（昆明医科大学第二附属医院烧伤科 云南 昆明 650101）
【摘要】 目的：探讨烧伤合并内毒素血症对血小板数量变化及骨髓细胞凋亡的影响。方法：采用小鼠总体表面积(TBSA)20%Ⅲ度烧伤合并内毒素(1μg/g体重)腹腔注射后动物模型，观察1周内小鼠外周血小板数量的变化并使用骨髓细胞原位凋亡检测(TUNEL)法观察骨髓细胞凋亡。结果：烧伤合并内毒素注射后12h内,血小板数量略增多，3～7天血小板总数显著低于对照组，烧伤合并内毒素组3天内骨髓细胞凋亡严重,骨髓凋亡率高于对照组，烧伤注射后早期,可见较多的凋亡阳性细胞。结论：烧伤合并内毒素血症早期就出现骨髓凋亡严重，外周血小板减少，与单烧组、单注组比较,具有抑制出现时间早、程度重、持续时间长的特点。
【关键词】 烧伤;内毒素血症;骨髓;血小板
【中图分类号】R644 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0216-03
严重烧伤患者常因感染、肠源性感染内毒素易位等多种因素合并内毒素血症，是多器官功能衰竭的重要原因。烧伤合并内毒素可能对骨髓产生重要作用，对骨髓造血发生抑制，加重骨髓细胞的凋亡，从而影响外周血小板的生成。本研究观测了20% TBSAⅢ度烧伤合并内毒素(1μg/g体重)腹腔注射后1周内小鼠血小板的动态变化及骨髓细胞细胞凋亡变化，从内毒素骨髓抑制探讨烧伤引起血小板减少的原因。
1.材料与方法
1.1 实验动物分组和致伤
1.1.1动物分组 7～10周龄健康小鼠95只,体重22～24g(昆明医学院动物科提供), 将实验小鼠95只随机分为烧伤合并内毒素注射组（烧注组）、单纯烧伤组（单烧组）、单纯内毒素注射组（单注组）、每组每个时相点各5只小鼠，共90只小鼠，伤后6小时、12小时、1天、3天、5天、7天活杀取材, 其余5只注射生理盐水作为对照（对照组）。
1.1.2动物致伤 小鼠20%TBSAⅢ度体表烧伤按文献方法进行[1]。烧注组于烧伤后立即腹腔注射纯化脂多糖(LPS按1μg/g体重,2ml无菌生理盐水稀释)建立烧注组的实验动物模型；单烧组于烧伤后立即腹腔注射2ml无菌生理盐水；单注组除不造成体表烧伤外,余同烧注组；对照组动物背部脱毛后腹腔注射2ml无菌生理盐水。
1.2 外周血小板的计数
建立实验动物模型后，按照实验设计时相点，摘除小鼠一侧眼球,取血1ml,加入带肝素抗凝试管,于全自动血细胞计数仪上计数血小板。
1.3 骨髓凋亡的检测
小鼠颈椎脱臼法处死动物,剥离出股骨、剪断，将其断面的骨髓挤在有稀释液的玻片上，混匀后涂片，甲醛熏蒸固定5分钟，流水洗净，自然风干，进行TUNEL标记后进行细胞检测。TUNEL 标记阳性细胞：观察细胞核及细胞质层次,细胞棕黄色标记的为阳性细胞,可因早期、中期和晚期凋亡而深浅不一。
2.计数方法
光镜下观察每张骨髓涂片头、体、尾，计数100个有核细胞中的阳性细胞数。TUNEL 法标记凋亡细胞阳性指数(简称凋亡率,apoptosis index, AI) = (凋亡阳性细胞数/ 100个细胞) ×100 %。
3.结果
3.1 血小板的变化
烧注组血小板伤后6、12小时略高于对照组无差别，但很快就下降，伤后1天达最低水平，第7天仍低于对照组，并于伤后1、3天显著低于单烧组和单注组。单烧组伤后6、12小时略有升高，以后开始下降，于伤后1、3、5天低于对照组。单烧组在伤后1、3低于单注组，单注组在伤后1、3低于对照组。见表1。
3.2 骨髓细胞原位凋亡的变化
TUNEL 标记阳性细胞特征：细胞核呈现特征性、深浅不一的棕黄色。细胞核及细胞质层次清楚。早期凋亡；棕黄色标记物呈细沙样散在于细胞上，染色质凝集，仅在核膜边缘呈现新月形式冠状棕黄色标记物，颜色较浅。中期凋亡；染色质固缩，颗粒状棕黄色标记物逐渐波及整个胞核，颗粒粗大，颜色较深，核形态仍完整。晚期凋亡；呈深棕色标记，可见核碎裂，或出现散在凋亡小体（见下图）。
