万凤[1]2017年在《基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制》文中研究指明目的研究人参皂苷通过作用于神经干细胞巢(NSCs niche)内的神经干细胞(NSCs)、星形胶质细胞(AC)和脑微血管内皮细胞(EC),对缺血/再灌注(OGD/R)后的NSCs增殖、分化的影响以及HIF-1α-VEGF信号通路的调节机制。方法1孕15-17d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养星形胶质细胞,采用免疫荧光染色法对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP进行鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养脑微血管内皮细胞,采用免疫荧光染色法对脑微血管内皮细胞的特异性标志物Factor Ⅷ进行鉴定。2 MTS法测定人参皂苷促进NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量及最佳给药时间点。3携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,观察GPF的阳性表达率来确定NSCs的转染率,筛选出慢病毒转染NSCs的最佳转染指数MOI值及最佳转染时间。按照课题组先前的造模方法,采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,以缺氧缺糖4h为NSCs损伤的最高时间点。Western Blot检测慢病毒转染后NSCs核内HIF-1α蛋白表达,观察转染后HIF-1α蛋白表达情况,并计算出HIF-1α蛋白沉默率;免疫荧光及细胞核染色检测HIF-1α基因在NSCs的表达位置情况;免疫荧光染色法对转染后NSCs进行鉴定,并且检测转染后NSCs的增殖、分化情况。4实验分为6组,设立NSCs正常组、NSCs模型组、NSCs人参皂苷组(1.OOμg/ml)、慢病毒转染的NSCs(LV-NSCs)正常组、LV-NSCs模型组、LV-NSCs人参皂苷组(1.OOμg/mL),OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs和培养液,免疫荧光染色技术分析NSCs的增殖、分化情况,Western Blot分析NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测培养液VEGF含量。5采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与星形胶质细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组、NSCs/AC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组、LV-NSCs/AC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、星形胶质细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析星形胶质细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。6采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与脑微血管内皮细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组、NSCs/EC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/EC 正常组、LV-NSCs/EC 模型组、LV-NSCs/EC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、脑微血管内皮细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析脑微血管内皮细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。结果1 胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,经鉴定,其纯度达95%以上。2人参皂苷促进NSCs、胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量和最佳给药时间点①人参皂苷促进NSCs增殖的最佳剂量为1.00μg/mL,促进NSCs增殖的最佳给药时间点为24h。②人参皂苷促进星形胶质细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进星形胶质细胞增殖的最佳给药时间点为72h。③人参皂苷促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳给药时间点为24h。3慢病毒转染NSCs筛选最佳MOI值及最佳转染时间成功采用慢病毒转染NSCs,慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为144h。与对照组相比,NSCs转染率为90.47%(P<0.01)。4 Western Blot检测OGD后慢病毒转染NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况与NSCs正常组和转染阴性对照组相比,NSCs转染组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。经计算,HIF-1α 沉默率为 88.5%。5免疫荧光及细胞核染色检测OGD后HIF-1α在NSCs内的表达情况在缺氧条件下,NSCs正常组显示HIF-1α能够在NSCs核内表达;NSCs转染组显示GFP绿色荧光能够在细胞核内表达,并且HIF-1α不表达,表明慢病毒能够成功转染NSCs,并使HIF-1α表达沉默。