个化合物对植物种子萌发具有控制活性；另一个对反枝苋种子和幼苗具有毒杀活性。通过荧光扫描分析，发现分离到的杀草活性物质在 ３１２ｎｍ 波长激发光的作用下可以发出 ４１５ｎｍ 的荧光。推测这一化合物为一个尚未报道过的除草活性成分。 ５． 用紫外、红外、核磁共振和质谱等方法鉴定了 ３ 种对植物种子萌发具有控制作用的化合物的结构。它们分别为脱落酸、脱落酸－β－Ｄ－葡萄糖酯和脱落酸－β－Ｄ－葡萄糖苷。后 ２ 个化合物是首次从真菌灰葡萄孢发酵液中分离得到的化合物。 ６． 通过对 ２ 种化合物（脱落酸－β－Ｄ－葡萄糖酯和脱落酸－β－Ｄ－葡萄糖苷）的水解
彭文文[2]2005年在《灰葡萄孢培养滤液的生物活性及其影响因素》文中指出灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是一种寄主范围很广的植物病原菌,其代谢产物--真菌毒素对寄主植物的致毒活性[81]报道较多。近年来研究发现,许多植物病原菌分泌的毒素还有杀草、杀菌等活性[82-84],有些的活性物质已经开发成农药。灰葡萄孢代谢产物的种类很多[85],目前尚未见开发利用的报道。从开发利用真菌资源,创制环境和谐农药的目的出发,本研究选用灰葡萄孢BC4 真菌为目标,测定了其培养滤液的生物活性和对小麦、玉米、棉花的安全性;优化了其除草活性成分的培养条件,并研究了旋转浓缩过程对其除草活性成分的影响。1.分别用生长素率法和抑菌圈法测定培养滤液对部分植物病原菌和细菌的抑菌活性, 用浸渍法测定其杀虫活性, 以杂草种子萌发和幼苗受阻为指标测定其除草活性。结果表明稀释3倍的灰葡萄孢培养滤液对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑制率分别为66.2% 、61.6% 、56.4%;对黄瓜角斑病菌、马铃薯环腐病菌和白菜软腐烂病菌的抑菌圈直径分别为1mm、6mm 、9mm;稀释20倍的培养滤液对杂草种子萌发有明显的抑制作用;在出苗3d后的供试植物叶面上喷施原液,24h对反枝苋和牵牛花等双子叶杂草幼苗毒杀活性达100%, 而对禾本科杂草的作物影响很小;培养滤液对黏虫、小菜蛾和菜青虫的杀伤活性很小。表明灰葡萄孢培养滤液中含有除草和抑菌活性成分。2. 以培养滤液对种子幼根幼芽生长的抑制率为指标,测定培养滤液对小麦、玉米、棉花种子发芽的安全性;以叶面喷施后测定幼苗高度抑制率的方法,探讨培养滤液对作物幼苗生长的安全性;以收获时作物的株高、颗粒数、千粒重及穗重等为指标,测定培养滤液对小麦、玉米产量的影响。结果表明,稀释20倍的培养滤液对小麦和玉米种子萌发均有抑制作用,但对幼苗生长几乎无影响;将培养滤液浓缩12倍,在小麦和玉米一芯一叶期叶面喷施,收获前小麦和玉米的结穗大小和籽粒饱满程度与对照没有明显差异。表明灰葡萄孢培养滤液可以作为小麦和玉米的庙后除草剂开发利用。3. 以灰葡萄孢培养滤液对反枝苋种子根芽生长的抑制率作为活性指标,测定了培养滤液的除草活性,探索了不同碳源和培养条件对培养滤液除草活性的影响。结果表明,蔗糖+葡萄糖(质量比3:2)是较好的碳源组成;光照条件和温度是灰葡萄孢培养滤液除草活性的主效因素,在25℃和避光条件下培养得到的培养滤液活性最高;在250mL 培养液中添加2g 乙酸钠可使培养滤液除草活性达到91.2%。4. 用旋转浓缩法浓缩灰葡萄孢代谢产物的培养滤液,以试样对反枝苋种子发芽的校正抑制率为活性指标测定蒸出液和浓缩液的除草活性,同时测定蒸出液的紫外吸收曲线。结果发现,浓缩至原体积一半时的蒸出液和浓缩至干后的蒸出液均表现出生
