一、中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp~(37)基因的序列分析（论文文献综述）
李赛男,吕怡娜,甘田,区炳明,赵海洲,刘文华[1]（2021）在《杆状病毒Ac78 N端保守氨基酸位点的功能分析》文中提出苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）的orf78 （即ac78）是杆状病毒的核心基因,在AcMNPV的生活周期中具有重要作用,作用机制未知,其编码蛋白Ac78的保守氨基酸2～25和64～88区域是Ac78行使功能的关键区域。本研究通过生物信息学分析发现,Ac78 N端第9位精氨酸残基（R9）和第22位赖氨酸残基（K22）在Ac78旁系同源物中高度保守,提示该保守位点可能在Ac78的功能中具有重要作用。通过定点突变技术分别将Ac78 R9和K22突变为丙氨酸（A）,构建了重组杆状病毒vAc78R9A:HA和vAc78K22A:HA,将病毒DNA分别转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞Sf9。经荧光显微镜观察和病毒生长曲线分析发现,在vAc78R9A:HA转染的Sf9细胞中产生的感染性芽生型病毒粒子（budded virion, BV）与ac78全长补回型重组病毒（vAc78:HA）相当,而vAc78K22A:HA转染的Sf9细胞中产生的感染性BV的产量与vAc78:HA相比下降约100倍;电镜观察实验表明,vAc78R9A:HA转染的Sf9细胞中能正常形成多粒包埋型病毒粒子（multiple nucleocapsidenveloped occlusion-derived virion, M-ODV）和包埋有M-ODV的多角体,与vAc78:HA的现象一致,而vAc78K22A:HA转染的Sf9细胞中产生的M-ODV显着减少,单粒包埋型病毒粒子显着增加。综上所述,Ac78的N端保守位点R9对于Ac78在BV产生和M-ODV形成中的功能非必需,而K22在Ac78的功能中具有重要作用。本研究丰富了Ac78的信息,为进一步解剖Ac78的结构及探明Ac78的作用机理提供了实验和理论基础。
樊江斌[2]（2020）在《苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究》文中研究说明苹果蠹蛾颗粒体病毒（Cydia pomonella granulovirus,Cp GV）是一种对苹果蠹蛾（Cydia pomonella L.）幼虫具有专一性和高致病性的病原微生物。目前,Cp GV已经被开发成生物杀虫剂,应用在数十万公顷的苹果和梨等蔷薇科水果的种植生产中,是最成功的杆状病毒商业化产品之一。近年来,田间发现的三种抗Cp GV（I-III型）的苹果蠹蛾种群以及可以克服这三种抗性的Cp GV分离株,为研究杆状病毒宿主相互适应性提供了理想的模型。本论文旨在阐明中国西北地区收集的Cp GV分离株对敏感和抗性苹果蠹蛾种群的毒力差异,病毒基因组多态性。同时开展了苹果蠹蛾颗粒体病毒增效剂的研究。运用Illumina二代测序技术分析七个Cp GV分离株的种群结构,包括Cp GV-ZY、-JQ、-ALE、-KS1、-KS2、-ZY2和-WW,寻找这些新分离株基因型和生物学差异之间的关联性。研究所获主要结果如下:1.七个Cp GV对抗性苹果蠹蛾的生测结果表明Cp GV-JQ、-KS1和-ZY2可以克服I型抗性,感染幼虫的死亡时间明显延迟。新分离株遵循克服抗性的“pe38模型”,即缺少2×12 bp重复序列。尽管Cp GV-WW具有克服I型的特征,但是它不能高效杀死I型抗性苹果蠹蛾,却克服II型和III型抗性苹果蠹蛾。除了Cp GV-WW以外,其他Cp GV分离株生物测定结果与分离株的pe38重复序列结构之间的相关性与前人研究结论一致,即pe38基因是苹果蠹蛾Cp RR1中抗性靶标。2.根据Illumina二代测序数据,完成基因组组装和注释,系统发育分析。结果表明,尽管这些分离株采样地点相距甚远,但是它们的基因组高度保守且和已知Cp GV分离株有关联。基于系统发育树研究表明,除了已报道的五个基因组类群A,B,C,D和E,发现和命名了两个基因组类群F（Cp GV-JQ和-ZY2）和基因组类群G（Cp GV-ALE）。设定Cp GV-M为参考基因组,定量不同分离株基因组类群特异性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）的组份,确定其遗传构成。共发现563个SNPs,其中新发现223个SNPs属于这七个Cp GV。Cp GV-WW在基因组构成上是高度同质的,属于基因组类群E。其他的六种分离株则是由至少两种基因组类群组成的混合物。其中Cp GV-ZY、-KS1和-KS2基因组构成非常相似,分别由不同比例的基因组类群A（Cp GV-M）和基因组类群E（Cp GV-WW）组成。3.室内和半田间生测结果表明,在病毒悬液中添加7mg/ml的氧化铁能够显着提高Cp GV在田间的活性和持久性,与未添加氧化铁处理相比较,初孵幼虫死亡率分别提高了53.88%和96.64%。说明添加低剂量氧化铁,增强了Cp GV对田间强日光、强紫外线的适应性,提高了该病毒在田间的活性和持久性,说明氧化铁有作为商业化Cp GV产品助剂的潜力,能提高Cp GV对苹果蠹蛾防治效果。4.喂食半致死剂量的Cp GV病毒后,研究敏感性和抗性苹果蠹蛾三龄幼虫热休克蛋白hsp70-1和hsp70-2转录水平变化。与未处理对照相比,在Cp S幼虫中Cp GV-M和-S感染引起hsp70-1和hsp70-2转录水平先增加,后降低。与对照比较,Cp GV-S感染引起Cp RR1幼虫hsp70-1和hsp70-2转录水平在侵染前期保持稳定,至第7天时转录水平增加了3倍多。对比hsp70s在Cp S和Cp RR1幼虫转录时相,发现Cp GV诱导hsp70s上调在Cp RR1幼虫中延迟了大约2天。当Cp GV在苹果蠹蛾幼虫体内成功建立侵染时,hsp70s转录水平上调。综上所述,七个Cp GV分离株对不同抗性苹果蠹蛾种群的毒力差异明显,其中高毒力分离株为Cp GV可持续防治苹果蠹蛾提供了病毒资源。根据基因组类群特异性SNP分布和频率计算未知分离株基因型组成和遗传多样性的方法可推广到其他（杆状）病毒。低剂量氧化铁可保护Cp GV免受紫外线伤害,具有发展成Cp GV助剂的潜力。热休克蛋白hsp70s与Cp GV在苹果蠹蛾幼虫体内成功建立侵染有关。理解杆状病毒种群结构和遗传适应性之间的关系,以及合理利用病毒保护剂提高田间防效,有助于改善当前Cp GV抗性治理和生物防治持续发展。
龙羽燕[3]（2020）在《家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究》文中提出家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是引起家蚕血液型脓病的病原,每年都给养蚕业带来巨大的经济损失。BmNPV属于α杆状病毒属,在感染宿主时形成出芽型病毒粒子（Budded virion,BV）和包涵体衍生型病毒粒子（Occlusion-derived virion,ODV）,GP64蛋白是BV特有的一种囊膜糖蛋白,是病毒入侵宿主细胞的关键因子,也是病毒出芽成熟及二次感染所必须的病毒组分。掌握GP64蛋白的结构和功能,了解BmNPV毒株的流行传播规律,才能为BmNPV致病性的进一步研究,以及家蚕血液型脓病的防治研究提供参考。为了掌握BmNPV gp64基因的遗传进化特点,探明BmNPV与致病性相关的分子机制,本研究对广西不同蚕区采集的28个BmNPV野毒株和一个实验室重组r BmNPV毒株的gp64基因进行克隆测序及序列分析,并测定多个毒株的LD50,结果如下:1、所测序的广西BmNPV毒株gp64基因的ORF共有1590 bp、1593 bp和1599 bp三种长度,分别编码529、530以及532个氨基酸残基,造成序列大小不一致的原因是出现核苷酸的缺失与插入突变,这些缺失或插入突变都位于GP64蛋白的N端信号肽序列中。2、对比BmNPV野毒株的LD50发现,gp64基因长度为1593 bp以及1599 bp的毒株LD50大小相近,但比gp64基因长度为1590 bp毒株的小,流行毒株的毒力存在差异,说明野外BmNPV群体具有多种基因型,保持着丰富的遗传多样性。3、相同蚕区同时期采集的BmNPV毒株,gp64基因核苷酸同源性在99.6%～100%之间,推导氨基酸同源性均为100%,说明在同一时期同一蚕区短期流行的BmNPV毒株变异程度较小;相同蚕区不同时期采集的BmNPV毒株,gp64基因核苷酸同源性在98.9%～99.7%之间,推导氨基酸同源性98.9%～100%之间,说明BmNPV毒株经过较长时间的流行,出现的变异程度较大。4、根据gp64基因构建的NJ遗传进化树显示,除T3株外的国外BmNPV参考株都独立位于CladeⅡ的一个亚群中,与所有国内BmNPV参考株明显不在一个大群,说明BmNPV的遗传进化具有地域特点。从2019年采集的16个广西BmNPV毒株的流行分布地域图可以看出病毒的流行分布集中性与分散性并存,说明广西蚕区BmNPV存在局部范围内和远距离之间的传播与流行。
刘婷婷[4]（2019）在《宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用》文中认为在真核细胞内,内吞体分选转运复合体（the endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）具有剪切脂质双层膜的功能,参与多泡体的形成、胞质分裂、质膜修复、核膜重构及囊膜病毒的入侵和出芽释放等多种生理代谢过程。已知,ESCRT复合体由ESCRT-0-III和Vps4等五个复合物以及一些辅助蛋白组成。其中ESCRT-0-II主要负责转运物的分选和囊泡的形成,而ESCRT-III则作为“剪刀手”直接参与囊泡的剪切释放。最后,Vps4水解ATP催化ESCRT-III复合物解离。杆状病毒是一类大分子双链DNA囊膜病毒。在感染周期中,杆状病毒通常产生两种类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子（budded virions,BV）和包埋型病毒粒子（occlusion-derived virions,ODV）。近期的研究表明,过表达Vps4的显性-负性突变体（Dominant-negative,DN）显着降低苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）感染性BV的入侵和出芽释放。然而,关于宿主细胞ESCRT复合体在AcMNPV感染中的作用尚不明确。在本研究中,我们从草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞Sf9中克隆了ESCRT-III关键组成基因Vps2B、Vps20、Vps24、Snf7、Vps46和Vps60。序列分析表明,草地贪夜蛾ESCRT-III各组分的同源基因广泛存在于已测序的昆虫基因组中。激光共聚焦分析表明,表达瞬时转染质粒的细胞中,融合GFP标签的ESCRT-III各组分与融合mCherry标签的Vps4突变体E231Q存在共定位,推测这些融合蛋白可能定位于细胞内吞体中。