6免疫荧光染色鉴定慢病毒转染NSCs后的Nestin及NSCs增殖、分化情况慢病毒转染后的NSCs均表达Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性,慢病毒转染后的NSCs仍能够增殖,并且分化为神经元的祖细胞和星形胶质细胞的祖细胞,但其增殖、分化能力明显降低。7免疫荧光染色技术检测OGD后NSCs增殖和分化情况①NSCs各组:NSCs正常组、NSCs模型组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与NSCs正常组相比,NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs模型组比较,NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组、LV-NSCs模型组和LV-NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs模型组比较,LV-NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数少量增加,差异无统计学意义。8 Western Blot检测OGD后各组NSCs核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs各组:NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白少量表达或几乎不表达;与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞核中的HIF-1α蛋白表达明显减少(P<0.01)。9 ELISA检测OGD后各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs各组:NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量很低;与N LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显减少(P<0.01)。10 MTS检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。11免疫荧光双标染色检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组和NSCs/AC人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/AC 正常组相比,NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/AC 各组:LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组和 LV-NSCs/AC 人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。12 Western Blot检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组星形胶质细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。②LV-NSCs/AC:LV-NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。13 ELISA检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/AC各组:LV-NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。14 MTS检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。15免疫荧光双标染色检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组和NSCs/EC人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin 阳性表达;分别复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/EC 正常组相比,NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:正常组、模型组和人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性表达;分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。16 Western Blot检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组脑微血管内皮细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与 LV-NSCs/EC 模型组相比,LV-NSCs/EC 人参皂苷组 HIF-1α 蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。17 ELISA检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组相比,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷通过调节NSCs niche内的NSCs、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,通过调控HIF-1α-VEGF信号通路,以自分泌和旁分泌的共同方式,促进缺血/再灌注后NSCs增殖,并且诱导NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的祖细胞。