王丽薇[3]2011年在《六种药用植物内生真菌的次生代谢产物及其生物活性研究》文中研究指明植物内生真菌是人类尚未充分开发利用的真菌资源之一,内生真菌产生的次生代谢产物种类繁多,在农业、医药等领域具有重要的应用潜力。本论文对六种药用植物内生真菌进行了分离,获得菌株112株,离体活性筛选获得22株具有抗菌活性的菌株。以其中6株抗菌活性较强、抗菌谱较广的菌株为研究对象,对其次生代谢产物进行活性跟踪分离,获得18个化合物,鉴定了其中15个化合物,其中1个为新化合物,1个为新天然产物,另有5个化合物为首次从菌属中分离获得的天然产物,1个化合物为首次从菌种中分离获得的天然产物。对其中部分化合物进行抗菌、抗肿瘤活性研究。从天南星内生真菌茎点霉Phoma sp. ZJWCF006的次生代谢产物中分离获得6个化合物,鉴定了5个化合物：(3S)-3,6,7-叁羟基-α-四氢萘酮(1)、尾孢酰胺(2)、木霉菌素(3)、β-谷甾醇(4)、富马酸单乙酯(5)。其中1为新化合物,化合物3-5均为首次从茎点霉属内生真菌中分离获得。抗菌活性测试结果表明,化合物2对十种植物病原菌均有较强抑制作用。抗肿瘤测试结果表明化合物2对六种肿瘤细胞有中等抑制作用。从马兰内生真菌茎点霉Phoma sp. ZJLQ335中分离并鉴定了1个化合物：尾孢酰胺(2)。在此基础上,对该内生真菌发酵培养基进行优化实验,使其中主要产物尾孢酰胺(2)的产率提高了9.32倍。从多花黄精内生真菌变灰青霉Penicillium canescens zjqy610中分离并鉴定了3个化合物：邻乙酰苯基脒基甲酸(6)、灰黄霉素(7)和4-羟基-5-甲氧基-2-甲基萘[1,2-b]呋喃-3-甲酸(8)。其中化合物8为首次从微生物中分离获得的新天然产物,化合物6为首次从内生真菌青霉属中分离获得。抗菌活性测试表明,化合物7对十四种植物病原真菌都具有抑制活性。从银杏内生真菌团青霉Penicillium commune TMSF169中分离并鉴定了一个化合物圆弧菌醛酸(9),该化合物为首次从团青霉中分离获得。抗菌活性测试表明,化合物9对十二种植物病原真菌具有抑制活性。从无花果果内生真菌炭角菌Xylaria sp. ZJWCF255中分离并鉴定了4个化合物：细胞松弛素D(10)、细胞松弛素C(11)、细胞松弛素Q(12)与细胞松弛素R(13)。抗菌活性测试表明,化合物12对十五种植物病原真菌具有抑制活性。抗肿瘤测试结果表明化合物12对叁种肿瘤细胞有中等抑制作用。从博落回内生真菌Chaetomium cupreum ZJWCF079中分离了4个化合物,鉴定了其中2个化合物：3,3’,6,6’-四羟基-4,4’-二甲基-1,1’-二(环己一3,6二烯)-2,2’,5,5’-四酮(14)、麦角甾烷-5,7,22-叁烯-3-醇(15),其中化合物15为首次从毛壳菌属内生真菌中分离获得。本论文的结果表明,药用植物内生真菌次生代谢产物具有结构新颖性与生物活性多样性的特征,是寻找先导化合物重要资源。
李春格[4]2003年在《灰葡萄孢代谢产物的除草活性及活性物质的分离纯化》文中指出本研究以来自不同地区不同寄主上的11个灰葡萄孢菌株为试材，研究了其代谢产物对番茄和辣椒的致毒活性及对反枝苋和马唐的除草活性。结果发现灰葡萄孢代谢产物对供试植物种子萌发后根和芽的伸长以及幼苗的生长都有一定的抑制作用，但是不同菌株间差异明显。其中BC1和BC4菌株的抑制作用最强，BC3、BC11和BC5菌株次之，其他菌株的毒力较弱。结果还发现，灰葡萄孢代谢产物对供试植物种子根伸长抑制作用较强的菌株，对其芽以及幼苗的生长也有较强的抑制作用。另外，对番茄和辣椒致毒活性较强的菌株对反枝苋和马唐的除草活性也较强。 