湖南省长沙市第三医院普外科 湖南长沙 410015
【摘 要】目的：探讨奥曲肽（Octreotide，OCT）对甲状腺癌细胞株（BHT101和8305C）增殖、凋亡的影响。方法：通过western blot方法检测BHT101和8305C细胞中SSTR2受体表达情况，通过MTT实验检测OCT对BHT101和8305C细胞体外增殖的影响；通过动物模型检测OCT对BHT101和8305C细胞体内增殖的影响；通过Annexin V/PI双染法检测OCT对BHT101和8305C细胞凋亡的影响；通过流式细胞仪技术检测OCT对BHT101和8305C细胞周期的影响；通过western blot试验检测细胞内p21和caspase-3的表达水平。结果：OCT在体内和体外均可以抑制BHT101和8305C细胞增殖，且具有浓度依赖性；OCT可以诱导BHT101和8305C细胞凋亡；OCT可以诱导细胞周期阻滞于G1期，OCT可以激活p21、还能上调caspase-3蛋白表达水平。结论：本研究通过体外实验初步验证OCT对甲状腺癌细胞生长的抑制作用，并证实了OCT对甲状腺癌细胞生长的抑制作用主要是通过诱导细胞凋亡和周期阻滞导致。
【关键词】奥曲肽；甲状腺癌；细胞周期；细胞凋亡
[Abstract] Objective：To evaluate the effects of Octreotide（OCT）on growth and apoptosis of thyroid cancer cell lines（BHT101 and 8305c）. Methods：The expressions of SSTR2 in BHT101 and 8305c cells were examined by western blot assay. The effects of OCT on proliferation of BHT101 and 8305c cells were examined using MTT assay. The xenograft tumor models were constructed to evaluate the effects of OCT on growth of BHT101 and 8305c cells in vivo. The effects of OCT on apoptosis of BHT101 and 8305c cells were examined using Annexin V/PI double staining assay. The cell cycle was examined using Flow cytometry analysis. In addition，the expressions of cell-cycle-related and apoptosis-related proteins were examined using western blot assay. Results：OCT significantly inhibited the growth of BHT101 and 8305c cells in vivo and in vitro. OCT induced apoptosis and cell cycle arrest of BHT101 and 8305c cells. Further analysis showed that OCT promote apoptosis of BHT101 and 8305c cells by activating p53 and p21，and up-regulating Bax，cytosolic cytochrome C and caspase-3，and down-regulating bcl-2. Conclusion：Our data demonstrated that OCT can inhibit the growth of BHT101 and 8305c cells，and may serve as a potential drug for thyroid cancers.
[Key Words]：Octreotide，thyroid cancer，cell cycle，apoptosis
引言
按照病理类型，甲状腺癌可以分为乳头状腺癌、滤泡状腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺未分化癌，其中甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）约占甲状腺癌7%~8%，是恶性程度最高的类型，其发展迅速，浸润性生长，早期转移，多数患者在确诊时已经出现了远处转移，因此它也是所有类型中预后最差的一种，一经诊断平均仅数月月的生存期[1]。甲状腺未分化癌的治疗方法不多，对于局限性的肿瘤可以采用手术治疗，但是单纯依靠手术治疗的患者生存率很低，联合术后辅助放化疗可以明显提高晚期患者的肿瘤控制率和生存率。阿霉素、顺铂、5-FU、紫杉醇、长春瑞滨、依托泊苷是用于甲状腺未分化癌化疗的常见药物。但耐药蛋白诱导的多药耐药常影响临床化疗疗效，因此探索新型药物对于甲状腺未分化癌化疗显得尤为重要。