何勇[2]2015年在《低氧对牙周膜干细胞干性作用：自我更新功能以及多能性的研究》文中认为牙周病(periodontal diseases)是人类口腔两大类主要疾病之一,具有发病率高,危害严重的特点。在世界范围内均有较高的患病率,在我国患病率更居于龋病之上。牙周炎会导致牙龈炎症、牙周组织破坏、牙槽骨的吸收、最终导致牙齿脱落。是人群中导致失牙的主要原因。我国是世界上高原面积最大、居住人口最多的国家,高原地区占国土面积的六分之一;而目前,国内外关于高原环境下牙周炎的发病机制研究报道少见。本课题组在前期对高原地区驻地官兵进行了流行病学的调查,结果显示:受调者牙周炎患病率在60%,这种高发病率明显高于平原地区,涉及的原因可能是:高原低氧环境;口腔自洁效果差,利于菌斑形成;牙周微循环障碍,PH值下降等多因素所导致的,这不仅使高原人群成为牙周炎易感人群,同时,也影响了牙周炎患者牙周组织的再生与修复。牙周膜干细胞(periodontal ligamentstem cells,PDLSCs),一组牙周膜组织来源的间充质干细胞,分离自牙周组织,是牙周组织的主要功能细胞。作为牙周组织炎症中重要的靶细胞及牙周修复的重要种子细胞,对PDLSCs的研究具有重要的临床意义。高原环境空气稀薄、含氧量低,特别高海拔地区的低氧条件下,会导致机体组织不同程度缺氧,而缺氧又是机体最常见的病理生理过程。研究表明:机体对缺氧的反应实本实验观察了载缺氧条件下对体外PDLSCs增殖、克隆、多向分化的生物学效应的影响,同时也研究了所涉及的潜在机制,为高原牙周病的机制研究进一步研究提供实验依据。目的:观察缺氧对体外培养的人牙周膜干细胞(HPDLSCs)增殖、克隆、干细胞标志、多向分化的生物学活性的影响,以及潜在机制的研究。材料和方法:临床收集健康人的第叁磨牙牙周膜组织,用连续稀释法分选培养出PDLSCs,经增殖、克隆形成、干细胞标志、成骨性及成脂性等方面对原代培养的HPDLSCs进行鉴定。体外模拟低氧环境,并将PDLSCs分别培养于低氧(5%O_2)和正常氧条件(20%O_2),比较不同氧浓度下PDLSCs生物学活性的变化。1.MTT比色法检测低氧对PDLSCs增殖能力的影响。2.细胞计数检测低氧对PDLSCs单克隆的能力。3.ELISA检测低氧对PDLSCs成骨标志ALP活性的影响,实时定量荧光PCR技术检测成脂标志基因PPARγ和LPL的表达,从而评价低氧条件下对PDLSCs成骨、成脂能力的影响。4.在这些研究的基础上,进一步检测了低氧条件下PDLSCs生物学活性变化所涉及的分子信号机制,采用Western Blot检测低氧条件下对PDLSCs p38/MAPK和ERK/MAPK信号的影响;并利用特异性的阻断剂,分别阻断p38或ERK信号后,观察阻断这些信号后对低氧条件下培养的PDLSCs的影响。结果:1.采用有限稀释法从健康人第叁磨牙的牙周膜组织中,成功分离培养出PDLSCs,并进行了鉴定。PDLSCs呈典型“梭型”细胞形态,并阳性表达STRO-1、CD44和CD146;具有较强的克隆形成能力以及增殖功能。2.在不同的培养条件下对PDLSCs进行定向诱导,PDLSCs能够具有成骨性分化和成脂向分化的能力。3.PDLSCs可在低氧浓度条件下维持其干细胞标记物表达,包括STRO-1、CD146、CD44和CD45。低氧可增强PDLSCs的克隆形成能力和增殖能力(P<0.01)。低氧组PDLSCs的ALP活性明显高于常氧组(P<0.01)。低氧组中与成脂相关的基因PPARγ和LPL的相对倍数变化明显下调(P<0.01)。低氧条件下能显着上调PDLSCs的p38/MAPK和ERK1/2的磷酸化水平。此外,低氧条件下,无论单独还是联合运用P38抑制剂和ERK抑制剂,都会显着抑制PDLSCs增殖和克隆形成能力;单独运用P38抑制剂会显着抑制ALP,PPARγ和LPL的表达,单独应用ERK抑制剂显着刺激了ALP,PPARγ和LPL的表达,然而,二者联合运用却显着上调了ALP,PPARγ和LPL的表达。结论:PDLSCs在低氧条件下可以维持其自我更新能力,包括克隆和增殖能力。但是低氧条件下PDLSCs的成骨分化潜能和成脂分化潜会受到明显的抑制。而这一变化同时涉及到了p38/MAPK和ERK/MAPK通路,在低氧条件下PDLSCs增殖和分化等功能起着重要的调控作用。
李海生[3]2005年在《低氧促进人骨髓间充质干细胞增殖和分化及其机制研究》文中研究指明氧是维持生命的必要条件,也是细胞功能的一种重要生理调节因子,而低氧是生命发育的基本环境。例如,在妊娠的早期,由于没有血管的形成,所以胚胎是在低氧环境中发育的。低氧作为一种生理性的刺激因素,影响着胚胎的发生、发育及正常功能的维持。低氧可激活低氧诱导因子(HIF),从而调控一系列与低氧相关基因的表达。例如,诱导与葡萄糖分解、转运、红细胞和血管再生等相关的基因,使其表达增加,从而维持体内氧环境的稳态。关于低氧作用的研究,目前多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面,而对低氧在细胞增殖、分化中影响的研究较少。特别是对于体内胚胎发生时期和成年后的一些生理、病理过程中,出现细胞局部微环境低氧的情况重视不足。干细胞包括骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养和增殖分化作用的研究都是在常氧(20%O_2)条件下进行的,这样难以反映体内的真实情况。低氧在体内作为一种生理性的刺激因素,对体外培养的MSCs增殖和分化的作用目前还不清楚,也没有引起科研人员的足够重视。而人骨髓间充质干细胞(hMSCs)是目前临床应用前景最好的成体干细胞,因此,本文就低氧对hMSCs体外增殖和分化作用进行了初步研究。 1.低氧对hMSCs体外增殖的作用 探讨不同方式低氧对hMSCs体外增殖的影响。实验采用血球计数板计数法和流式细胞术分别观察了间歇性低氧(3%O_2、10%O_2)和持续性低氧(3%O_2、10%O_2、100μmol/L CoCl_2、200μmol/L CoCl_2)对hMSCs数量以及增殖指数的影响。结果发现,间歇性低氧对hMSCs数量和增殖指数无明显影响;持续性低氧各组hMSCs数量和增殖指数均增加(P<0.05)。提示持续性低氧可促进体外培养的hMSCs增殖,说明持续性低氧作为体外的一种可控制因素,可调节hMSCs的体外增殖,对于hMSCs的临床应用具有一定的意义。 同时本研究还应用基因芯片技术分析了低氧对hMSCs增殖过程中基因表达谱的变化。结果显示21329个基因中282个基因有差异性表达。从基因学的角度证实了低氧对hMSCs增殖的影响是一个多基因参与的复杂过程。并从基因芯片的结果中筛选出5个目的基因,用RT-PCR方法检测了这5个基因的表达变化。发现在