采用病毒缺失-补偿系统（瞬时转染病毒膜蛋白GP64的表达质粒拯救缺失gp64基因AcMNPV的复制）,我们发现过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分（DN突变体）显着减少进入宿主细胞的病毒粒子,并且进入细胞的病毒粒子大多数被束缚在细胞质中不能被有效转运至细胞核进行复制。进一步利用β-galactosidase与β-glucuronidase作为标记基因并结合定量检测病毒基因组DNA的复制来分析病毒基因的表达,我们发现过表达ESCRT-III组分显性-负性突变体显着抑制病毒复制的早期阶段。揭示宿主ESCRT-III复合物与AcMNPV入侵有关;为了避免表达ESCRT-III各组分的显性-负性突变体对病毒入侵的影响,我们把融合GFP的ESCRT-III各组分构建到AcMNPV基因组DNA（bacmid）中,然后转染Sf9细胞。在转染后24小时,收集细胞上清并分析感染性AcMNPV的产量。结果表明,过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分显着抑制感染性病毒的产量。透射电子显微镜分析表明,表达融合GFP标签的ESCRT-III组分蛋白Vps24与Snf7均能显着抑制子代病毒核衣壳从核膜释放,这些数据揭示ESCRT-III参与感染性AcMNPV出芽型病毒粒子的释放过程。由于AcMNPV出芽型病毒粒子的释放依赖于自身编码的一些蛋白（如Ac93:AcMNPV ORF93编码的蛋白）,我们选择Ac93作为目的蛋白进一步分析病毒蛋白与宿主ESCRT-III亚基及Vps4之间可能的相互作用关系。利用免疫共沉淀和双分子荧光互补分析发现,Ac93与ESCRT-III各组分及Vps4均存在相互作用。而Ac93与Vps4的两个突变体K176Q和E231Q之间存在的相互作用揭示Ac93与Vps4的相互作用并不依赖于其ATP酶活性。进一步分析表明,Ac93与另外两个参与子代核衣壳从核膜释放的病毒蛋白Ac76与Ac103之间存在相互作用。这些数据表明:Ac93可能与Ac76、Ac103、ESCRT-III及Vps4形成复合物参与调控BV的出芽释放过程。为了进一步明确Ac93与ESCRT-III亚基及Vps4的相互作用机制,我们首先对杆状病毒Ac93同源蛋白序列进行比对分析发现在Ac93的C-末端存在一个富含亮氨酸的MIM1-like模序,它可能参与Ac93与ESCRT-III亚基以及Vps4的相互作用。采用定点突变方法,我们构建了一系列由丙氨酸替换6个保守亮氨酸的单点或多点突变体。瞬时表达分析表明,丙氨酸替换亮氨酸不影响Ac93突变体的表达。免疫共沉淀与双分子荧光互补分析发现,丙氨酸替换单个或多个亮氨酸均不同程度降低了Ac93与ESCRT-III各组分、Vps4及病毒蛋白Ac76或Ac103的相互作用。同时,单个或多个位点突变均显着降低了感染性AcMNPV的产量及自带病毒核衣壳经核膜出芽释放效率及病毒诱导的核内微囊泡的形成。Vps4此外,由于AcMNPV的侵染依赖于宿主脂肪酸合成酶活性,为了探讨线粒体在杆状病毒侵染中的作用,我们初步获取了草地贪夜蛾（S.frugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）线粒体基因组序列,并进行了初步组装分析。总之,上述研究揭示宿主细胞ESCRT-III/Vps4参与AcMNPV的入侵和出芽释放过程,er而病毒自身编码的关键蛋白Ac93可能通过与病毒蛋白Ac76及Ac103互作形成复合体参与募集ESCRT-III/Vps4进而调控子代BV的出芽释放和ODV的组装。Vps4
沈运旺[5]（2018）在《家蚕核型多角体病毒ORF40、ORF133/134和ORF92a的功能研究》文中认为杆状病毒科包含一大类专一性感染昆虫的有囊膜病毒,它们的基因组是环状、超螺旋的双链DNA分子。目前已经在600多种昆虫中分离到杆状病毒,主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫。杆状病毒在其生活周期中,产生两种遗传物质相同,但是形态和功能完全不同的病毒粒子,即出芽型病毒（budded virus,BV）和包埋型病毒（occlusion-derived virus,ODV）。家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）只感染家蚕（Bombyx mori）,是目前研究最广泛的杆状病毒之一。本研究以BmNPV四个功能未知的ODV相关蛋白ORF40、ORF133/134和ORF92a为研究对象,通过构建基因敲除突变体,发现它们在ODV的形成过程中发挥不同的功能。主要结果如下。1.BmNPV ORF40的功能研究BmNPV的ORF40（bm40）位于病毒基因组的38,254-39,213 nt,在己测序的a杆状病毒基因组中高度保守。bm40的开放阅读框（openreading frame,ORF）全长960 bp,编码319个氨基酸残基,预测分子量为37.8 kDa。生物信息学分析显示Bm40的N端和C端分别含有一个Dna J结构域和一段RNA识别基序（RNA recognition motif,RRM）。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm40是一个晚期表达基因。利用λ Red同源重组系统构建了敲除bm40的重组病毒。结果表明,敲除型病毒只能感染单个细胞,无法产生具有感染力的子代BV病毒粒子,但是病毒DNA的复制没有受到影响。电镜结果表明,敲除bm40影响了核衣壳从细胞核转运到细胞质、核衣壳包膜形成ODV病毒粒子,以及随后ODV包埋的过程。共聚焦显微镜分析发现,从感染后48小时,Bm40主要位于细胞核内,并在感染晚期聚集在核膜和多角体上。敲除Bm40的RRM不影响BV的产生和Bm40的细胞内定位。以上结果表明,在BmNPV感染周期中,Bm40在BV的产生和ODV的包膜过程中发挥重要作用。2.BmNPV ORF133/134 的功能研究BmNPV的ORF133(bm133 和ORF134(bm134 分别位于病毒基因组的126,858-127,313 nt和127,342-127,671 nt。这两个开放阅读框相邻,并且转录方向相反。这两个基因在所有已测序的group INPV中高度保守,分别编码两种小分子蛋白（Bm133,17.7kDa;Bm134,12.4kDa）。RT-PCR 结果表明bm13 和bm134均是晚期表达基因。利用λRed同源重组系统构建了bm13 和bm134同时缺失的重组病毒。结果表明,同时敲除两个基因不影响BV的产生和病毒DNA的复制。电镜结果表明,双敲除不影响核衣壳的组装、核内微泡的形成,以及ODV病毒粒子的产生,但是被包埋进多角体的ODV病毒粒子数量显着减少。进一步研究显示单独修复某个基因并不能恢复ODV包埋的能力,表明这两个基因在ODV包埋过程中缺一不可。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm133和Bm134同时位于细胞质和细胞核。在裂解的细胞中,Bm134主要聚集在多角体上。这些结果表明,Bm133和Bm134不是BV和ODV产生必需的,但是它们在ODV包埋与多角体形态发生过程中发挥重要作用。3.BmNPV ORF92a的功能研究BmNPV的ORF92a（bm2a）位于病毒基因组的88,983-89,162 nt,在己测序的杆状病毒基因组中高度保守。bm92a的开放阅读框全长180 bp,编码59个氨基酸残基,预测分子量为7.1 kDa。Bm92a是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）的经口 感染因子AC110的同源物,在其N端存在一段高度疏水的跨膜结构域（transmembrane,TM）。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm92a是一个晚期表达基因。利用λRed同源重组系统构建了敲除bm92a的重组病毒。结果表明,bm92a敲除型病毒和修复型病毒具有类似的增长曲线。电镜结果表明,bm92a敲除不影响核衣壳的组装、ODV的包膜和多角体的形态。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm92a主要位于细胞核内的环形区域,并在感染晚期聚集在多角体上。并且,Bm92a的细胞内转运和定位模式与经口感染因子PIF1和PIF2的类似。酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现Bm92a与PIF1具有强烈的互作关系。这些结果表明,Bm92a不是BV和ODV产生必需的,它可能通过与PIF1的互作参与经口感染因子复合体的形成。
李喜升[6]（2016）在《核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析》文中提出柞蚕（Antheraea pernyi Guerin-Meneville,1855）属大蚕蛾科柞蚕属的泌丝昆虫,是一种重要的经济昆虫,同时也是重要的模式昆虫。柞蚕幼虫全龄在野外柞园中饲养,其幼虫生长发育极易受到野外环境条件包括柞树叶质、气候环境因素以及多种病原微生物等影响,导致柞蚕病害的发生。研究表明,因柞蚕因病害造成的减产在20%-30%,柞蚕病害已成为制约柞蚕产业发展的主要影响因素之一。其中,柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害,其病原为柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi nucleopolyhedro-virus, ApNPV）,该病在世界养蚕业国家常有爆发,传染性极强,不易控制,在生产上危害最为严重,常造成巨大的经济损失。ApNPV感染既取决于自身的表型差异,又与宿主本身生理状况有关,是病原与宿主相互作用的过程。ApNPV入侵宿主体内后,利用宿主体内内环境中的营养物质完成自身的复制、增殖并释放。而柞蚕体内存在的免疫屏障面对病毒的入侵,会开启防御机制,通过细胞内的特异性变化来抵御病毒的增殖,这种变化首先体现在基因水平上,因此研究ApNPV感染后宿主基因的表达差异,可以从分子水平了解ApNPV侵染后宿主生理反应的分子生物学机制,对于阐明柞蚕被ApNPV感染后体内免疫相关基因的表达及调控模式具有重要意义,为进一步利用柞蚕免疫相关基因资源及利用分子生物学方法辅助抗病育种等奠定了基础。研究结果如下：1.柞蚕感染ApNPV后中肠转录组分析结果采用4.05×106多角体/mL的ApNPV对柞蚕3龄幼虫经口添食,提取经显微镜下确认ApNPV感染柞蚕幼虫中肠组织进行转录组分析,建立了ApNPV感染柞蚕的转录组数据库,为分析ApNPV感染后柞蚕基因表达规律提供了基础数据库。总共在ApNPV感染的柞蚕中肠中得到5,172个差异表达基因,包括2,183个上调基因和2,989个下调基因。生物信息学分析表明,筛选到参与柞蚕免疫反应的差异基因主要分为以下几类：与细胞凋亡相关的基因、热激蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶和细胞色素P450。对这些基因的分析为进一步探究宿主应对病毒感染的免疫分子机制提供了理论基础。