袁燕[1]2004年在《MT及其突变体aa基因在水花生中的整合与表达》文中研究指明哺乳动物金属硫蛋白(Metallothionein，简称MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，在动物体内主要参与必需金属离子的代谢和有毒重金属的解毒等过程。小鼠MT-I具有α和β两个结构域，它们不仅在结构和功能上具有相对独立性，而且对某些重金属具有不同的亲和力：其中α结构域对Cd~(2+)等离子的结合力要大于β结构域，而对于Zn~(2+)等离子正好相反。本实验室利用蛋白质工程技术获得了含有两个α结构域的重组体蛋白α-KKS-α，并在体外证明了其对Cd等重金属的亲和力强于天然MT蛋白。本工作利用植物基因工程的方法，使MT及其αα蛋白在水花生中表达，期望在体内研究αα的生物学功能；并且利用MT解毒重金属的特性，提高水花生对Cd等重金属的抗性和积累能力，从而开发出新型植物用于环境重金属污染的生态修复。 1．水花生组织培养的研究 以水花生为试材，将水花生的不同器官外植体接种在不同基本培养基和添加不同激素种类及其浓度配比的培养基中培养，研究外植体、培养基、外源激素对愈伤组织诱导的影响。水花生的茎段、叶、根作为外植体，以1／2 MS、B_5、MS(1／2)和MS为基本培养基，附加不同浓度的外源激素：BA 0.5～5.0 mg／L，ZT 0.5～4.0 mg／L，NAA 0～0.2 mg／L，IAA 0～0.5 mg／L。实验结果表明，作为培养基1／2 MS比B_5、MS(1／2)和MS更适合愈伤组织的生长；茎、叶为适宜组培的器官，并且茎段优于叶；BA、ZT、NAA、IAA的各种组合均可启动外植体的脱分化过程，导致叶和茎段愈伤组织的产生和增殖，NAA不变，随BA浓度上升，愈伤组织的诱导率上升。NAA／BA的比值越大越有利于根的分化。 2．水花生遗传转化体系的建立 以水花生生长点为材料，研究了农杆菌介导的水花生生长点的转化体系。实验表明，4.0 mg／L PPT或150 μmol／L Cd~(2+)可以作为水花生生长点芽分化的选择压，当农杆菌的浓度为OD_(600)=0.2～0.4时，农杆菌浸染10 min左右，水花生生长点PPT抗性芽的再生频率最高，达到70％左右。通过以上实验，建立了水花生生长点遗传转化体系。 3．金属硫蛋白MT及其αα基因在水花生中的整合与表达 鉴定了含有MT及其αα基因的植物高效表达载体，冻融法转入农杆菌EHA105，通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸染水花生生长点的方法，将MT及αα基因导入水花生中，在含有除草剂或镉的培养基上筛选，获得抗性植株。转化生长点不需要经过愈伤组织阶段而直接从生长点再生成芽，在不含有植物激素，附加4.0 mg／LPPT或150μmol／L Cd~(2+)的1／2 MS培养基上再生频率较高，但是生长点的转化频率极低。在所有的转化实验中，共浸染了1364个生长点，通过PCR和Dot blot印迹分析仅得到两株转基因植株，初步证明通过农杆菌浸染水花生生长点的方法可以使MT及其αα基因在水花生中进行整合和表达。比较对照、转MT及其αα基因的植株对重金属Cd的抗性，发现转基因植株对Cd的抗性高于对照。转MT及其αα基因的植株在300 μmol／L Cd~(2+)中均能正常生长，而对照在300μmol／L Cd~(2+)中生扬州大学硕士学位论文长就受到了抑制。 4.Cd2+污染对水花生生理生化指标的影响通过设置不同C矛+污染浓度的水体，研究了cd2+污染对水花生(A Iternanthera Philoxero比les洲art.)Griseb.)生理生化指标的影响.实验结果显示，Cdz+各处理浓度均抑制水花生生长，C矛+处理最初诱导SOD、POD活性升高，但随浓度加大、时间延长，酶活性急剧下降;CAT活性持续降低，MDA大幅度上升是cdz+培养水花生突出的生理变化之一，450 omo讥Cd2+培养sd时MDA为对照的346%.
贺绍君[2]2008年在《转MT基因水花生重金属富集能力研究》文中研究指明水花生广泛分布于淡水生境中,与其他植物相比,抗逆性强、生长迅速、繁殖能力强,具有广泛的适应性和顽强的生命力,对重金属有一定的耐受和吸附能力。哺乳动物金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在动物体内主要参与必需金属离子的代谢和有毒重金属的解毒等过程。它具有α和β两个结构域,这两个结构域不仅在结构和功能上具有相对独立性,而且对某些重金属具有不同的亲和力。重金属污染是目前人们广为关注的世界性问题。随着工业化、城市化的不断推进,排出的含有重金属的废水废气废渣量大幅度增加,污染了土壤和水源,在不同程度和范围内影响人们的生产和生活。用基因工程等生物技术手段能使重金属的高积累因子转移至生长良好的、非食用的植物上,使植物耐受和吸附重金属的能力得到进一步的改善与提高,可以用来提高植物对污染土壤、水源的生物修复效率。本实验对转MT基因水花生进行了耐性研究,以及重金属的富集能力的研究,揭示了转MT基因水花生在吸附和富集有害重金属Cd和Hg方面比非转MT基因水花生具有明显的优势。研究的主要内容包括:转MT基因水花生遗传稳定性检测、转MT基因水花生重金属耐受实验、转MT基因水花生重金属富集实验。通过对根癌农杆菌介导的转MT基因的水花生再生植株进行遗传测定,PCR检测45株转MT基因后代,其中有36株为阳性,证明了转入的金属硫蛋白基因在水花生能够遗传。以转MT基因水花生为试验材料,以直接从自然界中得到的无菌苗为对照,分别设计不同重金属浓度的MS培养基,观察其对重金属汞和镉的耐受能力。结果显示,转MT基因水花生在相同重金属环境中生长状态比无菌苗生长状态好;致转MT基因水花生全部死亡的重金属浓度比致无菌苗全部死亡的重金属浓度高,证明了转MT基因水花生能够提高对重金属的耐受能力。对转MT基因水花生吸附和富集重金属镉的能力进行测定,根据自然界重金属镉、汞的污染程度,对培养基分设了两个重金属污染的浓度,分别用石墨炉原子吸收法和原子荧光法测定水花生中重金属镉、汞的含量,并与天然植株对比。结果显示,当添加CdCl_2浓度为40mg/L时,转MT基因水花生根富集重金属能力明显高于无菌苗(P＜0.01),转MT基因水花生茎叶富集镉能力高于无菌苗(0.01＜P＜0.05);当添加CdCl_2浓度为20mg/L时,转MT基因水花生根和茎叶富集镉能力均明显高于无菌苗(P＜0.01)。当添加HgCl_2浓度为0.6mg/L,转MT基因水花生茎叶汞富集能力明显高于无菌苗(P＜0.01):添加HgCl_2浓度0.4mg/L,转MT基因水花生根汞富集能力明显高于无菌苗(P＜0.01),转MT基因水花生茎叶富集重金属能力高于无菌苗(0.01＜P＜0.05)。说明转MT基因水花生能提高对重金属的吸附能力,为重金属污染土壤、水体、湿地的治理与修复提供科学依据,能够使科研成果更好的应用于生产实践。
参考文献：
[1]. MT及其突变体aa基因在水花生中的整合与表达[D]. 袁燕. 扬州大学. 2004
[2]. 转MT基因水花生重金属富集能力研究[D]. 贺绍君. 扬州大学. 2008