王飞[4]2013年在《低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究》文中研究指明神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）是存在于胚胎期神经系统和成体脑组织中的一类具有自我更新和分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的干细胞。神经干细胞不仅对胚胎神经系统发育至关重要，也为各种中枢神经系统的损伤和疾病的治疗带来了希望。通过移植神经干细胞可以在动物或人体中治疗帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、阿兹海默症、多发性硬化症、中风和脊髓损伤等神经系统疾病。目前，神经干细胞的体外培养和扩增通常是在常氧即20%的氧浓度条件下进行的，而胚胎发育和成体脑组织中的氧浓度只有3-5%，甚至更低，这种现象被称作生理性低氧。近年来，越来越多的实验证据表明低氧对于神经干细胞的增殖和分化具有重要的调节作用。本实验室的研究结果表明，适度低氧能促进成年动物脑内和离体培养神经干细胞的增殖和分化。因此，研究低氧对神经干细胞存活、增殖和分化的调控具有重要的意义。低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor, HIF）作为细胞和分子水平的低氧感知分子是低氧信号通路中关键的调控分子之一。低氧条件下，细胞中的HIF-1α稳定并转移至细胞核，通过与低氧反应元件（Hypoxia responsive element, HRE）结合调控多种下游靶基因的表达，从而调控细胞存活、增殖和分化等生物学过程。最新的研究发现microRNAs参与HIF信号通路的调控。低氧下HIF-1α能上调多种miRNAs的表达如miR-23，miR-24，miR-26，miR-107，miR-210和miR-373等，而miR-199和miR-20b则能调控HIF-1α的表达。miR-210在现有报道的所有低氧处理的细胞中均一致表达上调，而且上调最为显着，被认为是低氧标志性microRNA。现有研究证明HIF-1能够与miR-210转录起始位点上游40bp处的低氧反应元件结合，进而调控miR-210的表达。miR-210通过其靶基因参与对细胞存活、凋亡、线粒体代谢、DNA损伤修复和血管生成等生物学过程的调控。然而， miR-210在神经干细胞中的表达及调节机制尚未见报道。因此，在该研究中我们探讨了低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控和作用机制。主要研究结果如下：一、低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究1.将离体NSCs置于叁个氧浓度下培养1、2、3天，然后用Realtime-PCR检测NSCs中miR-210表达量，发现3%和0.3%低氧能显着促进NSCs中miR-210的表达，并且随着低氧时间的延长和氧浓度的降低miR-210的表达量逐渐增高，提示miR-210在NSCs中可能具有重要的生物学作用。2.用DNA甲基化抑制剂AZA抑制DNA甲基化，能在常氧（20%）和低氧（3%，0.3%）下显着上调NSCs中miR-210的表达，说明DNA甲基化可能参与了miR-210的表达调控，而且这一调控通路不依赖HIF-1通路。3.通过在神经干细胞中过表达或抑制miR-210然后检测其对细胞存活、凋亡和增殖的影响，结果显示miR-210可以显着抑制缺氧（0.3%）引起的细胞凋亡，促进细胞存活，而不影响细胞增殖。4.为了进一步探讨miR-210作用的分子机制，通过生物信息学筛选与细胞存活和凋亡相关的靶基因，发现促凋亡蛋白BNIP3的编码区和3’UTR有两个可以和miR-210结合的种子序列，可能是miR-210的靶基因。5.通过过表达和抑制miR-210，发现miR-210能显着抑制BNIP3蛋白的表达。将BNIP3mRNA编码区和3’UTR的两个可能与miR-210结合的互补位点构建到荧光素酶报告载体，发现过表达miR-210能显着抑制这两个质粒的荧光素酶活性，而将这两个位点突变后能反转miR-210的抑制作用，说明BNIP3是miR-210的靶基因。6.通过BNIP3siRNA特异抑制BNIP3能显着减少低氧下miR-210inhibitor导致的细胞凋亡，说明miR-210—BNIP3在低氧下NSCs中发挥了关键的抗凋亡作用。7.通过核浆分离Western Blot和免疫荧光实验证明miR-210能够抑制促凋亡蛋白AIF入核，进而抑制了缺氧下神经干细胞的凋亡。二、低氧对循环miR-210的分泌调控及其初步的功能研究最新的研究发现miRNAs可以被细胞分泌到胞外，进入细胞培养液和体液循环系统。这种被膜结构和蛋白包裹的分泌形式的miRNAs被称为循环miRNAs。由于血浆中的循环miRNA具有稳定、易于获得和便于检测的特点，使其成为理想的疾病诊断的标志分子而受到广泛的专注。然而，循环miRNAs的功能研究目前少有报道。在此，我们观察了低氧处理神经干细胞后对循环miR-210分泌的影响和循环miR-210对神经干细胞存活的作用。1.通过Realtime-PCR检测叁种氧浓度下NSCs培养了不同时间后，NSCs中和其培养液中miR-210的含量，结果显示低氧在促进NSCs中miR-210表达的同时，NSCs培养液中循环miR-210的含量也显着上调，并且具有氧浓度和低氧时间依赖性。