2.柞蚕免疫相关基因—鸟苷三磷酸酶基因（ApGTPase）的克隆与表达在柞蚕感染ApNPV的转录组数据库中筛选到了表达量上调的柞蚕鸟苷三磷酸酶基因,利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行结构分析以及功能预测,半定量PCR技术检测了鸟苷三磷酸酶基因在柞蚕不同发育时期的表达谱,通过对柞蚕4龄幼虫分别经口添食柞蚕核型多角体病毒、柞蚕微孢子虫（Nosema pernyi）、柞蚕链球菌（Streptococcus pernyi）3种病原物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同外源物刺激作用下,鸟苷三磷酸酶基因在不同时间段的相对表达量变化趋势,结果表明：柞蚕鸟苷三磷酸酶基因（ApGTPase）开放阅读框ORF长度1194 bp,编码397个氨基酸,推测其蛋白的等电点（pI）6.64,蛋白分子量（Mw）为44.6 kDa。与家蚕（Bombyx mori）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的鸟苷三磷酸酶氨基酸序列相似度分别为95%,93%,93%,78%,表明该基因与同样来自鳞翅目昆虫的家蚕、棉铃虫和柑橘凤蝶的同源相似度较高,而与双翅目的黑腹果蝇相似度较低。在不同病原物诱导后的柞蚕中肠组织中鸟苷三磷酸酶基因的相对表达量有不同程度的升高,并普遍高于对照组（无菌水处理组）的相对表达水平,表明鸟苷三磷酸酶可能参与了柞蚕的免疫防御反应,可以作为柞蚕免疫基因资源利用。3.柞蚕免疫相关基因—脂肪酶基因（Aplipase）的克隆与表达分析根据柞蚕感染核型多角体病毒的转录组数据库,设计特异引物,克隆得到柞蚕脂肪酶基因（Aplipase）,对该基因的氨基酸序列进行结构分析以及功能预测,半定量PCR技术构建了脂肪酶基因在柞蚕不同发育时期的表达谱；通过对柞蚕4龄幼虫分别经口添食柞蚕核型多角体病毒、柞蚕微孢子虫、柞蚕链球菌3种病原物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同外源物刺激作用下,柞蚕脂肪酶基因在不同时间段的相对表达量变化趋势。结果表明克隆得到柞蚕脂肪酶基因（Aplipase）的cDNA序列,已知其开放阅读框ORF长度为1527bp,编码508个氨基酸。BLASTp比对可知,柞蚕脂肪酶基因与鳞翅目昆虫家蚕、大红斑蝶（Danaus plexippus）、柑橘凤蝶的脂肪酶基因同源序列相似度为79%左右。半定量PCR结果显示,脂肪酶基因在柞蚕5龄幼虫的脂肪体组织的表达水平较高；不同病原物经口添食柞蚕4龄幼虫,实时荧光定量PCR技术检测添毒后72 h内脂肪体中脂肪酶转录水平变化,柞蚕脂肪酶基因在柞蚕核型多角体病毒和白僵菌诱导条件下,转录水平变化趋势最显着,说明柞蚕脂肪酶基因在外源病原物的诱导下高表达,推测该基因产物与柞蚕的免疫防御有光,可以利用该基因或基因产物进行柞蚕免疫方面的研究。以上研究结果为深入理解ApNPV感染柞蚕后分子水平所发生的变化,揭示柞蚕-ApNPV之间的互作机制奠定了理论基础；对于更进一步研究柞蚕对不同病原物的免疫机制具有重要意义,参考免疫相关基因的表达水平可为抗性品种的选育提供理论指导。
唐琦[7]（2013）在《可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析》文中认为家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境,因而已经逐渐取代传统的化学农药,广泛应用于农林防护。目前,越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知,对这些未知功能的基因进行研究,有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论,从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因,构建重组型的杆状病毒,从而更好地利用杆状病毒表达系统,或作为生物杀虫剂防治农林害虫。本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因（Bm65）和晚期基因（Bm91）为研究对象,分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒,进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下：一.Bm65基因功能1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游,预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基,理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示,Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族,推测该基因可能与病毒DNA复制有关。2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白,制备了抗血清。此外,利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白,为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h.5’RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。4.利用Red重组系统,用Cm基因成功地取代了Bm65后,通过抗性筛选得到缺失型病毒,并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因,但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。二.Bm91基因功能1.Bm91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白,在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处,预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示,Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族,推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。2.原核表达Bm91蛋白,制备多克隆抗体。转录分析表明,Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录,一直持续到感染后96h,且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。3.成功构建了Bm91缺失型病毒,通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现,Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生,且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比,滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LD50,却使得宿主幼虫的半数致死时间LT5o延长了24h,提示Bm91为病毒增殖的非必需基因,但该基因可能与病毒毒力有关。以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况,为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础,也为该病毒的改造和利用提供理论依据。
杨苗苗[8]（2012）在《思茅松毛虫核型多角体病毒及全基因组分析》文中认为松毛虫类害虫是我国重大森林害虫之一。思茅松毛虫Dendrolimus kikuchiiMatsumura属鳞翅目Lepidoptera枯叶蛾科Lasiocampidae松毛虫属Dendrolimus。目前防治该害虫以化学农药为主。杆状病毒具有很强的专化性，对环境和非靶标生物安全，是一种理想的病原微生物杀虫剂。世界上已有50多种商品化生产的杆状病毒杀虫剂用于农林害虫的控制。因此，寻找致病力强的杆状病毒来防治该害虫显得非常必要。目前，作者在云南思茅松毛虫重灾区采集到了一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒，主要研究结果如下：1.思茅松毛虫核型多角体病毒（DekiNPV）形态学和毒力研究发现了一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒，定名为DekiNPV。多角体呈不规则型，直径大小0.792.31μm（n=100），平均直径1.64±0.1μm，其表面凹凸不平，且有大量的长条形、圆形孔洞，长条形居多，大小（173.00254.00）×（55.10116.00） nm；一个多角体中有多个杆状病毒粒子，杆状病毒粒子长约（252.22359.38）×（70.18200.00）nm，两端钝圆或平截，其内含有19个核衣壳，大小（24.0028.60）×（242.00340.00）nm,平均大小25.80±0.86×265.00±12.66nm （n=50），为多粒包埋型。用浓度2.2×1042.2×108PIB/mL5个浓度的DekiNPV接种于3龄思茅松毛虫幼虫发现，DekiNPV对3龄思茅松毛虫幼虫有很强的毒力；LT50随着浓度的降低而增长，分别为6.89、7.18、8.16、10.31和11.13d，LC50为1.72×105PIB/mL；3龄思茅松毛虫幼虫感染DekiNPV后第7d幼虫开始大量死亡，死亡高峰期为感染病毒后的第710d。对在实验室连续传四代后的DekiNPV进行超微结构观察发现，传代后的DekiNPV形态结构与原代一致，具有稳定性。2. DekiNPV基因组全序列分析分析了DekiNPV全基因组序列，DekiNPV基因组大小为141，454bp， C+G含量为48.04%。预测DekiNPV含有146个开放阅读框（ORF），其大小在150个核苷酸以上，并与其它ORF有最小的重叠。其中有133个DekiNPV的ORF与报道已测序的杆状病毒具有同源性，13个ORF为该病毒特有，占全基因组的12.4%。基于DekiNPV的29个杆状病毒核心基因构建了该病毒的进化树，进化分析发现DekiNPV属于鳞翅目杆状病毒Group Ⅰ组，与MaviMNPV、BomaNPV、BmNPV、PlxyMNPV、RoMNPV和AcMNPV亲缘关系近。DekiNPV基因组中含有16个保守的结构基因，DekiNPV基因组缺失P6.9和odv-e56。该基因含有抗凋亡基因iap-1，iap-2和iap-3。DekiNPV基因组含中有12个bro基因。DekiNPV分别与AcMNPV、BmNPV、ChchNPV、LdMNPV、MacoNPV-B、SeMNPV和XecnGV进行了基因对等比较分析，发现该病毒与AcMNPV和BmNPV表现出了最好的线性关系。