试验确定了菌株BC4代谢产物中除草活性物质产生的适宜条件：即改良Fries培养基和查氏-道氏培养基(Ⅰ)：培养时间是35d；pH值为6；培养温度为25℃；静止培养；培养基中添加一定比例的番茄、辣椒的浸出汁并未提高灰葡萄孢代谢产物的除草活性。 通过叶片浸渍法和割茎幼苗法对灰葡萄孢代谢产物进行除草谱试验，结果表明，灰葡萄孢代谢产物具有较广泛的杀草范围，对反枝苋、裂叶牵牛、田旋花、稗草、马唐、牛筋、马齿苋、狗尾草、黎叶片和幼苗都有较强的抑制作用，其中尤以反枝苋为重。 灰葡萄孢培养滤液经乙酸乙酯萃取、乙酸乙酯萃取相的浓缩液即粗毒素，粗毒素经3次柱层析分离出一个除草活性段，该活性馏分经高效液相色谱分离得到一峰形尖锐而对称的除草活性组分。
詹伟[5]2016年在《金钗石斛根际土壤细菌和放线菌分离及抑菌活性研究》文中研究说明植物根际土壤存在大量微生物。植物通过其根系产生分泌物,向其周围土壤中的微生物提供物质能量和营养,影响根际微生物的群落结构,改变其生物活性。随着菌种分离、产物检测和结构鉴定新技术的发展,研究根际微生物及其代谢产物已成为寻找新抗生素和生物活性化合物的重要途径。金钗石斛为兰科石斛属植物,含有生物碱、倍半萜和联苄等多种化学成分,具抗肿瘤、抗氧化和抗白内障等生物活性。本研究是对金钗石斛根际土壤中细菌和放线菌进行分离,筛选具抑菌活性的菌株,分析可培养细菌、放线菌及具抑菌活性细菌、放线菌的多样性,并对一株具广谱抑菌活性的放线菌G29的发酵条件及其抑菌活性物质进行初步研究。具体研究结果如下:1.采用稀释平板法分离,从金钗石斛根际土壤中分离得到604株细菌和164株放线菌。基于16S r RNA基因序列分析表明,金钗石斛根际土壤细菌共分为3个类群,即厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes),包括16个属,其中厚壁菌门(Firmicutes)包括Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus、Psychrobacillus等4个属;变形菌门(Proteobacteria)包括Burkholderia、Comamonas、Serratia、Rahnella、Pseudomonas、Acinetobacter、Aeromonas、Leclercia等8个属;拟杆菌门包括Chryseobacterium、Elizabethkingia、Sphingobacterium、Chitinophaga等4个属。Bacillus为优势菌群。金钗石斛根际土壤中分离的菌株在系统发育关系上为放线菌门(Actinobacteria),包括2个属,即Streptomyces和Cellulosimicrobium。其中,Streptomyces为优势菌群。2.通过双层平板打孔法筛选,分别获得具有抑菌活性的34株细菌和19株放线菌,具有抑菌活性的细菌为Bacillus、Pseudomonas、Aeromonas、Psychrobacillus、Leclercia。具有抑菌活性的放线菌为Streptomyces。3.放线菌G29为一株具广谱抑菌活性菌株,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白菜软腐病菌、白色念珠菌、瓜果腐霉、马铃薯晚疫病菌都具有抑菌活性。通过形态观察、生理生化测定及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为Streptomyces costaricanus。