近年来学者们发现生长抑素可以显著抑制一些内分泌系统肿瘤的生长，如垂体瘤、胃泌素瘤、胰岛素瘤[2]。甲状腺癌同样也是属于内分泌系统的恶性肿瘤，其发病与激素分泌有紧密关系；并且有研究发现，甲状腺癌组织中存在生长抑素受体表达，其中各生长抑素受体亚型SSTR1-5在不同类型甲状腺癌组织中表达水平还各不相同，提示生长抑素及其类似物可以作为甲状腺癌化疗的潜在有效药物[3]。并且，有研究报道了奥曲肽在体外可以抑制甲状腺髓样癌细胞株FTC133、FTC236和FTC238的增殖，但是在体内却无法抑制它们的增殖[4]。但并未深入研究其中的机制，而且目前关于生长抑素及其类似物在甲状腺未分化癌中的应用状况尚未见报道，因此我们在本研究中首先检测各SSTRs在甲状腺未分化癌细胞BHT101和8305c中的表达水平，然后探讨生长抑素类似物奥曲肽（octreotide，OCT）对BHT101和8305c细胞生长和凋亡的影响，为今后临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1材料
人甲状腺未分化癌细胞株BHT101 [5]和8305C[6]购买自中科院上海分院细胞所细胞库；OCT购自瑞士Novartis公司；DMEM细胞培养液购买自美国Gibco公司；胎牛血清购买自美国Hyclone公司；青链霉素购买自美国Sigma公司；MTT试剂购买自美国Sigma公司；FITC-Annexin V/PI双染试剂盒购买自美国BD生物公司；核蛋白提取试剂盒购买自美国Novagen公司；所有蛋白抗体均购买自美国santa cruz公司，PVDF膜购买自美国Millipore公司，ECL化学发光试剂盒购买自中国碧云天公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养
BHT101和8305C细胞株常规培养在含10％胎牛血清、1%青、链霉素的DMEM培养基中，在5％CO2，37℃条件的细胞培养箱中培养，至培养基中细胞贴壁生长。当细胞汇合程度达80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化传代，继续按上述方法培养。通常每天换液，三天传代。
1.2.2 MTT试验
采用MTT试验检测OCT对BHT101和8305C细胞增殖的影响。OCT采用培养基溶解，现用现配，应用浓度分别为0，0.01，0.1，1，10，100μM。收集对数期生长的细胞5×103个/孔，接种至96孔板培养过夜，加入上述浓度OCT放置于培养箱中共同孵育72h，然后去掉培养基，每孔加MTT溶液（5 g/L）20μL处理4 h，然后去掉MTT溶液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）100 μL，避光振荡10 min。然后采用酶标仪测定490 nm波长处的吸光值（OD值）。细胞生长抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。然后计算OCT对两种细胞的IC50值，并在后续细胞周期、凋亡和western blot试验中应用的药物浓度为两种细胞的IC50值浓度。
1.2.3 动物模型试验
选择年龄4周、体重25g左右的裸鼠饲养于SPF级环境下。在饲养一周后，采用BHT101和8305C细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型。采用胰蛋白酶消化收集对数生长期细胞。将5×106个细胞悬置于200uL培养基中，用无菌注射针筒将细胞注射于裸鼠腋下。接种约2-3周出现肉眼可见的米粒状大小肿块，当肿块体积增至0.5 cm3后，采用OCT尾静脉注射（100 μg/kg/天），连续注射10天。每5测量肿瘤体积一次，并绘制生长曲线。肿瘤体积计算公式如下：V=L×W2/2（cm3）。在第25天时处死裸鼠，摘除荷瘤并称重（g）。
1.2.4 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
采用 FITC-Annexin V/PI双染法检测OCT对BHT101和8305C细胞凋亡的影响。采用OCT处理24、48和72h后，根据试剂盒说明书指示收集漂浮细胞和贴壁细胞；用冷PBS冲洗两次细胞，并使之悬浮于1× binding buffer；加入FITC-Annexin V，在4℃下反应30分钟；加入PI染色15min后，在0.5h内上流式细胞仪进行检测。
1.2.5 细胞周期检测