同源区分析发现，DekiNPV中共有11个hr。3. DekiNPV的PCR检测方法根据DekiNPV特有阅读框ORF146设计两对引物建立PCR检测方法，用DekiNPV基因组DNA为模板扩增出了426bp和655bp片段，PCR产物经测序结果与引物选取片段大小一致。分别以两对引物对DekiNPV的基因组DNA、多角体进行检测，最小量检测均达到了0.8fg/mL DNA和5PIB/mL，在感病虫体内检测到了DekiNPV的存在。该方法具有灵敏度高、特异性强、早期检测等特点，可以用于DekiNPV寄主域、替代寄主和病毒在种群中动态变化等领域的研究。4. DekiNPV寄主域及其替代寄主的研究用11种鳞翅目昆虫（云南松毛虫Dendrolimus houi、马尾松毛Dendrolimus punctatus、文山松毛虫Dendrolimus punctatus wenshanensis、赤松毛虫Dendrolimus spectabilis、美国白蛾Hyphantria cunea、舞毒蛾Lymantria dispar、灰茶尺蠖Ectropis grisescens、棉铃虫Helicoverpa armigera、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小菜蛾Plutella xylostella和斜纹夜蛾Spodoptera litura）和两株昆虫细胞系[sf-9细胞和杨扇舟蛾细胞（CAF-clan II）]研究了DekiNPV的寄主域和替代寄主。研究发现DekiNPV具有很强的专化性，但DekiNPV可以诱发美国白蛾、云南松毛虫、马尾松毛、文山松毛虫和赤松毛虫体内潜伏性感染病毒。
唐平[9]（2011）在《一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析》文中提出杆状病毒具有闭合环状双链DNA基因组，是一类主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫的病原物，杆状病毒作为生物杀虫剂具有对人畜安全，不造成环境污染，宿主专一性强，能有效控制田间害虫种群密度等优点。本文对一株分离自棉铃虫的核型多角体病毒进行电镜观察，表明其为多粒包埋型的核型多角体病毒，昆虫感染实验表明其与棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearSNPV）有不同的宿主域，细胞感染实验表明其与HearSNPV有不同的病理效应，因此对其基因组进行了分析，并与其它杆状病毒基因组进行了比较。对一株分离自棉铃虫的病毒纯化后进行电镜观察，发现其呈不规则多角体型，包涵体中有多个包含病毒核衣壳的囊膜，每个病毒囊膜内含有2个以上核衣壳，符合多粒包埋型核型多角体病毒特征，将其命名为棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera multinucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HearMNPV）。荧光定量PCR结果分析表明HearMNPV的DNA在棉铃虫体内复制经历了减少期、隐晦期、增长期及稳定期４个时相，表明其宿主体内复制良好。HearMNPV对其它昆虫的感染性实验表明它对东方粘虫有较好的感染性，但不能感染斜纹夜蛾及甜菜夜蛾，而HearSNPV不能感染东方粘虫，表明两者有着不同的宿主域。HearMNPV对Hz-AM1细胞系感染后没有多角体产生，也不显示明显的细胞病理效应；对棉铃虫胚胎细胞系QB-Ha-E-5细胞系感染后有大量多角体产生，呈现较好的感染性。Hz-AM1是HearSNPV的敏感细胞系,用源自HearSNPV的HaBacmid-egfp对QB-Ha-E-5细胞系感染，细胞感染后有明显的荧光产生，表明HearMNPV和HearSNPV对宿主细胞感染性存在不同。为进一步分析HearMNPV，将Sau3AⅠ部分酶切HearMNPV基因组DNA，SalⅠ完全酶切pUC19载体，以Klenow酶分别对回收的片断和载体进行半补齐反应，经连接、转化后,得到用半补齐法构建的覆盖率大于99.9％的HearMNPV基因组文库。对HearMNPV基因组全序列进行测定并分析表明基因组的大小为154,196bp，G+C含量为40.07%，推测含有162个与相邻的ORF有最小重叠且大于150bp的ORF，占基因组全序列的90.16%，4个同源重复区等非编码区序列占整个基因组的9.84%。基因对等图表明HearMNPV与HearSNPV共线性较低，HearMNPV基因组结构与披肩粘虫核型多角体病毒B株（Mamestraconfigurata nucleopolyhedrovirus-B，MacoNPV-B）有很好的共线性；系统进化分析表明HearMNPV与HearSNPV不在同一簇中，而与MacoNPV-B存在同一簇中。HearMNPV与HearSNPV在基因组的大小、内容，同源基因的排列、一致性上存在着显着的差别，结合昆虫宿主域实验确定HearMNPV是一株不同于棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（HearSNPV）的新病毒种。与MacoNPV-B基因组结构相比，HearMNPV缺失了包含ORF54、55、56、57、58的片断，长度约为5.4kb，其基因组中HearMNPV orf66、orf17、bro基因、hr序列与MacoNPV-B存在明显的不同，表明其与MacoNPV-B的亲缘关系然很近，但在基因组的结构上存在明显的差异。
李萌[10]（2007）在《棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达》文中研究指明棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）可特异性侵染棉铃虫,是理想的棉铃虫生物防治因子。HearNPV的两个分离株C1、G4的基因组全序列已经测定,一些基因的功能已经阐明,ORF34、ORF44是两个功能未知的基因。本研究对ORF34、ORF44基因进行了克隆、序列分析和原核表达研究,首次分析并确认了HearNPV的ORF34、ORF44基因为HearNPV的特有基因,基因表达产物也为后续研究提供了基础。HearNPV ORF34基因全长1080nt,编码359aa,预测编码蛋白分子量为41.2 kDa。序列分析显示,ORF34具有三个杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。分析发现ORF34的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,15个磷酸化位点和1个糖基化位点。除HzNPV ORF34外,未发现与ORF34氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-34表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,表达的融合蛋白分子量为42kDa,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析研究结果表明ORF34是HearNPV的一个特有基因。HearNPV ORF44基因全长1137nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7kDa。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。分析发现ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HezeNPV ORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 kDa,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析研究结果表明ORF44是HearNPV的一个特有基因,ORF44融合蛋白的成功表达为进一步制备多克隆抗体,深入研究HearNPV ORF44奠定了基础。
二、中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp~(37)基因的序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp~(37)基因的序列分析（论文提纲范文）
（1）杆状病毒Ac78 N端保守氨基酸位点的功能分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细菌、昆虫细胞和病毒 |
| 1.2 生物信息学分析 |
| 1.3 ac78点突变重组病毒的构建 |
| 1.4 转染 |
| 1.5 病毒滴度测定 |
| 1.6 透射电镜观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Ac78及其同源蛋白氨基酸序列的比对分析 |
| 2.2 转座载体p FB-Ac78R9A:HA和p FB-Ac78K22A:HA的构建 |
| 2.3 Ac78点突变重组病毒的构建和验证 |
| 2.4 Ac78点突变对感染性BV产生的影响 |
| 2.5 Ac78点突变对M-ODV产生的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果蠹蛾的发生与分布 |
| 1.2 苹果蠹蛾的生物防治方法 |
| 1.3 苹果蠹蛾颗粒体病毒分类状地位和组织病理学 |
| 1.4 苹果蠹蛾颗粒病田间应用 |
| 1.5 苹果蠹蛾颗粒体病毒的田间抗性发生 |
| 1.6 Illumina第二代测序在杆状病毒中的应用 |
| 1.7 CpGV紫外线保护剂 |
| 1.8.热休克蛋白70 |
| 1.9 .研究依据、目的和意义 |
| 第二章 七个苹果蠹蛾颗粒体病毒的毒力差异和多样性 |
| 2.2 引言 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 待试昆虫 |
| 2.3.2 病毒扩繁 |
| 2.3.3 毒力测定 |
| 2.3.4 Cp GV分离株中pe38 基因序列比较 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 CpGV分离株的毒力差异 |
| 2.4.2 Pe38基因PCR产物分析 |
| 2.4.3 多重序列比对pe38基因扩增片段 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 七个苹果蠹蛾颗粒体病毒的遗传构成 |
| 3.2 引言 |
| 3.3 材料和方法 |
| 3.3.1 CpGV分离株及扩繁 |
| 3.3.2 基因组测序和组装 |
| 3.3.3 系统发育分析 |
| 3.3.4 单核苷酸多态性分析 |
| 3.4 结果和讨论 |
| 3.4.1 基因组组装和系统发育 |
| 3.4.2 基因组注释和比较 |
| 3.4.3 Pe38基因重复序列多态性 |