通过发酵基础培养基的筛选、单因子试验、Plackett–Burman试验设计、最陡爬坡法、响应面法等对G29的发酵培养基和发酵条件进行优化,获得发酵培养的最佳条件:可溶性淀粉4.00 g/L、麦芽浸粉11.27 g/L、酵母浸粉5.83 g/L、CaCO3 3.09 g/L、蒸馏水1000 mL;接种量为5%,初始值6.5,发酵时间为120 h,培养温度28°C,摇瓶转速160 r/min,装液量100 mL/300 mL。4.采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取根际土壤放线菌G29发酵产物的活性成分,其中,乙酸乙酯萃取组分抑菌活性显着,薄层层析、硅胶柱层析及HPLC对乙酸乙酯萃取组分活性物质进行活性跟踪分离纯化,初步得到3个具有抑菌活性的化合物。其中化合物G-1纯度达99.17%,HPLC-GC初步确定化合物G-1分子量为997。
王惠, 钮绪燕, 李海娟, 同金霞, 苏红霞[6]2009年在《灰葡萄孢BC4菌株抑菌活性成分分离及对小麦纹枯菌的作用》文中研究说明首先探索了利用薄层色谱分离灰葡萄孢(Botrytis cinerea)BC4菌株抑菌活性代谢产物的溶剂系统,在此基础上分离得到了该菌4个代谢产物组分;然后以小麦纹枯菌为生物测定对象,观察了这4个组分对小麦纹枯菌菌丝生长的抑制活性;同时利用显微技术进一步观察了抑菌活性组分对小麦纹枯菌菌丝生长的影响部位。结果表明:在4种不同的薄层色谱溶剂系统中,石油醚+乙酸乙酯+甲酸(5∶4∶1)为分离灰葡萄孢BC4菌株抑菌活性代谢产物的较好展开剂。对利用该溶剂系统分离得到的4个代谢产物组分进行生物活性测定的结果表明,2个组分具有生物活性,其中组分4对小麦纹枯病菌有明显的抑制生长作用,相反组分2对其生长却有促进作用,组分1和3对该病菌没有作用。利用光学显微镜观察发现,接触组分4的小麦纹枯病菌菌丝顶端外部有深色液滴,对照则没有这种现象。利用扫描电镜观察的结果表明,接触组分4的菌丝与对照明显不同,菌丝停止向前延伸生长,分支增多,菌丝体出现不规则的膨大与缢缩,有些菌丝体新生部分变薄、模糊,有熔化迹象;有些与其它菌丝体粘合或融合在一起。表明灰葡萄孢BC4菌株代谢的抑菌活性成分对小麦纹枯菌的菌丝体体壁的形成具有严重阻碍作用,与叁唑酮具有相似的作用特点。
冯文华[7]2016年在《不同诱导子对酿酒葡萄赤霞珠组培苗白藜芦醇含量及抗氧化酶活性的影响》文中指出本研究以多年生酿酒葡萄赤霞珠的幼嫩茎段为外植体,并研究其组培苗的最适培养条件;以培养出的组培苗为材料,通过添加灰葡萄孢诱导子和水杨酸,研究诱导子对赤霞珠葡萄组培苗中白藜芦醇合成及抗氧化酶活性的影响。主要研究结果如下：1.以赤霞珠葡萄新梢的半木质化茎段作为外植体材料,接种培养污染率低,外植体萌芽率高,萌芽率为96.5%；消毒溶液以0.1%升汞溶液消毒8min效果最好。继代培养和生根培养以1/2MS+IBA0.2mg·L-1+蔗糖20g·L-1培养基培养赤霞珠葡萄组培苗生长状况最好,成苗率为99.67%,生根率为99.67%。2.灰葡萄孢诱导子和水杨酸诱导赤霞珠组培苗,均是诱导9d的效果最好,其中,灰葡萄孢诱导子可以使白藜芦醇含量比对照高近1.67倍；水杨酸可以使白藜芦醇含量比对照高1.5倍；因此,灰葡萄孢诱导子对赤霞珠组培苗白藜芦醇的促进效果比水杨酸好。3.灰葡萄孢诱导子处理后赤霞珠组培苗中PAL、POD、SOD、CAT、PPO活性均大于对照,分别是对照的2.17、1.58、1.48、1.83、2.11倍。水杨酸处理后赤霞珠组培苗中PAL、 POD、SOD、CAT、PPO活性均大于对照,分别是对照的1.37、1.13、1.23、1.03、2.19倍。4.在诱导第6-9d时,白藜芦醇含量增加,抗氧化酶及苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性均增加。