2.通过超速离心的方法分离了含有循环miR-210的外来体（exosomes）和微囊（microvesicles），并用电镜观察了exosomes的超微结构。荧光染料特异染色实验表明外来体和微囊可以被受体细胞吸收。囊泡中的循环miR-210可以进入受体细胞，上调细胞中miR-210含量。3.将叁种氧浓度下收集的NSCs培养液作用于常氧下的NSCs，并检测细胞存活发现3%氧浓度下的NSCs培养液能促进NSCs存活，而0.3%氧浓度下的NSCs培养液能抑制NSCs存活，在两种培养液中加入miR-210antagomir能反转循环miR-210对细胞存活的作用，说明NSCs培养液中含有的循环miR-210可以调节细胞存活。4.将含有梯度浓度循环miR-210的培养液作用于常氧下的NSCs，并检测细胞存活发现，循环miR-210对细胞存活的作用与其浓度有关，高浓度的循环miR-210对NSCs的存活有抑制作用，而低浓度的循环miR-210对NSCs存活的作用还需要进一步验证。5.将SD大鼠进行模拟高原5000米低压低氧处理0.5-2小时，然后通过Realtime-PCR检测大鼠血浆和脑脊液中miR-210的含量，结果表明低压低氧能显着促进大鼠血浆和脑脊液中循环miR-210含量增加。因此，血浆中循环miR-210的增加有可能作为高原低氧的标志分子，其具体作用和机制尚待进一步研究。综上所述，本研究发现：（1）低氧能显着上调NSCs中miR-210的表达量；（2）DNA甲基化参与调控miR-210的表达，并且独立于HIF-1通路；（3）低氧下miR-210具有促进NSCs存活，抑制细胞凋亡的作用；（4）BNIP3是miR-210的靶基因，miR-210通过抑制BNIP3的表达，进而抑制AIF入核，最终抑制了缺氧时NSCs的凋亡；（5）低氧能促进神经干细胞分泌miR-210；（6）循环miR-210可以影响NSCs存活，而且循环miR-210对NSCs存活的作用与其浓度有关；（7）低氧能促进大鼠血液和脑脊液中循环miR-210含量增加。以上的研究结果表明miR-210在低氧调节神经干细胞的存活和凋亡中具有重要的平衡作用；而循环miR-210不但是低氧的标志分子，而且参与对神经干细胞存活的调节。该研究也为神经发育的调控和神经干细胞的移植治疗神经损伤和神经退行疾病提供了新的理论基础和思路。
关丽娜[5]2015年在《低氧环境下Notch信号通路对人牙髓干细胞増殖和分化的影响》文中进行了进一步梳理人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)是一类来源于牙髓组织成体间充质干细胞,具有高度增殖和多向分化潜能的特性,因其取材方便、创伤小和免疫原性低等特点,已成为牙齿再生及组织工程中极有应用价值的种子细胞。低氧能够影响干细胞增殖、分化、凋亡及损伤修复等生物学进程。牙髓组织由于其特殊的解剖结构,当受到外部刺激如外伤、炎症等时,易引起缺血和低氧。已有的牙髓干细胞低氧相关研究表明,低氧状态会引起牙髓组织的防御性反应,并影响牙髓干细胞的增殖等生物学行为。作为一种高度保守的信号通路,Notch信号通路在细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。我们课题组已经发现低氧环境可以引起胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)中Notch信号通路活性增加,进而提高GSCs的增殖和自我更新能力,提示低氧对GSCs的影响可能是通过激活Notch信号通路来实现的。那么低氧环境下HDPSCs生物学性状会发生怎样的改变,Notch信号通路又是否在其中发挥作用呢?本课题借助MTT、克隆形成实验、茜素红染色、ALP活性检测、油红O染色、qpcr检测相关基因表达水平以及流式细胞术比较人牙髓干细胞在常氧和低氧条件下的增殖和分化能力的改变,并研究notch信号通路在其中的作用,以探究低氧对牙髓干细胞影响和机制,为进一步认识牙髓损伤修复机制并为牙髓干细胞在组织工程中应用提供依据。方法:1、hdpscs的分离、培养及鉴定:利用酶消化法和有限稀释法原代培养hdpscs,流式细胞术鉴定干细胞表面标记物,定向诱导分化鉴定细胞分化潜能。2、notch信号通路对人牙髓干细胞增殖与分化能力的影响:在hdpscs培养体系中加入notch通路阻断剂gsi,通过mtt细胞增殖实验、克隆形成实验、矿化和成脂诱导、茜素红染色、alp活性检测、油红o染色、相关基因表达水平的检测等实验观察比较notch信号通路阻断对hdpscs增殖与分化能力的影响。3、低氧对人牙髓干细胞增殖与分化能力的影响:应用二氯化钴(cocl2)模拟体外细胞低氧环境,通过mtt细胞增殖实验、矿化和成脂诱导、茜素红染色、alp活性检测、油红o染色、相关基因表达水平的检测以及流式细胞术等实验观察比较常氧和低氧条件对hdpscs增殖与分化能力的影响。4、低氧环境下notch信号通路阻断对人牙髓干细胞增殖与分化能力的影响:通过mtt细胞增殖实验、矿化和成脂诱导、茜素红染色、alp活性检测、油红o染色、相关基因表达水平的检测以及流式细胞术等实验观察低氧条件下notch信号通路阻断对hdpscs增殖与分化能力的影响,分析notch信号通路在其中所发挥的介导作用。结果:1、在体外成功分离和培养hdpscs,显微镜下观察可见贴壁细胞多呈梭形或多角形成纤维样细胞克隆,胞体伸展良好、胞浆均匀、核圆、核仁清晰;免疫荧光实验结果显示nestin、gfap表达阳性;流式细胞鉴定结果显示间充质干细胞的标志物stro-1、cd90、cd105以及血管内皮细胞标记分子cd146在hdpscs上均为高表达,而造血系标志物cd45及内皮系标志物cd31为不表达。传代扩大培养后的hdpscs经矿化诱导后经茜素红染色显示为红染的圆形小结节,同时alp活性也随矿化诱导时间增加而升高;经成脂分化诱导两周后显微镜下观察逐渐可见有脂滴形成,油红-o染色呈阳性反应,提示我们获得的hdpscs具有良好的增殖能力与多向分化潜能。