申志强1 覃琳2
广西科技大学附属卫生学校 广西柳州 545002
摘要：用MTT法测定细胞生长存活率，反映出HepG2细胞经药物Z2处理，所存活下来的数量，间接反映出药物Z2对HepG2细胞的细胞毒性的强弱，为研究药物Z2之后的药代学和药理学提供临床依据。
关键词：MTT法；药物Z2；细胞毒性；毒性试验：HepG2细胞
肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，目前已研究出来对于肝癌具有较好疗效的药物有：索拉菲尼（多吉美）、槐耳颗粒（金克）、乌苯美司胶囊、碘[131]美妥昔单抗（利卡汀）、胸腺肽a1（日达仙）等，但这些药物普遍都有较强的细胞毒性，在控制患者病情的同时也对患者身体给予的一定的损伤，并且这些药物价格通常也比较昂贵，因此寻找一种高效低毒、价格低廉的药物非常重要。细胞毒性实验是用来评价药物对疾病的药理活性及药物效果的一种十分重要的实验，目前国内外实验室广泛使用的研究方法有MTT（又称四唑盐比色法），本文通过使用MTT法来衡量药物Z2对肝癌细胞HepG2的细胞毒性，为进一步研究其抗肝癌的药效及药理提供一定的实验依据。
1 实验原理
MTT四唑盐比色法和CPE观察法用这两种方法得到的实验结果在统计学上无明显差异，但从实验的简便性而言，MTT法则更为简单直观。MTT法可用检测细胞增殖及活性的研究，也可用于细胞的筛选。其原理主要为活细胞的中线粒体含有的琥珀酸脱氢酶能与外源性的MTT反应，使其被还原为不溶于水的蓝紫色物质（甲臢），再利用DMSO（即二甲亚砜）能使生成的甲臢溶解，再通过使用酶联免疫检测仪能测定其吸光度，可间接反映出活细胞的数量。[1]在一定的细胞数范围，MTT结晶的生成量与活细胞数成正比例关系。
2 实验方法
2.1 HepG2细胞培养
将水浴锅的温度设定为37℃，从低温冰箱中取出冻存好的HepG2细胞，将其放入水浴锅内进行水浴，同时缓缓摇动，加速其融化，待冻存管内成液体状态后，将其取出并用酒精对其消毒，防止污染。将消毒好的冻存管放到超净工作台上，取出离心管加入适量培养液，反复吹打后，将冻存管内的HepG2细胞悬浮液加入到离心管内，吹匀后放入离心机（1500r/min，10min），待离心结束后，在超净工作台上操作，倒掉离心管内的上层清液，并再次加入适量的培养液后，将其装入中型培养瓶中并放入37℃，5%CO2培养箱内培养。
2.2给药
在超净工作台上用细胞培养液对待测药物Z2进行浓度的稀释，并将其配成所需要的质量浓度，分别为0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10μmol/mL，取出接种好的96孔板，每个浓度设置3个平行孔，每孔加入20μL药物，并以第一行的3个孔作为空白孔，空白孔只加入20μL的培养液，平行条件下铺2块板子，于37℃，5%CO2培养箱内培养72h。
2.3 MTT的加入
将培养好的96孔板取出，倒掉上层液体，并在每个孔内加入20μL质量浓度为0.05%的MTT试剂，于37℃，5%CO2培养箱内培养4h后取出。用1mL注射器小心地将上层液体去除，并在每孔内加入150μL的二甲亚砜（DMSO），于震荡仪上震荡10mins，待孔内的晶体溶解充分后，在酶联免疫检测仪上，570 nm处测定其吸光度OD570值。
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2.4 计算公式
HepG2细胞的细胞存活率SR（%）=实验组OD570/空白对照组OD570×100%
3 实验结果与分析讨论
3.1 药物Z2对HepG2细胞毒性实验的结果
根据所测定得到的吸光度OD值，将其换算成为细胞存活率SR值，得到表一。并根据表一数据用Excel表格进行数据处理，以细胞存活率为Y轴，药物Z2浓度为X轴作图，在分别根据组一的SR75与SR40与其药物浓度的关系和组二中的SR66与SR27与其药物浓度的关系做图，求出各组的药物浓度与存活率的回归方程，即组一：Y=-5.0000x+90.000；组二：Y=-5.5714x+82.714。将Y=50带入各式即可求出各组的IC50值，即组一的IC50=8μM，组二的IC50=5.4μM。
由美国圣约翰大学提供的药物Z2，对其进行细胞毒性试验后，根据所得到的结果，可得出以下的讨论及分析：
（1）首先进行组内的比较，结合表一从两组实验结果可以看出，随着药物Z2的浓度逐渐增加，所抑制细胞生长的活性也逐渐增高，当药物浓度从3μM增到10μM的过程中，对HepG2细胞的抑制效果均达到了50%，甚至更多，说明药物Z2对HepG2细胞的有效剂量浓度区间位于3μM到10μM之间，这为今后研究Z2这种药物的抗肿瘤的敏感性提供了一定的依据。
（2）而结合图一、图二、图三，从两组间实验结果进行比较，两组平行试验结果得到的IC50值有明显的区别，说明药物Z2的抗肿瘤活性可能会受到外界条件的干预，这也为今后研究其抗肿瘤活性的影响条件提供了一定的依据。
（3）此外，两组间试验结果虽呈现一定的不同，但其整体对细胞的抑制率的分布趋势是大体一致的，如当Z2浓度在0.01μM到1μM之间时，Z2基本对HepG2细胞没有什么抑制的作用，而当从1μ增加到3μM时，Z2的抑制细胞生长作用得到了一个明显的抑制突跃，这说明药物Z2对HepG2细胞的抑制作用是一种随Z2浓度增高，细胞存活率降低的负相关较稳定的线性抑制。
（4）总而言之，从实验结果表明，药物Z2对HepG2细胞具有一定的抑制作用，有一定的抗癌性。
结论
由结果及分析可知，使用MTT法对药物Z2进行了细胞毒性的研究，经研究发现，药物Z2在一定的浓度范围内，对细胞HepG2具有一定的抑制作用，但这种抑制作用可能会受到一定条件的影响，这种影响可能是来源于药物Z2本身的抗癌活性，也有可能是来源于实验过程中产生的误差等，所以，通过本次研究，为今后研究药物Z2的细胞毒性提供了一定方向与依据。其次，本次实验也初次证实了药物Z2具有有一定的细胞抑制作用，具有一定的抗癌性，也为今后研究药物Z2的抗癌活性提供了一定的临床指导意义及方向。
参考文献：
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论文作者:申志强1,覃琳2
论文发表刊物:《健康世界》2018年5期
论文发表时间:2018/5/24
标签：细胞论文; 药物论文; 毒性论文; 浓度论文; 抑制论文; 存活率论文; 培养液论文; 《健康世界》2018年5期论文;