| 3.4.4 SNP分类和Cp GV分离株基因组组成 |
| 第四章 苹果蠹蛾颗粒体病毒紫外线保护剂的研究 |
| 4.2 引言 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 供试虫源、Cp GV-ZY及氧化铁 |
| 4.3.2 试验方法 |
| 4.3.2.1 氧化铁对苹果蠹蛾幼虫死亡率影响 |
| 4.3.2.2 不同浓度氧化铁混合Cp GV-ZY后进行UVB照射处理 |
| 4.3.2.3 不同浓度氧化铁混合Cp GV-ZY后进行自然光处理 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 氧化铁对苹果蠹蛾幼虫死亡率影响 |
| 4.4.2 不同浓度氧化铁对Cp GV-ZY免受UVB辐射损害的效果 |
| 4.4.3 不同浓度氧化铁对Cp GV-ZY免受强日照辐射损害的效果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 感染不同Cp GVs的苹果蠹蛾hsp70s转录水平差异 |
| 5.2 引言 |
| 5.3 材料与方法 |
| 5.3.1 昆虫与病毒 |
| 5.3.2 半致死剂量(LD50)测定 |
| 5.3.3 收集RT-PCR的样品 |
| 5.3.4 测定苹果蠹蛾热休克蛋白转录水平 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 半致死剂量(LD50) |
| 5.4.2 定量热休克蛋白70转录水平 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论和讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.2 杆状病毒的感染复制 |
| 1.3 杆状病毒的基因组成与表达 |
| 1.4 家蚕核型多角体病毒 |
| 1.4.1 家蚕血液型脓病 |
| 1.4.2 家蚕围食膜防御屏障 |
| 1.4.3 家蚕抗BmNPV相关蛋白和基因 |
| 1.4.4 BmNPV囊膜糖蛋白GP64的结构和功能 |
| 1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 BmNPV毒株和实验动物 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂(盒)商品 |
| 2.1.4 基础试剂配制 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BmNPV多角体的纯化 |
| 2.2.2 BmNPV基因组DNA提取 |
| 2.2.3 PCR扩增gp64基因 |
| 2.2.4 PCR扩增产物电泳 |
| 2.2.5 目的片段的纯化回收 |
| 2.2.6 感受态细胞制备 |
| 2.2.7 目的基因克隆 |
| 2.2.8 重组质粒提取 |
| 2.2.9 重组质粒鉴定 |
| 2.2.10 目的基因测序与序列拼接 |
| 2.2.11 序列比对和进化树分析 |
| 2.2.12 19年毒株流行分布图 |
| 2.2.13 BmNPV毒株的LD_(50)测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PCR扩增目的片段 |
| 3.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3 基因ORF测序长度 |
| 3.4 gp64基因ORF序列同源性比较 |
| 3.5 gp64基因的遗传进化树 |
| 3.6 广西BmNPV毒株的流行分布 |
| 3.7 BmNPV gp64 基因ORF单核苷酸多态性分析 |
| 3.8 密码子偏好性分析 |
| 3.9 选择压力分析 |
| 3.10 LD_(50)测定结果 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1:本研究测序的广西BmNPV毒株gp64基因核苷酸序列比对 |
| 附录2:本研究测序的广西BmNPV毒株gp64基因推导氨基酸序列比对 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 ESCRT系统的组成 |
| 1.1.1 ESCRT-0 复合体 |
| 1.1.2 ESCRT-Ⅰ复合体 |
| 1.1.3 ESCRT-Ⅱ复合物 |
| 1.1.4 ESCRT-Ⅲ复合体 |
| 1.1.5 Vps4 |
| 1.1.6 Alix |
| 1.2 晚期结构域L-domain |
| 1.3 杆状病毒简介 |
| 1.3.1 杆状病毒的分类 |
| 1.3.2 杆状病毒的形态结构 |
| 1.3.3 杆状病毒生活周期 |
| 1.3.4 杆状病毒核心基因 |
| 1.3.5 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒简介 |
| 1.4 多个影响BV产量的杆状病毒核心基因简介 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 主要实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞、菌株与质粒 |
| 2.2.2 细菌培养基 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 常用缓冲液 |
| 2.2.5 常用抗生素溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌化学感受态细胞制备 |
| 2.3.2 DH10Bac电转感受态细胞制备 |
| 2.3.3 草地贪夜蛾Sf9 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.4 ESCRT-Ⅲ组分基因的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.5 AcMNPV核心基因ac93 突变体的构建 |
| 2.3.6 ac93 及其系列突变瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.7 构建表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ各个组分的重组AcMNPV bacmid |
| 2.3.8 细胞活性测定 |
| 2.3.9 病毒缺失-补偿实验 |
| 2.3.10 病毒滴度测定 |
| 2.3.11 ac93 重组病毒的滴度测定 |
| 2.3.12 AcMNPV基因表达与基因组DNA复制检测 |
| 2.3.13 AcMNPV的入侵分析 |
| 2.3.14 AcMNPV出芽释放分析 |
| 2.3.15 免疫共沉淀分析(Co-immunoprecipitation) |
| 2.3.16 Western blotting |
| 2.3.17 双分子荧光互补分析 |
| 2.3.18 激光共聚焦显微镜分析 |
| 2.3.19 透射电子显微镜观察 |
| 2.3.20 同源重组线性片段ac93US-Cm-ac93DS的制备 |
| 2.3.21 同源重组感受态细胞DH10BAC的制备 |
| 2.3.22 电击转化同源重组 |
| 2.3.23 Bacmid DNA提取 |
| 2.3.24 重组病毒v AcIE1-GFP-PP-GFP-PP-Polh的构建 |
| 2.3.25 ac93 补回型重组病毒vAc ac93~(REP-PP-GFP-PP-Polh)的构建 |
| 2.3.26 重组病毒的PCR鉴定 |
| 2.3.27 helper质粒的去除 |
| 2.3.28 多步病毒生长曲线测定 |
| 第三章 ESCRT-Ⅲ在 AcMNPV侵染中的作用 |
| 3.1 ESCRT-Ⅲ核心基因的克隆 |
| 3.2 ESCRT-Ⅲ核心基因的氨基酸序列比对分析 |
| 3.3 ESCRT-Ⅲ核心蛋白的表达 |
| 3.4 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对感染性AcMNPV BV的影响 |
| 3.5 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对AcMNPV侵染早期阶段的影响 |
| 3.6 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对AcMNPV BV入侵的影响 |
| 3.7 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分显性-负性突变体对BV出芽释放的影响 |
| 3.8 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分显性-负性突变体对AcMNPV的子代病毒核衣壳从核膜释放的影响 |
| 3.9 小结 |
| 3.10 讨论 |
| 第四章 Ac93与ESCRT-Ⅲ亚基的相互作用 |
| 4.1 Ac93和ESCRT-Ⅲ亚基的相互作用 |
| 4.2 Ac93和Vps4 的相互作用 |
| 4.3 Ac93 与病毒核心蛋白Ac76、Ac103 的相互作用 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 Ac93 突变体与ESCRT-Ⅲ/Vps4 的相互作用 |
| 5.1 Ac93 及其同源蛋白的氨基酸序列比对 |
| 5.2 Ac93 的结构域分析 |
| 5.2.1 晚期结构域 |
| 5.2.2 亮氨酸拉链 |
| 5.2.3 核受体模序 |
| 5.2.4 MIM1 模序 |
| 5.2.5 CRAC-motif |
| 5.3 Ac93 突变体的构建 |
| 5.3.1 克隆策略 |
| 5.3.2 点突变系列瞬时表达载体的构建 |
| 5.3.3 ac93 系列点突变BIFC瞬时表达载体的鉴定 |
| 5.3.4 MIM1 模序保守的存在于几乎所有的Ac93 同源物中 |
| 5.3.5 Ac93 突变体自身相互作用 |
| 5.3.6 Ac93 突变体与Vps4 的相互作用 |
| 5.3.7 Ac93 突变体与Vps4 MIT结构域的相互作用 |
| 5.3.8 Ac93 突变体与ESCRT-Ⅲ蛋白的相互作用 |
| 5.3.9 Ac93 突变体与病毒核心蛋白Ac76和Ac103 的相互作用 |
| 5.3.10 Ac93 其突变体与ESCRT-Ⅲ组份蛋白、病毒核心蛋白的的表达 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 Ac93 突变体对Ac MNPV复制的影响 |
| 6.1 ET同源重组技术和Bac-to-Bac系统 |
| 6.2 构建ac93 缺失型重组bacmid流程 |
| 6.2.1 ac93 上游侧翼序列和下游侧翼序列的鉴定 |
| 6.2.2 重组质粒pIE-ac93US-Cm-ac93DS的鉴定 |
| 6.2.3 重组Bacmid vAc~(ac93ko)的鉴定 |
| 6.2.4 转座载体IE1-GFP-PFB、ac93p-ac93-pFB的鉴定 |