2、notch信号通路对hdpscs增殖与分化能力的影响:(1)notch通路阻断剂gsi抑制hdpscs中notch信号通路活性:加入notch通路阻断剂gsi,hdpscs的notch下游靶基因hes1表达水平相比未加gsi的对照组细胞显着降低,说明经gsi处理后的hdpscs中notch信号通路活性被抑制。(2)notch信号通路对hdpscs的影响:荧光定量反转录pcr结果显示,notch信号通路阻断后hdpscs的干性分子oct4和c-myc的表达显着降低;mtt和细胞克隆形成实验结果显示notch通路阻断后的hdpscs增殖与克隆形成率下降(p<0.05),提示notch信号通路阻断可抑制hdpscs增殖能力;经矿化诱导并加入gsi后的hdpscs经茜素红染色镜下可见红色矿化结节显着多于对照组(p<0.05),alp活性也明显高于对照组(p<0.05),成骨相关基因runx2、ocn和成牙本质相关基因dspp的表达水平明显高于对照组(p<0.05);经成脂诱导并加入gsi后的hdpscs经油红-o染色呈阳性反应,且成脂相关基因pparγ的表达水平明显高于对照组(p<0.05),提示经gsi处理后的hdpscs的成骨和成脂的诱导分化能力增强。以上结果提示notch信号有助于促进牙髓干细胞增殖但抑制细胞分化。3、低氧对hdpscs增殖与分化能力的影响:反转录pcr和westernblot实验结果显示,低氧诱导因子hif-1α分子的表达随着cocl2浓度增加而升高,表明cocl2可以有效模拟低氧环境并具有剂量效应;通过实时荧光定量反转录pcr实验检测干细胞相关分子的rna表达水平,结果显示:低氧条件下hdpscs的干性分子oct4和c-myc的表达较常氧条件下明显上调(p<0.05);mtt实验结果显示:低氧可以促进hdpscs的细胞增殖(p<0.05);流式细胞检测结果显示:低氧条件下hdpscs的g1期细胞比例较常氧条件下显着降低(p<0.05);Annexin V/PI双染法检测的结果显示低氧对HDPSCs细胞凋亡并无显着影响(P>0.05);诱导分化实验结果显示:HDPSCs在低氧状态下表现为分化能力减弱。以上结果说明低氧培养环境促进牙髓干细胞增殖但抑制细胞分化。4、低氧条件下阻断Notch信号通路对HDPSCs增殖与分化能力的影响:实时定量PCR检测结果显示Notch下游靶基因Hes1的表达水平随着CoCl2浓度的增加而上升,提示在CoCl2模拟低氧环境下,Notch信号通路被激活。MTT实验结果显示:Notch信号通路阻断后低氧对HDPSCs的细胞增殖的促进作用被抑制(P<0.05);流式细胞检测结果显示:低氧条件下Notch信号通路阻断后HDPSCs的G1期细胞比例又显着上升(P<0.05);Annexin V/PI双染法检测的结果显示Notch信号通路阻断对HDPSCs细胞凋亡并无显着影响(P>0.05)。当Notch信号通路阻断后,低氧上调HDPSCs Oct4和C-myc表达以及抑制细胞分化的作用被逆转(P<0.05)。以上结果表明Notch信号通路介导低氧对牙髓干细胞的作用。结论:Notch信号通路参与维持HDPSCs的干性;低氧对人牙髓干细胞有促进增殖,增强干性以及抑制分化的作用;阻断Notch信号通路后可有效抑制低氧对HDPSCs细胞干性、增殖和分化能力的影响,提示低氧对人牙髓干细胞增殖与分化的影响作用可能是与Notch信号通路的激活有关。对于低氧影响牙髓干细胞增殖与分化功能的详细机制,后续研究将从低氧诱导因子Hif-1α和Hif-2α与NICD的相互作用着手,进一步讨论低氧激活Notch信号通路的分子机制,以深入探究低氧对牙髓干细胞影响和机制。
李晓莉[6]2008年在《低氧条件下骨髓间充质干细胞在中空纤维膜反应器中的扩增》文中认为骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类存在于骨髓间质层的极少量细胞,不但具有强大的自我更新及多向分化潜能,还具有支持造血的重要功能,并且植入反应弱,易于被外源基因转染并稳定表达,是组织工程和细胞/基因治疗中较为理想的种子细胞,受到广泛关注。但是骨髓中的MSCs的含量非常少,并且在正常培养条件下细胞在传代过程中容易失去增殖和分化活性,这极大影响了间充质干细胞的可用性。所以在扩增过程中,如何在保证增殖数量的同时,减少在细胞增殖过程中产生的损伤,保持干细胞的特性及分泌基质的能力,这是组织工程中首先应解决的问题,也是临床利用这些细胞治疗疾病的前提。为了提高间充质干细胞的扩增倍数并保持干细胞的特性,本文在低氧条件下采用灌注式中空纤维膜生物反应器(Hollow-fiber Membrane Bioreactor)进行体外扩增MSCs。采用密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,将第五代MSCs接种于醋酸纤维素中空纤维膜上预培养24小时后,转移至反应器中。根据骨髓中溶解氧对应的气相氧气浓度的范围是1%-7%,用叁气培养箱制造低氧环境,低氧组设为5%O_2,对照组为20%O_2。连续培养7天后,收获细胞。通过计算细胞的扩增倍数、成纤维细胞-集落形成实验、多向诱导分化检测和流式细胞仪分析,考察低氧动态环境对骨髓间充质干细胞增殖的影响。结果表明,低氧条件下在灌注式中空纤维膜生物反应器内,O_2含量基本保持恒定;MSCs扩增倍数明显增加,7天后扩增倍数达到11倍,明显高于常氧组8倍的扩增倍数。在低氧动态环境下扩增的细胞具有更强的成集落能力,低氧组集落数为112,而对照组为53,并且细胞的增殖潜能和代谢活性都有所增强。多向诱导分化检测和流式细胞仪分析结果显示,骨髓间充质干细胞在低氧动态条件下培养具有更强的诱导分化能力,保持了较好的干细胞特性。因此,本文所采用的培养方法是体外培养与扩增MSCs的一种有效的方法。