张建[8]2015年在《生防木霉（Trichoderma guizhouense NJAU 4742）重寄生分子机理研究Ⅰ中性金属肽酶NMP1和活性氧的功能分析》文中指出重寄生是指一种真菌捕食或者寄生另外一种真菌,获取营养,满足自身的生长繁殖;当被捕食的或被寄生的是植物病原真菌,可以抑制病原真菌的生长繁殖,达到生物防治植物真菌病害的效果。由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4，Foc4)侵染引起的香蕉枯萎病(巴拿马病)是目前香蕉产业发展最为严重的限制因子。目前防控枯萎病的方法主要有化学杀菌剂和生物杀菌剂,而化学杀菌剂的大量使用会引发环境和食品质量问题,因此研究利用以生物杀菌剂为主导的综合防控具有重要意义。研究和应用最广泛的真菌杀菌剂是在根际有较强竞争能力的木霉(Trichoderma spp.),因为其能重寄生植物病原真菌,减轻真菌引起的病害;定殖植物根际,活化养分,促进植物生长,并能诱导植物提高对多种植物病原真菌的系统抗性(Induced Systemic Resistance,ISR),提高经济作物产量。目前生产应用中木霉菌剂主要有哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿木霉(Trichoderma virens) 和深绿木霉(Trichoderma atroviride)。但是由于木霉分子生物学研究起步晚,技术难度大,限制了木霉重寄生机理的研究进展。本研究筛选一株具有强重寄生能力的木霉NJAU 4742,分析确定NJAU 4742其在木霉菌中进化分类;通过优化农杆菌介导转化方法,荧光标记NJAU 4742,跟踪其在土壤颗粒、肥料颗粒和植物根际的定殖;再通过构建T-DNA随机插入突变子库,筛选弱寄生能力的突变子,分析T-DNA在NJAU 4742基因组的插入位点,确定插入位点基因的功能;最后,比较NJAU 4742菌丝分泌的代谢组分的抑菌能力差异,结合相关功能基因的敲除与过量表达,确定NJAU 4742重寄生植物病原真菌的重要因子。主要研究结果如下:1.筛选一株对植物病原真菌Foc4、灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、水稻恶苗病菌、立枯丝核菌和齐整小核菌有强寄生能力的NJAU 4742,通过扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy,SEM)观察到NJAU 4742菌丝能够缠绕或者紧贴Foc4菌丝生长。Trypan Blue染色确定NJAU 4742的代谢产物在NJAU 4742菌丝缠绕Foc4菌丝过程中破坏Foc4的菌丝结构。NJAU 4742水溶性代谢产物能够抑制灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、立枯丝核菌和齐整小核菌的生长,但不能明显抑制Foc4 菌丝延伸;GC-MS分析NJAU 4742挥发性气体的成分,在封闭环境中,3-辛酮、萘、1-甲基萘和1-辛烯-3-酮均能抑制Foc4菌丝生长;测定NJAU 4742的胞外水解酶的特征,确定灭活Foc4菌体能够诱导NJAU 4742分泌几丁质酶、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶。根据NJAU 4742基因cal1、chi18-5和tef1的序列,贝叶斯进化分析,确定NJAU 4742在木霉属中分类位置,区别于模式菌株Trichoderma harzianum CBS 226.95(CBS)的分支。比较NJAU 4742和CBS的重寄生病原真菌的特异性和水溶性代谢产物的抑菌活性,避光条件下,CBS菌丝重寄生Foc4的能力较弱,其菌丝无法覆盖Foc4菌落,其水溶代谢产物抑制活力也弱。结合Biolog代谢谱分析,鉴定NJAU 4742属于Trichoderma guizhouense。2.优化农杆菌介导转化NJAU 4742分生孢子的方法,确立最佳的转化共培养温度、农杆菌与分生孢子共培养的载体和农杆菌类型,该方法被证实适用转化T.aggressivum CPK 375、T.pleuroticola CPK 2104、T.pleurotum CPK 2094和Foc4,并有较高的转化效率。荧光标记NJAU 4742,跟踪其在土壤和有机肥料颗粒表面定殖,利用突变子潮霉素B抗性,平板计数;盆栽实验证明,NJAU 4742能够促进香蕉植株生长,提高抗病能力,并观察到NJAU 4742成功定殖植物根际。3.通过农杆菌介导转化,T-DNA随机插入NJAU 4742,构建突变子库,纯化得到80个突变子,筛选出一株特异突变子,其菌丝不能覆盖Foc4、灰葡萄孢菌和链格孢菌,水溶性代谢产物的抗真菌活性降低。HiTAIL-PCR确定T-DNA插入NJAU 4742基因组中一个金属肽酶基因(编码MEROPS家族M35蛋白酶)的终止子,金属肽酶命名为nmp1。突变子回复突变,恢复野生型具有的重寄生能力。毕赤酵母表达NMP1,大小约18.7 kDa;分析蛋白结构,NMP1含有独特HEXXH motif,结合2个锌离子,另外GTXDXXYG motif结合第叁个锌离子。纯化的NMP1不能抑制病原真菌的生长,但对峙平板中,NMP1能部分恢复突变子的重寄生齐整小核菌的能力,增强野生型NJAU 4742重寄生能力。通过实时定量PCR,灭活Foc4菌丝,对峙中感应和接触病原真菌菌丝能够诱导NJAU 4742 nmp1的表达。4.收集NJAU 4742重寄生Foc4菌丝过程中菌丝表面形成的黄色液体,GC-MS分析其中化合物,鉴定为硬脂酸和棕榈酸。硬脂酸和棕榈酸是细胞膜组成成分,说明重寄生过程中,有菌丝被消化。分析液滴酶活,有较高的几丁质酶和蛋白酶,同时能检测出H2O2。比较NJAU 4742粗酶液(Foc4菌丝诱导)、正丁醇提取物(溶解NJAU4742次级代谢产物)和H2O2对Foc4菌丝的抑制效果,确定H2O2有抑制活力。染色研究NJAU 4742菌落对峙Foc4菌落过程中活性氧的变化,NJAU 4742菌丝接触Foc4后,H2O2集聚。荧光定量PCR分析对峙Foc4过程中NJAU 4742的Fe-sod,Mn-sod和Cu/Zn-sod(编码Superoxide Dismutase,SOD,功能是将O2·-氧化成H2O2)表达量提高。碘化丙啶染色表明10mMH2O2处理Foc4萌发的孢子和菌丝,破坏细胞膜结构;PDA平板上,5mM H2O2能够部分抑制立枯丝核菌和齐整小核菌的生长,改变核盘菌、交链格孢菌和Foc4菌落形态。构建敲除nox1(编码NADPH oxidase 1,Nox1)载体,PEG-CaCl2介导转化原生质体,得到410个突变子,通过PCR筛选出一株阳性转化子。