| 6.2.5 ac93 补回型重组病毒vAc~(ac93REP-PP-GFP-PP-Polh)的鉴定 |
| 6.2.6 点突变系列重组载体93p-?ac93-HApBlue的构建 |
| 6.2.7 点突变系列转座载体93p-?ac93-HA-pFB的构建与鉴定 |
| 6.2.8 补回型重组病毒vAc~(△~(ac93REP-PP-GFP-PP-Polh))的构建与鉴定 |
| 6.3 ac93 点突变重组病毒对感染性病毒粒子产量的影响 |
| 6.4 Ac93的MIM1 模序对核衣壳从核膜释放以及核内微泡的形成的影响 |
| 6.5 小结 |
| 6.6 讨论 |
| 第七章 粉纹夜蛾和草地贪夜蛾的线粒体基因组分析 |
| 7.1 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)线粒体基因组分析 |
| 7.2 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的线粒体基因组分析 |
| 7.3 小结 |
| 第八章 结论与讨论 |
| 8.1 ESCRT-Ⅲ是 AcMNPV粒子有效入侵和释放所必需的 |
| 8.2 MIM1模序参于Ac93蛋白与Ac93蛋白、ESCRT-Ⅲ/Vps4蛋白和其他病毒蛋白的互作 |
| 8.3 MIM1 模序在Ac MNPV侵染中发挥重要的作用 |
| 8.4 Ac93蛋白与Ac93蛋白、ESCRT-Ⅲ/Vps4蛋白和其他病毒蛋白的互作主要发生在核膜 |
| 8.7 粉纹夜蛾和草地贪夜蛾线粒体基因组分析 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）家蚕核型多角体病毒ORF40、ORF133/134和ORF92a的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 ODV病毒粒子的形成过程 |
| 1.1.3 杆状病毒编码蛋白的核质转运 |
| 1.1.4 影响ODV病毒粒子产生的基因 |
| 1.2 本研究的目的与科学意义 |
| 第二章 家蚕核型多角体病毒ORF40的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 家蚕核型多角体病毒ORF133/134的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 家蚕核型多角体病毒ORF92a的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 发表论文 |
| 专着 |
| 博士期间获得荣誉 |
| 致谢 |
（6）核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫病毒的研究现状 |
| 1.1.1 昆虫病毒分类研究 |
| 1.1.2 昆虫核型多角体病毒的主要特征 |
| 1.1.3 柞蚕核型多角体病毒 |
| 1.2 昆虫抗病毒机制研究 |
| 1.2.1 昆虫抗NPV的免疫途径研究 |
| 1.2.2 昆虫免疫信号转导研究 |
| 1.2.3 昆虫免疫效应因子研究进展 |
| 1.2.4 其他途径和效应分子 |
| 1.3 柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)的感染及危害 |
| 1.4 基因转录组学的研究进展 |
| 1.4.1 转录组研究技术 |
| 1.4.2 转录组测序技术的应用 |
| 1.4.3 转录组测序技术在鳞翅目昆虫上的应用 |
| 1.5 脂肪酶研究进展 |
| 1.6 小G蛋白家族的概述 |
| 1.6.1 小G蛋白的结构 |
| 1.6.2 小G蛋白的分类 |
| 1.6.3 小G蛋白的生物学功能 |
| 1.7 本项目的研究意义 |
| 第二章 柞蚕感染核型多角体病毒后转录组测序 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA-Seq数据整体质量评估 |
| 2.2.2 Unigene注释分析 |
| 2.2.3 CDS预测 |
| 2.2.4 微卫星标记(SSR)分析 |
| 2.2.5 基因表达水平分析 |
| 2.2.6 RNA-seq整体质量评估 |
| 2.2.7 差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 鸟苷三磷酸酶基因克隆及功能研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 柞蚕总RNA的提取及mRNA的纯化 |
| 3.2.2 柞蚕cDNA第一条链的合成 |
| 3.2.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.2.4 PCR产物目的条带的回收与纯化 |
| 3.2.5 感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 PCR产物的连接转化 |
| 3.2.7 序列分析 |
| 3.2.8 系统进化的分析 |
| 3.2.9 ApGTPase重组蛋白的表达 |
| 3.2.10 柞蚕不同发育时期和组织cDNA的制备 |
| 3.2.11 外源病原物对4龄柞蚕幼虫的诱导 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 柞蚕总RNA质量的电泳检测 |
| 3.3.2 目的基因的检测 |
| 3.3.3 柞蚕鸟苷三磷酸酶的序列分析 |
| 3.3.4 柞蚕ApGTPase基因同源比对及系统进化分析 |
| 3.3.5 ApGTPase基因原核表达及检测 |
| 3.3.6 柞蚕鸟苷三磷酸酶基因ApGTPase组织表达谱分析 |
| 3.3.7 Real-time PCR引物特异性分析 |
| 3.3.8 外源病原物诱导后柞蚕中肠鸟苷三磷酸酶基因的Real-time PCR检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 柞蚕鸟甘三磷酸酶基因的克隆及功能分析 |
| 3.4.2 柞蚕鸟苷三磷酸酶基因对外源病原物入侵响应 |
| 第四章 柞蚕脂肪酶基因受病原物侵染后表达谱分析 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 柞蚕脂肪酶基因的克隆 |
| 4.2.2 Aplipase基因的序列分析 |
| 4.2.3 柞蚕脂肪酶基因的原核表达 |
| 4.2.4 柞蚕4个发育阶段与5龄幼虫各组织Aplipase基因的半定量检测 |
| 4.2.5 外源病原物诱导后柞蚕中肠Aplipase基因的实时定量PCR检测分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 柞蚕脂肪酶基因克隆 |
| 4.3.2 Aplipase的序列分析 |
| 4.3.3 柞蚕脂肪酶基因的进化分析 |
| 4.3.4 脂肪酶基因的原核表达及检测 |
| 4.3.5 Aplipase基因的半定量检测 |
| 4.3.6 外源病原物诱导下Aplipase基因的实时定量PCR检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表文章 |
（7）可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 图表清单 |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 家蚕、杆状病毒与食品 |
| 1.1.1 家蚕与食品的关系 |
| 1.1.2 杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.3 杆状病毒杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.4 重组杆状病毒杀虫剂 |
| 1.2 杆状病毒概况 |
| 1.2.1 杆状病毒分类及生活周期 |
| 1.2.2 杆状病毒与宿主的相互作用 |
| 1.2.3 杆状病毒宿主范围 |
| 1.2.4 杆状病毒的应用 |
| 1.3 家蚕核刑多角体病毒 |
| 1.3.1 家蚕核型多角体病毒简介 |
| 1.3.2 家蚕核型多角体病毒的多样性 |
| 1.3.3 AcMNPV与BmNPV的基因组比较 |
| 1.3.4 BmNPV基因的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 研究的技术路线 |
| 2 Bm65基因生物信息学分析 |
| 2.1 分析软件及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bm65的核苷酸及氨基酸的序列特征 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 Bm65的原核表达、真核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种、载体、实验动物 |
| 3.1.2 酶和化学试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 缓冲液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计及PCR |
| 3.2.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 目的蛋白的割胶纯化 |
| 3.2.5 抗血清的制备 |
| 3.2.6 SDS-PAGE及免疫印迹分析 |
| 3.2.7 pAc~(Bm65-egfp)的构建 |
| 3.2.8 细胞转染 |
| 3.2.9 转染上清感染sf9细胞 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bm65的克隆 |
| 3.3.2 Bm65基因的原核表达及检测 |
| 3.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.4 Bm65蛋白多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.5 Bm65真核表达基因的克隆 |
| 3.3.6 HTB-ie1-egfp-Bm65z-SV40的构建及鉴定 |
| 3.3.7 pAc~(Bm65-egfp) bacmid的构建及鉴定 |
| 3.3.8 pAc~(Bm65-egfp)转染sf9细胞 |
| 3.3.9 免疫印迹检测Bm65的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Bm65在BmN细胞中的转录分析和蛋白定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和试剂 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 5’-RACE分析 |