黄贵婷[7]2017年在《低氧对水牛脂肪干细胞增殖和多能性维持的影响》文中提出本研究旨在探讨低氧环境对水牛脂肪干细胞增殖及其生物学特性维持的影响。I型胶原酶从水牛颈部脂肪组织中分离得到水牛脂肪干细胞(buffalo adipose-derived stem cells,bASCs),然后检测分析bASCs在低氧(5%O_2)和常氧(20%O_2)培养条件下的细胞形态和集落形成情况,增殖与凋亡基因的表达情况,成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)和血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)的分泌量。同时,检测分析经低氧和常氧培养条件连续传代的bASCs间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)标志基因和多能性相关基因表达情况,探讨低氧环境下 HIF-1(hypoxia induced factor-1)通路、bFGF 和VEGF对bASCs增殖的影响及其机理。研究取得如下结果。(1)0.1%Roche I型胶原酶分离所得的原代bASCs在接种4 h后开始贴壁。48h后显微镜下观察细胞呈多边形和类成纤维细胞形态的梭型,并呈旋涡状生长。bASCs在低氧环境中连续传代后仍呈立体的类梭子形态,而在常氧条件下传至P9后呈松散趋势,少量细胞有空泡。低氧培养的bASCs增殖速率及集落数显着高于常氧(P<0.05)。低氧显着上调bASCs促增殖基因KI-67、抗凋亡基因Bcl-2、生长因子相关基因bFGF和VEGFR-1的表达(P<0.05),且显着下调促凋亡基因Caspase-3、Bax的表达(P<0.05)。低氧显着促进bASCs分泌生长因子bFGF、VEGF(P<0.05)。(2)在低氧环境下抑制bFGF相关通路,bASCs的增殖受到抑制,HIF-1α的表达和bFGF、VEGF的分泌下降;抑制HIF-1α的表达,细胞增殖、bFGF和VEGF的表达与分泌亦下降;但在抑制HIF-1α的同时添加bFGF和VEGF可以缓解由于抑制HIF-1α造成的bASCs增殖减慢。(3)bASCs在低氧和常氧条件下均能表达多能性基因OCT4、SOX2、C-MYC、NANOG和KLF4,以及间充质干细胞表面标记抗原CD44、CD60、CD73、CD90和CD105,但不表达造血干细胞的表面抗原CD45。低氧显着上调多能性相关基因OCT4、NANOG、C-MYC的表达(P<0.05)。低氧显着上调成脂、成骨、成软骨标志性基因PPAR-γ、RUNX2、COL2A1的表达(P<0.05)。低氧培养的bASCs,其神经细胞标志基因TUBB3阳性率也显着高于常氧培养的 bASCs(P<0.05)。上述结果表明,bASCs可以通过I型胶原酶分离获取,获得的bASCs具有MSCs的生物学特性;5%低氧环境培养bASCs,可以通过低氧通路中HIF-1α与bFGF、VEGF相互作用促进bASCs增殖,降低细胞凋亡;5%低氧培养bASCs,更有利于其多能性的维持和多向分化潜能的提高。
赵惠卿[8]2004年在《低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响》文中提出氧是生命存在的必要条件，是机体新陈代谢和维持生存的重要因素之一，而低氧是生命发育的基本环境。在妊娠的早期，由于没有血管的形成，所以胚胎是在低氧环境中发育的。低氧作为一种生理性的刺激因素，影响着胚胎的发生、发育及正常功能的维持。低氧可激活低氧诱导因子(HIF-1)，从而调控一系列与缺氧相关基因的表达。例如，诱导与葡萄糖分解、转运、红细胞和血管再生等相关的基因，使其表达增加，从而维持体内氧环境的稳态。关于低氧作用的研究，目前多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面，而对低氧在细胞增殖、分化中影响的研究较少。特别是胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES细胞)体外培养和增殖分化作用的研究都是在常氧(20％O_2)条件下进行的，这样难以反映体内的真实情况。低氧在体内作为一种生理性的刺激因素，对体外培养的ES细胞增殖和分化的作用目前还不清楚，也没有引起科研人员的足够重视。因此，本文就低氧对ES细胞体外增殖和分化作用的影响进行了初步研究。 1．低氧对ES细胞体外增殖的作用 利用细胞记数法和BrdU(5-溴脱氧尿苷)掺入的流式细胞分析检 硕士学位论文低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响测低氧对ES细胞的增殖作用，并用RT一PCR和western一B10t蛋白印迹杂交的方法初步检测了ES细胞中低氧诱导因子一l(HIF一la)的表达变化。结果显示:(l)将ES细胞分别放在低氧(3%02和10%仇)和常氧(20%02)的环境中培养24小时后，在低氧环境中培养的ES细胞数较常氧组明显减少。(2)将ES细胞分别给予间歇性低氧刺激(3% 02和10%02)，每天10分钟，连续4天后，发现3%低氧组较常氧对照组的细胞增殖明显升高。(3)我们又进一步用RT一PCR方法观察HIF一IQmRNA的表达与细胞增殖的关系，发现在常氧环境中培养的ES细胞即有H工F一IQmRNA的表达，ES细胞在持续低氧24小时或间歇性低氧(3%02和10%02)刺激4天后对HIF一la的表达均无明显影响。(4)western一Blot蛋白印迹杂交结果表明:持续低氧和间歇性低氧后，常氧组与低氧组间HIF一IQ蛋白表达量无明显差异。2.维甲酸(RA)诱导ES细胞向神经细胞方向分化的方法建立 常规培养的ES细胞，以3x105/ml的密度接种于细菌培养皿，在含20%胎牛血清的分化培养基中即可自然分化形成拟胚体(Embryonicbody，EB)。EB经RA的诱导向神经细胞方向分化。本研究中，我们主要采用了自然分化的EB形成4天后，加入RA(终浓度为 5X10一7M)诱导4天，即4d+4dRA诱导分化的方法，诱导结束后，收集EB，单细胞接种于涂l%明胶的细胞培养皿中。然后换成无血清DMEM/F12高糖培养基，同时添加终浓度为2%的NZ神经营养因子培养。结果显示:(l)4d+4dRA方法可诱导出nestin阳性的神经前体细胞，且分化率达90%以上。(2)4d+4dRA方法可诱导出较多NeuN免疫反应阳性的神经元样细胞。3.低氧对EB的形成及向神经前体细胞方向分化的影响 ES细胞常规培养液中撤除白血病抑制因子(LIF)和脱离饲养层培养，即可自然分化为EB。