转化子△nox1避光下失去野生型强寄生核盘菌、Foc4和齐整小菌核能力,同时伤害应激反应减弱。构建过量表达nox1载体,转化突变子△nox1,恢复野生型NJAU 4742避光条件下强寄生核盘菌、Foc4和齐整小菌核的能力;转化野生型NJAU 4742,定量PCR确定nox1转录水平,转化子较野生NJAU 4742表现出更强的寄生能力。光照下,突变子能够重寄生核盘菌、齐整小菌核菌落、Foc4和灰霉病菌。结论:菌株NJAU 4742有较强的重寄生多种植物病原真菌能力;适应能力强,能在土壤颗粒表面定殖;能利用有机肥料再次发酵,提高NJAU 4742数量级。分析NJAU 4742次级代谢产物中不同组分,确定H2O2是NJAU 4742菌丝破坏Foc4菌丝的最重要的物质;Foc4菌丝体能够诱导分泌水解酶更,裂解菌丝满足NJAU 4742菌丝的生长。
龙瑞敏[9]2007年在《松材线虫移行的研究和灰葡萄孢菌液中活性物质的提取及其对松材线虫的诱引》文中指出“松材线虫早期检测管诊断管”能从松树上诱引到松材线虫(Bx),为了研究其作用的机理,本论文设计了一条新的思路,分别以灭菌的淡水沙和水琼脂平板为基质,研究了各种因素对Bx移行的影响,并从灰葡萄孢发酵液中逐级分离提取各种组分,以滤纸片法分析其中对Bx移行起诱引作用的物质。主要结果如下:病木对Bx的诱引力较强,经高压灭菌后诱引能力虽有所下降,但差值不大,说明在病木中对Bx起诱引作用的物质并没有因高压灭菌而完全失去,这与某些人“吸引物质为挥发性物质”的推测相左;但松皮浸出液对Bx并没有什么明显的吸引作用,而灰葡萄孢对Bx的诱引力一直比较稳定。Bx对不同真菌的选择性强弱依次为:灰葡萄孢>盘多毛>酵母>空白,证明灰葡萄孢是其中对Bx最具吸引力的真菌。而真菌在平板上预置后对Bx的吸引效果更好,因为培养时间长,有效代谢产物多,对Bx的吸引力更强。同时,平板上琼脂浓度越低,或沙子的含水率越高(10～20%范围内),Bx移行的自由度和选择能力就越强,不同真菌对Bx的吸引效果差别越显着;而移行时间越长,不同真菌对Bx的吸引效果差别越不明显。灰葡萄孢菌液粗分离后得到的胞外乙酸乙酯相对Bx具有明显的诱引作用,该相经葡萄糖凝胶LH-20柱层析得到的各合并组分中又以P3和P4的诱引活性较好。将P3和P4合并为Pz,经硅胶柱层析得到的Pz-2诱引活性相对较稳定;Pz经凝胶柱层析得到的Pz-B、Pz-C和Pz-E则诱引活性较低。将Pz-2用凝胶层析法进一步分离,得到Pz-2-a、Pz-2-a′,前者诱引活性较高,后者诱引活较低。而Pz-2-a经不同分离方法得到的分离物诱引活性均降低且重复性较差。由此可见,灰葡萄菌液的活性物质主要存在于胞外有机相(乙酸乙酯相)中;可能是醇溶性化合物。但随着混合物的逐步分离,对Bx的吸引力和稳定性逐渐降低,证明对松材线虫的吸引活性是灰葡萄孢菌液的胞外有机相中几种物质协同作用的结果。
董玉霞[10]2008年在《灰葡萄孢除草相关基因的克隆与功能分析》文中指出本实验室利用mRNA差异显示技术对灰葡萄孢野生菌株BC4和部分诱变菌株(强除草活性菌株和弱除草活性菌株)进行分析,得到一个694 bp的基因片段,该基因可能调控灰葡萄孢除草活性,本研究利用Genomic Walking技术对该基因片段进行扩增,通过两次5'端Genomic Walking和两次3'端Genomic Walking,将该基因片段694 bp扩增到3961 bp,在NCBI网站进行BLAST比对表明,该基因与富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana,灰葡萄孢的有性态)中的calcium/calmodulin dependent proteinkinase(CaMK)同源性98%。