2（海阳市人民医院，山东海阳）
[摘要]：目的：监测海阳市产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希菌的耐药情况及产β-内酰胺酶基因型分布。方法:收集2014年海阳市人民医院临床标本中96株大肠埃希菌，对产ESBLs菌株和非产ESBLs菌株分别用whonet5.6进行耐药统计与分析，并用聚合酶链反应对产酶菌株耐药基因进行检测。 结果:产ESBLs菌株耐药率明显高于非产ESBLs菌株。43株产酶菌株检测出的耐药基因型为CTX-M和TEM，其阳性率分别为55.81%和6.98%，未检测出SHV和OXA。结论:海阳市人民医院产ESBLs大肠埃希菌耐药性明显高于非产ESBLs大肠埃希菌，产ESBLs菌株携带的耐药基因以CTX-M 为主。
[关键词]： ESBLs 大肠埃希菌 耐药基因
Analysis of E. coli resistance and research on producing ESBLs genotypes
Wang Shufeng Xing Jinlei Zhou Qi
(Qingdao university,Qingdao)
[Abstract]:Objective:To monitore the resistance of producing ESBLs and non-producing ESBLs of Escherichia coli in Haiyang city, and to analysis the genotype distribution of producing ESBLs.Methods:To collect 2014 clinical specimens in haiyang city people's hospital of 96 strains of e.coli, the producing ESBLs strains and non producing ESBLs strains respectively using whonet5.6 resistant, statistics and analysis by using polymerase chain reaction to test the enzyme production strains of resistant genes.Results:Producing ESBLs strains resistant rate was significantly higher than producing ESBLs strains.43 strains enzyme producing strains were detected resistant genotypes of CTX - M and TEM, the positive rate were 55.81% and 55.81%, not been detected the SHV and OXA.Conclutions:Haiyang city people's hospital of producing ESBLs e.coli resistance significantly higher than non-producing ESBLs e.coli, producing ESBLs strains carrying resistance genes is given priority to with CTX-M.
[Key words]ESBLs;Escherichia coli;resistance genes
引言
大肠埃希菌是革兰氏阴性杆菌中造成医院感染的主要致病菌之一，可以造成病人各种部位的感染。近年来，随着抗菌药物广泛使用，以及一些临床医生对抗菌素的滥用，产ESBLs菌株的逐年增加，这已近引起了国家各级卫生机构的高度重视。本研究针对海阳市人民医院96株大肠埃希菌产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株进行耐药比较及相关耐药基因型测定。现报告结果如下。
材料与方法
1.材料
1.1菌株来源与质控菌株 菌株来源于2014年海阳市人民医院临床分离的96株大肠埃希菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。
1.2主要仪器与试剂 VITEK2 COMPACT微生物自动分析仪，PCR紫外凝胶成像系统,各种电泳缓冲液PCR引物和Taq DNA聚合酶等。
2.方法
2.1菌株鉴定及药敏测定 所有菌株通过VITEK COMPCT微生物全自动分析仪进行鉴定和药敏试验。将仪器筛选出的产ESBLs的菌株采用双纸片协同试验进行确认。计数资料采用卡方检验进行统计分析,p<0.05具有统计学意义。
2.2 PCR模板制备 将-41℃保存的产ESBLs大肠埃希菌菌株分别接种于血琼脂平板上，在二氧化碳培养箱中过夜培养16-18小时。培养出的单个菌落直接作为模板使用。
2.3引物设计
TEM F:5’-ACGACATTCGTCAACTGCAA-3' 414bp
R:5’-TAAATTGGCACCCTGTAGGC-3'
SHV F:5’-TCTCCCTGTTAGCCACCCTG-3' 592bp
R:5’-CCACTGCAGCAGCTGCCGTT-3'
CTX-M F:5’-TGCGGTATTATCCCGTGTTG-3' 343bp
R:5’-TCGTCGTTTGGTATGGCTTC-3'
OXA F:5’-GTCTTTCAAGTACGGCATTA-3' 822bp
R:5’-GATTTTCTTAGCGGCAACTTA-3'
2.4 PCR扩增
PCR反应体系共30μl，包括0.2μlPremix Taq酶，3.0μl引物，牙签挑一点菌落作为DNA模板，21.4μl无菌双蒸水,3μl 10×Buffer。PCR扩增条件：94℃预变性7min，变性94℃30s，复性55℃30s，延伸72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。然后将扩增产物点样于1.2ml/dl琼脂糖凝胶上进行电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察结果。