采用流式细胞仪检测OCT对BHT101和8305C细胞周期的影响。收集对数期生长细胞接种于6孔板，加入OCT处理24、48和72h后，用4℃的70％乙醇溶液固定细胞过夜，然后加入PI（终浓度50g/mL）和RNA酶（终浓度50g/mL）染色0.5h，最后采用流式细胞仪进行检测，采用Flowjo软件对流式细胞仪数据进行分析。
1.2.6 western blot试验
在OCT作用24h时，消化收集BHT101和8305C细胞，采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，采用Bradford法检测蛋白含量。然后将蛋白样品在95°C水浴中变性并与上样缓冲液混合加到SDS-PAGE胶上，每个孔蛋白上样量保持一致。然后陆续进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、ECL发光、显影、定影。
1.2.7 统计分析
所有实验均采用统计软件SPSS14.0进行数据统计分析。所有数据均采用平均数标准差（）方式表达。t检验（t test）和单因素方差分析（One-way ANOVA）用于推测统计。以P<0.05表示具有统计学差异。所有实验均重复三次或以上。
2 结果
2.1 BHT101和8305C细胞生长抑素受体亚型表达情况
Western blot实验显示（图1），在BHT101和8305C细胞中SSTR2、SSTR3和SSTR5三种亚型表达水平较高，SSTR1和SSTR4两种亚型表达水平较低；说明OCT可以通过与SSTR2、SSTR3或SSTR5结合调控细胞增殖和凋亡。
图1 BHT101和8305C细胞中SSTRs表达情况
A OCT处理后BHT101和8305C细胞Annexin V/PI双染法流式细胞仪分析图，象限划分――左上象限为死亡细胞；左下象限为活细胞；右上象限为晚期凋亡细胞；右下象限为早期凋亡细胞；B OCT处理后BHT101和8305C细胞的凋亡比例；C OCT处理后BHT101和8305C细胞中caspase-3的表达水平变化。* 表示与对照组比较具有显著的统计学差异（p<0.05）。
3 讨论
生长抑素是具有多种生物活性的天然肽，广泛存在于中枢神经系统、胃肠道器官和组织中，调节机体许多生理和病理过程。生长抑素半衰期非常短，限制了其体内应用。因此在八十年代美国人工合成了生长抑素类似物OCT，具有比天然生长抑素更长的半衰期和更强的药效，最初主要用于消化道出血、胰腺炎、神经内分泌肿瘤及肢端肥大症的治疗。近年来研究发现，OCT不仅能抑制内分泌肿瘤的增殖，且对许多实体肿瘤，如肺癌、肝癌、胃癌]、结肠癌、胰腺癌[7]等均有抑制作用。
在本研究中，我们评估了OCT对甲状腺未分化癌细胞增殖的影响，从MTT和动物模型试验结果来看，OCT在体外和体内均能显著抑制BHT101和8305C细胞增殖。SST主要通过与细胞表面的生长抑素受体（SSTR）结合，激活下游信号通路发挥生物学功能。SSTRs包括5个亚型SSTR1-5，五种SSTR所介导的信号通路以及发挥的生物学作用不尽相同，它们与配体之间的亲和力也不尽相同，它们在各种细胞上的表达水平也不尽相同，这也导致生长抑素及其类似物在作用于各种细胞时可能会产生不同的生物学效应。在本研究中，我们发现BHT101和8305C细胞中SSTR1和SSTR2表达水平高于其他三种亚型，而有研究表明OCT与SSTR2的亲和力较强，因此OCT可能通过与SSTR2结合进而激活下游信号通路而发挥其生物学功能。
众所周知，细胞周期和凋亡是影响细胞增殖的两个重要环节，并且前期研究也显示生长抑素受体激活后可以调节周期和凋亡。因而我们在后续试验中检测了OCT对两种细胞周期和凋亡的影响。细胞周期分析结果显示，在OCT处理的不同时段，BHT101和8305C细胞G1期比例均显著增加，说明OCT能够诱导细胞发生G1期阻滞，并且p21的表达水平在OCT处理后明显增高。p21属于细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子，是一种重要的细胞周期调控蛋白，是p53的下游基因。p21一方面可以与cyclin D/cdk形成复合物阻滞细胞周期于G1期；另一方面还可以通过C端与PCNA相互作用，阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性从而抑制DNA的合成，使细胞周期停滞。OCT诱导p21蛋白表达增高，可能是导致G1期阻滞的重要原因。Taqliati F等人发现，在甲状腺髓样癌中，SST可以导致细胞出现明显的生长抑制，并且使得细胞周期阻滞于G2/M期[8]；，而我们发现OCT可以诱导两种甲状腺未分化癌出现G1期阻滞，这可能与SSTRs表达不同或受体与配体亲和力不同有关。