| 4.2.4 免疫荧光观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Bm65的转录分析 |
| 4.3.2 Bm65的表达时相 |
| 4.3.3 Bm65的亚细胞定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 Bm65缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、菌株、试剂 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 抗生素配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Bm65基因打靶线性化片段的制备 |
| 5.2.2 电转化感受态DH10Bac细胞制备 |
| 5.2.3 电击转化同源重组 |
| 5.2.4 含有pBm~(Bm65KO)的菌株中pBAD-gbaA质粒的去除 |
| 5.2.5 供体质粒pFB1-polh-gfp-Bm65的构建 |
| 5.2.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建 |
| 5.2.7 细胞转染 |
| 5.2.8 转染上清感染BmN细胞 |
| 5.2.9 病毒滴度测定 |
| 5.2.10 qPCR分析Bm65缺失后对病毒DNA复制的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm65基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 5.3.2 重组质粒pUC18-Bm65US-Cm-Bm65DS的酶切鉴定 |
| 5.3.3 Bm65缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm65的构建及鉴定 |
| 5.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 5.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)在BmN细胞上的复制分析 |
| 5.3.7 病毒DNA复制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 Bm91基因生物信息学分析 |
| 6.1 分析软件及方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Bm91的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 Bm91的多克隆抗体制备、转录分析及蛋白定位 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 BV的纯化 |
| 7.2.2 多角体的纯化 |
| 7.2.3 ODV的纯化 |
| 7.2.4 BV/ODV囊膜蛋白的分离纯化 |
| 7.2.5 BV/ODV核衣壳的分离纯化 |
| 7.2.6 N-糖基化抑制实验 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 Bm91的克隆 |
| 7.3.2 Bm91基因的原核表达及检测 |
| 7.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 7.3.4 Bm91蛋白的多克隆抗体制备及抗体的检测 |
| 7.3.5 Bm91的转录分析 |
| 7.3.6 Bm91的表达时相 |
| 7.3.7 Bm91的亚细胞定位 |
| 7.3.8 Bm91蛋白在病毒结构中的定位 |
| 7.3.9 N-糖基化抑制实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 Bm91缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的构建 |
| 8.2.2 重组病毒半数致死剂量(50% lethal dose,LD_(50))的测定 |
| 8.2.3 重组病毒半数致死时间(50% lethal time,LT_(50))的测定 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 Bm91基因打靶线性化片段的PCR扩增 |
| 8.3.2 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的酶切鉴定 |
| 8.3.3 Bm91缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 8.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm91的构建及鉴定 |
| 8.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 8.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)在RmN细胞上的复制 |
| 8.3.7 Bm91缺失病毒的生物学分析 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 总结和展望 |
| 9.1 总结 |
| 9.2 展望 |
| 9.2.1 Bm65的进一步分析 |
| 9.2.2 Bm91的进一步分析 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 发表的研究论文 |
| 导师指导下主持课题 |
| 参与课题 |
（8）思茅松毛虫核型多角体病毒及全基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 松毛虫病毒研究进展 |
| 1.1.1 松毛虫病毒种类 |
| 1.1.2 国内外松毛虫病毒的应用 |
| 1.1.3 松毛虫病毒的交叉感染研究 |
| 1.1.4 松毛虫病毒基因组序列结构与功能的研究 |
| 1.1.5 问题及展望 |
| 1.2 杆状病毒的分类学和生物学 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 杆状病毒的感染周期 |
| 1.2.3 杆状病毒基因组结构 |
| 1.2.4 杆状病毒的重复基因 |
| 1.2.5 涉及杆状病毒宿主域的病毒基因 |
| 1.2.6 杆状病毒基因组的进化 |
| 1.3 杆状病毒杀虫剂 |
| 1.3.1 体内生产 |
| 1.3.2 体外生产 |
| 1.3.3 病毒的利用 |
| 1.3.4 杆状病毒在害虫防治中的限制因素 |
| 1.3.5 杆状病毒杀虫剂的利用前景和展望 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 思茅松毛虫核型多角体病毒的形态及毒力研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器及产地 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 病毒的初步鉴定 |
| 2.3.2 病毒的分离纯化 |
| 2.3.3 病毒的染色鉴定 |
| 2.3.4 病毒超微结构观察 |
| 2.3.5 毒力测定 |
| 2.3.6 传代病毒超微结构的观察 |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 思茅松毛虫室内饲养 |
| 2.4.2 病毒鉴定 |
| 2.4.3 思茅松毛虫核型多角体病毒的形态特征 |
| 2.4.4 不同感染浓度与死亡率的关系 |
| 2.5 结论与讨论 |
| 第三章 思茅松毛虫核型多角体病毒全基因组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 DekiNPV 来源 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要仪器及产地 |
| 3.2.4 主要试剂及缓冲液的配制 |
| 3.2.5 DekiNPV 基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.6 DNA 测序 |
| 3.2.7 DNA 序列分析 |
| 3.2.8 系统分析（Phylogenetic analysis） |
| 3.2.9 核酸序列号 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 DekiNPV 基因组序列分析 |
| 3.3.2 DekiNPV 基因组结构 |
| 3.3.3 DekiNPV 与其它杆状病毒的 ORF 的比较 |
| 3.3.4 结构基因 |
| 3.3.5 DNA 复制和晚期基因的表达 |
| 3.3.6 抗凋亡基因 |
| 3.3.7 辅助功能基因 |
| 3.3.8 重复基因（bro genes） |
| 3.3.9 DekiNPV 特有 ORF |
| 3.3.10 基因对等图分析 |
| 3.3.11 同源区（homologous regions/hr） |
| 3.3.12 进化分析 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 思茅松毛虫核型多角体病毒的 PCR 检测方法 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 病毒株和多角体纯化 |
| 4.2.2 主要试剂及溶液配制 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 病毒 DNA 的提取 |
| 4.2.5 病虫总 DNA 的提取 |
| 4.2.6 健康虫总 DNA 的提取 |
| 4.2.7 DekiNPV 的 PCR 检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DekiNPV 基因组 DNA 的 PCR 扩增与特异性检测结果 |
| 4.3.2 DekiNPV 基因组 DNA 的 6 个浓度的 PCR 检测结果 |
| 4.3.3 不同底物目标片段的检测结果 |
| 4.3.4 DekiNPV 寄主域的 PCR 检测 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 思茅松毛虫核型多角体病毒寄主域和替代寄主的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试虫来源 |
| 5.2.2 细胞来源 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 主要仪器 |
| 5.2.5 病毒纯化 |
| 5.2.6 接种物 DekiNPV 纯度的检查 |
| 5.2.7 病毒粒子的制备 |
| 5.2.8 基于 11 种鳞翅目昆虫对 DekiNPV 寄主域及其替代寄主的研究 |
| 5.2.9 两种处理后死亡幼虫体内是否存在 NPV 和 CPV 混合感染的染色鉴定 |