结果
1.菌株分布
经调查表明，来自于临床标本的96株大肠埃希菌中有43株为产ESBLs菌株，主要来源于普外二科，构成比为25.58%。标本主要来源于脓液和血液，分别为18株和13株，构成比分别为41.86%、30.23%。
2.产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌耐药情况比较
研究结果表明，来源于该医院的96株大肠埃希菌中，产ESBLs菌株耐药性明显高于非产ESBLs菌株。二者对9种药物耐药性具有显著的统计学意义（P<0.05）。九种药物分别为阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢替坦、头孢西丁、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和复方新诺明。产ESBLs菌株对氨苄西林和头孢唑啉耐药性为100%；氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明耐药率皆大于60%。对阿米卡星、厄他培南、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦尚有良好的敏感性。非产ESBLs菌株对氨苄西林耐药性为77.4%；复方新诺明耐药性54.7%；对阿米卡星、头孢西丁、亚胺培南和帕拉西林/他唑巴坦敏感率为100%。
3.产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结果
在43株产ESBLs大肠埃希菌中有24株携带CTX-M基因，3株携带TEM基因，其中有2株同时携带如上两种基因。未检测出SHV和OXA两种基因。产ESBLs大肠埃希菌CTX-M与TEM两种耐药基因PCR扩增片段凝胶分析分别见图1和图2，扩增片段大小与设计一致。
讨论
大肠埃希菌是最为常见的产ESBLs革兰氏阴性杆菌之一。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）产生及播散给临床抗感染治疗带来极大挑战，是新一代β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。它不仅可水解普通β-内酰胺抗菌素的β-内酰胺环,而且对耐酶的广谱β-内酰胺抗菌素尤其是头孢他啶和氨曲南等新型广谱头孢菌素的β-内酰胺环亦有水解作用［1］。本研究中显示产ESBLs大肠埃希菌对氨曲南耐药率为65.1%，对头孢他啶耐药率为34.9%，皆有较高的耐药性。
ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX-M型和OXA型等，大多数为TEM型和SHV型。 CTX-M型酶能水解绝大部分头孢菌素，典型的CTX-M型酶对头孢噻肟具有超强水解能力，而对头孢他啶中低度耐药，还有一种为变异型CTX-M型酶，可以将头孢他啶水解。TEM型酶是由TEM-1和TEM-2的基因发生突变造成1-4个氨基酸改变而形成的一系列酶蛋白。该基因由质粒介导，主要引起细菌对β内酰胺类抗生素耐药［2］。近年来,CTX-M型逐渐成为我国主要流行亚型［3］。本研究显示本院43株产ESBLs大肠埃希菌中有24株携带CTX-M基因，占55.8%，是本院产ESBLs菌株的主要基因型；有3株携带TEM基因，占6.98%。符合近年来我国产ESBLs菌株主要流行型别。
我院分离的96株大肠埃希氏菌中产ESBLs菌株共43株，阳性率为44.79%。比申月静等［4］在文献中报道产ESBL大肠埃希菌阳性率55.6％低，比天津市红桥医院［5］报道的21.7％要高，比范雪莲等［6］报道2013年广东省海珠区妇幼保健院产ESBLs大肠埃希菌检出率为61.3%低，比王兴林［7］等报道贵州黔西南州产ESBL大肠埃希菌检出率为29.33％高。大肠埃希菌也是医院感染常见的病原菌，可引起肠道外感染。本次研究结果显示,大肠埃希菌可引起各种部位器官感染,包括伤口感染、泌尿系感染、血液感染等,最主要是伤口感染和血液感染。产ESBLs菌株主要来自于主要来源于普外二科、ICU、妇科和肾内科。
产ESBLs大肠埃希菌耐药情况越来越严重，院内感染管理科和临床医生应当重视病原学检查,对已经感染产ESBLs菌株的患者进行隔离治疗，加强临床诊疗环境的检测，重视手卫生，避免医患、患者之间相互传染，防止产ESBLs大肠埃希菌在全院的流行甚至暴发流行。重视实验室病原菌药物敏感性试验，临床医生养成根据药敏结果选择和及时更改抗生素的用药习惯，合理使用抗生素，避免滥用。
参考文献
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[3]张玲.产ESBLs腹泻病原菌的耐药性和分子流行病学研究［D］.中国人民解放军军事医学科学院,2008.
[4]申月静,兰英华,李用国.产超广谱β－内酰胺酶大肠埃希菌感染分布和耐药性的分析［J］.国际检验医学杂志,2014,35（17）.
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[6]范雪莲,林海标,黄惠伦,王淑媛,赖兆新,谭少葵,容永忠,王建兵.442株大肠埃希菌临床感染分布及耐药性分析［J］.国际检验医学杂志.2014（23）
[7]王兴林,文德学,李莹.大肠埃希菌产超广谱β－内酰胺酶的基因型研究及耐药分析［J］.中国卫生检验杂志,2014（24）.
论文作者:王淑凤1，2,邢金磊2 周齐 2
论文发表刊物:《医师在线》2016年7月第13期
论文发表时间:2016/9/20
标签：菌株论文; 大肠论文; 耐药性论文; 海阳市论文; 基因论文; 头孢论文; 氨苄西林论文; 《医师在线》2016年7月第13期论文;