根据GenBank报道Botryotinia fuckeliana的完整CDS,从两端设计引物,利用RT-PCR技术克隆了BC4的cDNA全长。Southern杂交结果表明该基因在基因组中以单拷贝形式存在。对CaMK基因进行生物信息学分析,利用DNAMAN软件将CaMK基因cDNA序列与DNA序列进行比对,发现BC4菌株的CaMK基因含有7个外显子和6个内含子。利用DNAStar软件对CaMK蛋白性质进行预测表明,CaMK预测蛋白的分子量为81.8748 kD,共有730个氨基酸,包括95个强碱性氨基酸(K,R),116个强酸性氨基酸(D,E),216个疏水氨基酸(AILFWV),160个极性氨基酸(NCQSTY),等电点(Isoelectrie Point)为6.22。利用ScanPro site软件分析CaMK一级结构中包含的保守结构域结构特征,发现CaMK基因一级结构中包含蛋白激酶ATP结合位点和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点。利用SOPMA软件分析CaMK蛋白的二级结构,用SWISS-MODEL软件构建CaMK蛋白的叁维结构模型。用已获得的灰葡萄孢CaMK基因5'端开放阅读框前1330 bp基因组DNA序列在softberry网站中进行启动子可能功能分析。构建了重组CaMK质粒,并成功地在E.coli BL21中得到表达。结果显示重组的CaMK蛋白大量表达在沉淀中,在上清中没有表达。研究的结果为蛋白纯化和蛋白抗体制备以及进一步研究该基因的功能奠定了基础。用CaMK特异性抑制剂KN-62处理灰葡萄孢孢子,结果表明,60μM的KN-62对灰葡萄孢孢子萌发抑制率为50%,80μM的KN-62对孢子萌发抑制率可达98%以上;灰葡萄孢用80μM的KN-62处理后对番茄致病性明显降低,用80μM KN-62处理后所产毒素的除草活性明显下降。表明CaMK基因在灰葡萄孢孢子萌发、致病性以及除草活性物质产生中起重要调控作用。
参考文献：
[1]. 灰葡萄孢生物活性代谢产物的研究[D]. 王惠. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 灰葡萄孢培养滤液的生物活性及其影响因素[D]. 彭文文. 西北农林科技大学. 2005
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[4]. 灰葡萄孢代谢产物的除草活性及活性物质的分离纯化[D]. 李春格. 河北农业大学. 2003
[5]. 金钗石斛根际土壤细菌和放线菌分离及抑菌活性研究[D]. 詹伟. 贵州师范大学. 2016
[6]. 灰葡萄孢BC4菌株抑菌活性成分分离及对小麦纹枯菌的作用[J]. 王惠, 钮绪燕, 李海娟, 同金霞, 苏红霞. 河北农业大学学报. 2009
[7]. 不同诱导子对酿酒葡萄赤霞珠组培苗白藜芦醇含量及抗氧化酶活性的影响[D]. 冯文华. 宁夏大学. 2016
[8]. 生防木霉（Trichoderma guizhouense NJAU 4742）重寄生分子机理研究Ⅰ中性金属肽酶NMP1和活性氧的功能分析[D]. 张建. 南京农业大学. 2015
[9]. 松材线虫移行的研究和灰葡萄孢菌液中活性物质的提取及其对松材线虫的诱引[D]. 龙瑞敏. 厦门大学. 2007
[10]. 灰葡萄孢除草相关基因的克隆与功能分析[D]. 董玉霞. 河北农业大学. 2008