TUNEL法检测结果显示：烧注组6、12小时1、3天小均可见较多的凋亡细胞，凋亡率显著高于对照组，以后至7天凋亡数量逐渐降低基本同正常对照组，6、12小时、1天凋亡率高于单注组。单烧组6、12小时3天小时可见散在分布的凋亡细胞，凋亡率显著高于对照组，单烧组6、12凋亡率高于单注组。单注组伤后6、12小时可见散在分布的凋亡细胞，凋亡率显著高于对照组，1天后凋亡细胞逐渐减少，7天仅偶见凋亡细胞同对照组。正常对照组偶见凋亡细胞。见表2
4.讨论
临床上，严重烧伤病人常因多种原因合并内毒素血症，是引起全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍(MODS)的重要原因之一[2]。严重烧伤后常引起机体各个组织器官功能受损，骨髓造血系统也常常受损器官，结果导致骨髓造血功能紊乱。其中血小板的变化是严重烧伤后造血系统的常见变化之一，严重烧伤后血小板数量和功能的降低，是引发机体出血、感染、多器官功能衰竭的重要因素。Koch[3]认为血小板计数可作为预测MODS的简易实验室指标。
严重烧伤后，由于感染，肠内细菌移位内毒素释放，骨髓造血受到抑制，致使骨髓巨核细胞成熟分化受到影响，从而造成外周血小板生成减少。本实验TUNEL法检测结果显示烧注组、单烧组、单注组1天内骨髓可见较多的凋亡阳性细胞，随着时间的推移，凋亡数量的逐渐减少，第7天时凋亡数量仍较正常组高。实验结果表明，烧伤合并内毒素注射可诱导骨髓细胞坏死和凋亡，是骨髓造血功能障碍的原因之一。严重烧伤骨髓造血功能障碍的原因可以从两方面考虑，一是致伤因子对骨髓细胞的致死性损伤，另一方面是致伤因子对存活细胞的亚致死性损伤。致死性损伤因素导致骨髓细胞溶解坏死，或是通过凋亡而消亡。关于烧注后早期骨髓细胞凋亡的机制目前尚不清楚，可能与内毒素和早期炎症介质(如TNF-α、NO)大量释放等因素有关。有关研究表明，内毒素可诱导多脏器、多细胞凋亡发生[4-5]。TNF-α、NO对正常造血干/祖细胞和白血病细胞均表现出强烈的抑制活性，并且与其诱导细胞凋亡密切相关。亚致死性损伤实际就是造血细胞的增殖分化抑制， 烧伤感染后骨髓造血细胞成熟受阻问题。
本实验通过研究外周血小板发现，烧伤合并内毒素注射后3小时，单烧后3～6小时外周血小板略增多，同时该时间段骨髓凋亡严重，但血小板却略增高，这可能与烧伤后早期LPS、PAF和TNF-α等炎性介质刺激[6]，烧伤后血液浓缩、加快骨髓贮备池和外周血边缘池释放血小板增多等多种因素有关。而后期持续低于正常水平则主要与造血功能障碍有关[7]。补液休克期过后，血小板进行性下降，变化趋势与骨髓凋亡变化趋势一致，据此推测血小板减少可能主要与毒血症骨髓抑制有关。通常情况下，血小板来自骨髓巨核细胞前体，外周血中血小板计数保持一定水平。近来有研究发现严重烧伤引起大鼠骨髓巨核细胞退变，中性粒细胞进入巨核细胞胞浆内将巨核细胞被噬现象，也表明了由于骨髓巨核细胞减生成抑制[8]，导致了血小板生成受到了影响。其次，严重烧伤后大量血小板在损伤组织内粘附、聚集，消耗了大量的血小板，致使外周血中血小板减少也是血小板减少的原因。
本实验结果表明烧伤合并内毒素血症条件下骨髓造血功能明显受抑制， 可能是引起血小板减少的主要原因之一。在烧伤临床中发现，烧伤患者血小板的计数变化与其病情的变化密切相关:烧伤面积越大，病情愈重，血小板降低越明显，随着病情的恢复和好转，血小板逐渐回升;且烧伤面积越大，烧伤程度越深，在较高范围内波动时间越长。因此，临床上，重度烧伤患者早期积极进行抗休克、抗感染、纠正酸中毒等常规治疗下，积极早期进行切削痂、创面植皮，阻断毒素和炎症递质自创面入血，降低血中毒素和炎症递质的含量，减轻其对血管内皮细胞的损害，从而有效地遏制炎症的级联反应，是减少SIRS发生的关键。
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基金项目：云南省卫生厅内设机构研究项目（2009NS087）
论文作者:韩亚龙,陈宗华,魏迪南,刘文军,支燕,杨晖,韩大
论文发表刊物:《医药前沿》2016年2月第6期
论文发表时间:2016/5/23
标签：烧伤论文; 骨髓论文; 内毒素论文; 细胞论文; 凋亡论文; 血小板论文; 小鼠论文; 《医药前沿》2016年2月第6期论文;