凋亡是细胞的一种死亡形式，属于细胞主动死亡，由细胞内多种信号通路严密调控，在机体生长发育中发挥着重要作用，对于肿瘤细胞来说，凋亡抵抗也是肿瘤不可控制生长的一个重要原因。研究显示，OCT能与SSTR2、3和5受体亚型结合，进而激活一系列凋亡相关蛋白如bax、caspase-3，-8，-9等，促进肿瘤细胞凋亡[9]。在本研究中，我们通过细胞凋亡检测发现OCT能够激活caspase-3，诱导BHT101和8305C细胞发生凋亡。这可能是OCT抑制BHT101和8305C细胞增殖的另一个重要原因。
4 结论
综上所述，本研究初步证明OCT在体内和体外均能显著抑制甲状腺未分化癌细胞株BHT101和8305C的生长，而OCT主要是通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡发挥其抑癌作用，本研究为今后临床上OCT在甲状腺未分化癌化疗中的应用提供了初步的理论依据。在后续研究将着重于研究BHT101和8305C细胞上的SSTRs与OCT之间的结合状况，并探讨所激活的下游信号通路。
参考文献：
[1]Paunovic IR，Sipetic SB，Zoric GV，et al. Survival and prognostic factors of anaplastic thyroid carcinoma. Acta Chir Belg. 2015；115（1）：62-7.
[2]Aoki T，Motoi F，Sakata N，et al. Somatostatin analog inhibits the growth of insulinoma cells by p27-mediated G1 cell cycle arrest. Pancreas. 2014；43（5）：720-9.
[3]Ain KB，Taylor KD，Tofiq S，et al. Somatostatin receptor subtype expression in human thyroid and thyroid carcinoma cell lines. J Clin Endocrinol Metab. 1997；82（6）：1857-62.
[4]Hoelting T，Duh QY，Clark OH，et al. Somatostatin analog octreotide inhibits the growth of differentiated thyroid cancer cells in vitro，but not in vivo. J Clin Endocrinol Metab. 1996；81（7）：2638-41.
[5]Pályi I1，Péter I，Daubner D，et al. Establishment，characterization and drug sensitivity of a new anaplastic thyroid carcinoma cell line（BHT-101）. Virchows Archiv.B，Cell pathology including molecular pathology. 1993；63（4）：263-269.
[6]Ito T，Seyama T，Hayashi Y，et al. Establishment of 2 human thyroid-carcinoma cell-lines（8305c，8505c）bearing p53 gene-mutations. Int J Oncol. 1994；4（3）：583-6.
[7]Ebert M，Friess H，Beger HG，et al. Role of octreotide in the treatment of pancreatic cancer. Digestion. 1994；55 Suppl 1：48-51.
[8]Tagliati F，Zatelli MC，Bottoni A，et al. Role of complex cyclin d1/cdk4 in somatostatin subtype 2 receptor-mediated inhibition of cell proliferation of a medullary thyroid carcinoma cell line in vitro. Endocrinology，2006，147：3530-8.
[9]Erlandsen SE，Fykse V，Waldum HL，et al. Octreotide induces apoptosis in the oxyntic mucosa. Mol Cell Endocrinol. 2007；264（1-2）：188-96.
论文作者:李鲲鹏
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年3期
论文发表时间:2018/9/17
标签：细胞论文; 甲状腺论文; 凋亡论文; 生长论文; 周期论文; 抑制论文; 受体论文; 《兰大学报（医学版）》2018年3期论文;