| 5.2.10 两株昆虫细胞系在 DekiNPV 寄主域上的研究 |
| 5.2.11 两种处理后死亡的四种松毛虫和美国白蛾体内多角体的分离和鉴定 |
| 5.2.12 病毒 DNA 的提取 |
| 5.2.13 酶切分析 |
| 5.2.14 幼虫总 DNA 的提取 |
| 5.2.15 美国白蛾幼虫潜伏性病毒的检测 |
| 5.2.16 四种松毛虫幼虫潜伏性病毒的检测 |
| 5.2.17 两种处理后 4 种松毛虫和美国白蛾体内分离到的多角体是否含有DekiNPV 的 PCR 检测 |
| 5.2.18 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 接种物的纯度检测 |
| 5.3.2 DekiNPV 对 11 种鳞翅目昆虫的致死率 |
| 5.3.3 两种处理后 5 种死亡幼虫体内是否存在 NPV 和 CPV 混合感染的染色鉴定结果 |
| 5.3.4 DekiNPV 对 2 株昆虫细胞系的感染研究 |
| 5.3.5 两种处理后死亡虫体内病毒的超微结构观察 |
| 5.3.6 两种处理后美国白蛾幼虫中分离到的病毒身份的鉴定 |
| 5.3.7 四种松毛虫和美国白蛾的潜伏性病毒的确认 |
| 5.3.8 DekiNPV 诱发潜伏感染的能力 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 有待进一步的研究工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒分类学 |
| 1.1.2 杆状病毒对宿主的侵染过程 |
| 1.1.3 杆状病毒基因组研究 |
| 1.1.4 影响宿主功能的杆状病毒基因 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 第二章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株和多角体病毒纯化 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 扫描电镜样品的制备 |
| 2.2.2 透射电镜样品的制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 扫描电镜观察 |
| 2.3.2 透射电镜观察 |
| 第三章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 昆虫细胞及病毒 |
| 3.1.3 试验昆虫 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 细菌培养基 |
| 3.1.6 昆虫细胞培养基 |
| 3.1.7 常用溶液及缓冲液 |
| 3.1.8 实验仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的传代 |
| 3.2.2 细胞的冻存 |
| 3.2.3 细胞的复苏 |
| 3.2.4 病毒感染细胞 |
| 3.2.5 昆虫添食病毒 |
| 3.2.6 碱法少量快速抽提质粒 DNA |
| 3.2.7 限制性内切酶反应 |
| 3.2.8 玻璃奶法纯化回收 DNA 片段 |
| 3.2.9 DNA 的连接 |
| 3.2.10 感受态细胞的小量制备 |
| 3.2.11 感受态细胞的大量制备 |
| 3.2.12 质粒 DNA 的转化 |
| 3.2.13 快速细胞破碎法鉴定重组质粒 |
| 3.2.14 绝对定量 PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HearMNPV 对宿主细胞的感染（体外复制） |
| 3.3.2 HearMNPV 在棉铃虫体内的复制 |
| 3.3.3 HearMNPV 对其它昆虫的感染 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 半补齐法构建棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组文库 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HearMNPV 的扩增 |
| 4.2.2 多角体病毒 DNA 的提取 |
| 4.2.3 用 Sau3AⅠ酶对 HearMNPV 基因组 DNA 随机切割 |
| 4.2.4 半补齐反应 |
| 4.2.5 连接与转化 |
| 4.2.6 插入片断大小鉴定及文库覆盖率 |
| 4.2.7 DNA 测序 |
| 4.2.8 基因组序列组装 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 ORF 的确定 |
| 5.1.2 启动子基序搜索 |
| 5.1.3 同源重复区（hrs）的寻找 |
| 5.1.4 基因组内容、组织及排列分析 |
| 5.1.5 系统进化分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 HearMNPV 基因组核苷酸序列分析 |
| 5.2.2 基因对等图分析 |
| 5.2.3 系统进化分析 |
| 5.2.4 HearMNPV 与 MacoNPV-B 基因组结构的比较 |
| 5.2.5 HearMNPV ORF6644 |
| 5.2.6 HearMNPV ORF1746 |
| 5.2.7 HearMNPV unique ORF |
| 5.2.8 bro genes |
| 5.2.9 hrs |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 6.2 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 6.3 半补齐法构建 HearMNPV 基因组文库 |
| 6.4 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展 |
| 1 杆状病毒的分类 |
| 2 核型多角体病毒的生活史 |
| 3 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展 |
| 3.1 HearNPV 基因组研究 |
| 3.2 HearNPV 基因功能研究 |
| 3.2.1 非结构蛋白基因 |
| 3.2.2 结构蛋白基因 |
| 第二章 主要研究内容和技术路线 |
| 1 主要内容 |
| 1.1 基因序列分析 |
| 1.2 原核表达 |
| 2 技术路线 |
| 2.1 基因序列分析 |
| 2.2 原核表达 |
| 第三章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌种和载体 |
| 1.2 工具酶和试剂盒 |
| 1.3 其它试剂 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 PCR 反应 |
| 2.2 目的片段分离回收 |
| 2.3 双酶切反应 |
| 2.4 连接反应 |
| 2.5 氯化钙制备新鲜的感受态细胞 |
| 2.6 碱法质粒DNA 小量制备 |
| 2.7 质粒DNA 转化 |
| 2.8 外源基因在E.coli 中的表达 |
| 2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.10 Western blot |
| 3 常规实验试剂配制 |
| 3.1 细菌培养基 |
| 3.2 碱法质粒抽提液 |
| 3.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.4 SDS-PAGE 试剂 |
| 3.5 Western blot 试剂 |
| 3.6 抗生素 |
| 3.7 RNA 酶（10mg/ml） |
| 第四章 HearNPV 基因 ORF34、ORF44 的序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HearNPV ORF34 基因序列分析 |
| 2.2 HearNPV ORF44 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HearNPV 基因 ORF34、ORF44 的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 PCR 反应 |
| 1.2.3 ORF34、ORF 44 基因的克隆 |
| 1.2.4 ORF34、ORF 44 基因表达载体的构建 |
| 1.2.5 ORF34、ORF 44 在大肠杆菌中的表达 |
| 1.2.6 Western blot 分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ORF34、ORF 44 基因的克隆 |
| 2.1.1 ORF34、ORF 44 基因的扩增 |
| 2.1.2 ORF34、ORF 44 基因克隆载体的鉴定 |
| 2.2 ORF34、ORF 44 基因表达载体的鉴定 |
| 2.3 ORF34、ORF 44 基因的诱导表达 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp~(37)基因的序列分析（论文参考文献）
- [1]杆状病毒Ac78 N端保守氨基酸位点的功能分析[J]. 李赛男,吕怡娜,甘田,区炳明,赵海洲,刘文华. 农业生物技术学报, 2021(02)
- [2]苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究[D]. 樊江斌. 西北农林科技大学, 2020
- [3]家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究[D]. 龙羽燕. 广西大学, 2020(07)
- [4]宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用[D]. 刘婷婷. 西北农林科技大学, 2019
- [5]家蚕核型多角体病毒ORF40、ORF133/134和ORF92a的功能研究[D]. 沈运旺. 浙江大学, 2018(12)
- [6]核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析[D]. 李喜升. 沈阳农业大学, 2016(04)
- [7]可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析[D]. 唐琦. 江苏大学, 2013(07)
- [8]思茅松毛虫核型多角体病毒及全基因组分析[D]. 杨苗苗. 西北农林科技大学, 2012(06)
- [9]一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析[D]. 唐平. 中国农业科学院, 2011(03)
- [10]棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达[D]. 李萌. 西北农林科技大学, 2007(06)