周航
（中国航空工业成都363医院四川成都610041）
【摘要】目的：研究柴胡皂甙D对A549细胞的抑制作用及机制。方法：TUNEL法检测凋亡，免疫组化测P53表达，测P38MAPK的表达。结果：不同浓度的柴胡皂甙D对A549均有抑制作用，其P53表达并无差异，SSD明显上调P38MAKP表达。结论：SSD能诱导A549细胞的凋亡，有活化上调P38MAPK的核内表达作用，抑制A549于G0/G1期从而阻断其进入增殖周期而抑制肺癌A549细胞的生长。
【关键词】柴胡皂甙D;TUNEL;P53
【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)05-0051-02
1资料与方法
11材料
111试剂与仪器:DMEM培养基，01%胰酶,台盼蓝干粉，二甲基亚面砜(DMSO),新生牛血清(四季青公司)，TUNEL凋亡试剂盒(美国罗氏公司)，兔抗人P53单克隆抗体，辣根酶标记鼠抗兔抗体(均购自北京中杉公司)，全反式维甲酸（sigma公司产品）：ATRA先配制成浓度为10-1mol/ml浓度。TE2000-U型倒置显微镜(日本尼康)。SSD购自成都思科华公司。
112细胞及培养:A549细胞株是由某医院赠送。其细胞的形状有多边形和长方形组成,细胞的形状比较饱满，细胞核强大，沿壁长处。选择小牛血清约10%的用量，青霉素和链霉素是100U/ml的的DMEM培养液于5%和37度的二氧化碳，放在温度适宜的培养箱中进行培养，原代胰酶消化液（01%），平均每3天传一次，然后观察显微镜下的细胞发展进度及变化。
12方法
121选择:TUNEL法检测细胞凋亡，采用每75μg/ml的后24小时候观察SSD反应结果,最后待48小时稳定后取出细胞爬片备用，PBS用后及时清洗出来洗一次，放在常温约15～25℃的温度以下和4%的多聚甲醛在室温为15~25℃下用4%的多聚甲醛固定1小时，PBS洗三次，3%过氧化氢封闭10分钟，PBS洗三次，2分钟作用起作用01%的triton x-100，PBS在清洗一次后放入配好的反应液，在1小时孵育温度在37℃应避光，加入一滴PBS后于荧光镜下检测荧光。
122免疫组化测P53表达:制细胞爬片，用每75μg/ml的后24小时候观察SSD反应结果,最后待48小时稳定后取出细胞爬片备用，PBS用后及时清洗出来洗一次，室内温度下在固定的时间20分钟内室温下用下用4%的多聚甲醛固定，粘片，PBS洗三次，3%过氧化氢作用30分钟，PBS洗三次，3%过氧化氢封闭10分钟，PBS洗三次，15分钟作用起作用01%的triton x-100，PBS洗三次，将血清在30分钟内封闭完，丢掉，加入老鼠抗人单克隆抗体，放在湿盒中，然后将其放在4℃冰箱内12小时，12小时过后将其在冰箱中取出存放在常温下约1个小时左右，PBS洗三次，加入酶标二抗，观察其DAB的变化。
123P38MAPK:在200倍放射镜下随机抽取5个视野，其中阳性细胞反应显示胞核内有棕褐颗粒，然后计算出阳性细胞的百分比。
124统计学处理方法:采用SPSS110统计软件，组间计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验。
2结果
21TUNEL法检测凋亡。
22SSD对P38MAP Kinase表达的影响。
本表检查标准α=0005，结果显示SSD能够上调P38MAPK核内表达丰度，见表1。
3讨论
柴胡是伞形科多年生草本，复伞形花序多分枝，顶生或侧生，梗细，常水平伸出，形成疏松的圆锥状，柴胡始载于《神农本草经》，列为上品。历代本草对柴胡的植物形态多有记述。其主要作用有感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱落、月经不调。其药理性较强，也有研究发现可有抑制癌症肿瘤等作用［1］。
TUNEL荧光经过试验后测试显示，75μg/ml的SSD可以当做A549时，细胞有明显的变化显示死亡，随着时间的增长，死亡细胞逐渐增多。结果显示对照组中的阳性发生死亡率较少，甚至没有发现死亡物体。提示SSD对A549细胞的抑制作用是通过诱导细胞发生凋亡这一途径。
P53是在细胞死亡过程中最为常见和动摇的途径，在试验中显示结果可见，A549细胞在SSD反应中在一定时间内（24至48小时质检）进行阳性对比，其P53显示均较高，没有较大变化，提示SSD对A549细胞的抑制作用并不是通过P53这一途径，具体结果要进行下一步有待详细研究。P38MAPK是MAPKs的亚类常见之一。经过现代多个国家及人员显示研究结果细胞株内P38MAPKs都可以将细胞G1/S检验点，继而调控细胞增殖、分化和凋亡［2］。本研究结果显示表明，SSD激活P38MAPK具有良好效果,结果表明,SSD是最好以10mg/L和25mg/L是相对贫穷。所以可能存在的机制由于P38MAPK激活并提高了其被动抑制肺腺癌A549细胞的在G0/G1期和停止分裂增殖周期的过程,通过周期抑制而达到促进调亡的作用。
参考文献
［1］步世忠，许金康，孙继虎，等. 柴胡皂甙D上调人急性早幼粒白血病细胞糖皮质激素受体mRNA对细胞生长的影响［J］.中国中西医结合杂志，2000,20（5）：350-352。
［2］陈奕，缪泽鸿，丁健.P38MAPks在细胞周期调控中的作用［J］.生理科学进展，2004，35（4）：315-320
论文作者:周航
论文发表刊物:《河南中医》2013年4月第1期供稿
论文发表时间:2014-3-18
标签：细胞论文; 柴胡论文; 作用论文; 抑制论文; 放在论文; 小时论文; 多聚甲醛论文; 《河南中医》2013年4月第1期供稿论文;