我们选择5x104/ml接种ES细胞于细菌培养皿，使之自然分化形成EB，并给予持续性低氧(3%02)4天后，EB 硕士学位论文低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响形成较常氧组减少，且低氧组EB数随低氧培养时间的延长而逐渐降低，即低氧组12天时形成的EB数少于8天时，低氧8天时则少于4天时。 为了观察低氧对体外诱导ES细胞向神经前体细胞分化过程的影响，我们用nestin标记流式细胞方法检测ES细胞向神经前体细胞的分化情况。常规培养的ES细胞以3x105/ml密度接种于6Omm细菌培养皿，培养4天形成EB，第五天开始分组，即RA组;低氧组;低氧加RA诱导组。RA组:ES自然分化形成EB4天后，再加5 X10一，M RA诱导4天;低氧组:ES自然分化形成EB4天后，再给予持续低氧条件培养4天;低氧加RA诱导组:ES自然分化形成EB4天后，再同时给予持续低氧条件和添加sxlo一7MRA诱导培养4天。流式细胞检测结果表明低氧促进体外诱导ES细胞向神经前体细胞的分化，细胞免疫组化结果进一步加以证实了此现象。 综上所述，低氧对ES细胞体外增殖和分化均有影响。就本实验而言，持续性低氧抑制ES细胞的体外增殖，而间隙性低氧(3%02)可促进ES细胞的体外增殖;持续性低氧或间歇性低氧后，ES细胞内HIF一1 a mRNA表达都无明显变化;持续性低氧和间歇性低氧后，低氧和常氧组间无明显差异;低氧(3%02)抑制ES细胞体外自然分化形成EB;单纯低氧(3%02)抑制ES细胞体外分化为nestin染色阳性的神经前体细胞;而低氧(3%02)并同时添加RA诱导分化组与单纯RA诱导分化组比较，则促进其向nestin染色阳性神经前体细胞的分化。
熊雷[9]2010年在《生理性低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究》文中指出神经干细胞(neural stem cells, NSCs)具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,在神经功能损伤修复以及相关中枢神经系统疾病的治疗中具有重大的应用价值。NSCs体外培养技术的发展为干细胞移植提供了稳定而安全的来源。对临床应用来说,NSCs是否具有良好的增殖状态和定向分化能力十分重要。传统NSCs培养系统一般都采用20%O2的大气氧浓度,实际上在发育过程与成年脑组织中,局部氧水平较低,平均约1—5%,一些学者称之为“生理性低氧”。这种局部微环境低氧对NSCs增殖与分化的影响尚没有引起人们的注意。最近的研究发现低氧这一物理因素能够有效促进体外培养NSCs的增殖,并能调节NSCs的分化方向,低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1,HIF-1)可能在这一过程中发挥着重要作用。但是关于低氧调控NSCs发育的具体机制仍有许多未明之处。miRNAs (microRNAs)是内源产生的一类～22 nt大小的非编码RNA,它可以通过翻译抑制或RNA剪切影响多种靶基因的表达,从而调控细胞的生长发育等。研究发现多种miRNAs在神经系统中时序性和组织特异性地表达,表明它们在神经系统的发育中可能具有重大的调控作用。低氧作为胚胎发育和成年脑组织的生理环境,很可能通过调节这些miRNAs的表达而影响神经干细胞的增殖和分化。本研究利用微阵列技术筛选了一批在NSCs中特异表达和表达水平受低氧调控的非编码RNA,并对其中表达水平变化明显的miRNAs进行验证。然后我们选取了低氧下表达变化最显着的miR-210,从HIF-1调控通路和DNA甲基化调控两个方面深入研究低氧诱导miR-210表达的机制,并对miR-210在NSCs中的功能进行了初步探索。一、NSCs的分离培养鉴定以及低氧时NSCs中HIF-1α稳定的机制我们从E13.5的SD大鼠中脑分离培养出生长状态良好的NSCs,将细胞用免疫荧光染色进行Nestin鉴定,结果表明几乎所有的细胞都表现为Nestin阳性。用血清诱导NSCs分化后,我们用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志蛋白Tuj1 (β-tubulinⅢ). GFAP和CNPase来评估培养细胞的分化潜能,结果表明NSCs能成功地分化出叁种细胞型。这些实验表明我们成功地获取了具有自我更新和分化能力的NSCs,可用于后续的实验。前期的研究显示HIF-1在低氧促NSCs增殖中发挥着关键作用,我们又进一步补充了HIF-1a在低氧下稳定的机制。将NSCs分别置于20%02和3%02环境培养1、3、6、12、24、48、72 h, Western Blot检测表明低氧诱导了不同时间点HIF-1a的表达。而用HSP90的特异性抑制剂格尔德霉素(GA)处理NSCs能时间依赖性和剂量依赖性地下调HIF-1a的蛋白表达水平,并显着降低HIF-1的靶基因VEGF和EPO的表达。用CCK-8法检测发现与20%02相比,3%O2能显着提高NSCs的存活率,而GA处理后细胞存活率显着下降。另外,用流式细胞法检测NSCs的增殖指数(PI)和细胞周期发现低氧能显着促进NSCs的增殖,并增加了S期的细胞,GA处理后则能逆转这一效应。研究表明HSP90参与维持了HIF-1a的蛋白稳定,抑制HSP90活性能降低HIF-1α的蛋白水平并影响NSCs的增殖。二、低氧下NSCs中表达变化的miRNAs的芯片筛选及表达验证将生长状态良好的NSCs分别置于常氧(20%02)和低氧(3%02)环境培养叁天后,用非编码RNA (ncRNAs)芯片分析低氧对NSCs中ncRNA表达的影响。研究显示15种低氧后表达明显上调的ncRNAs和11种表达下调的ncRNAs。接着用Real-Time PCR的方法选取一批低氧表达上调的miRNAs进行表达验证,结果表明低氧能诱导miR-210、376a、221、497、338、301、148a、34a、146b、181d、350、29b和344等的表达增加,其中miR-210变化最为显着,NSCs在3%02环境培养3天后,miR-210表达水平上调了15倍,在0.3%02环境则上调了80倍之多。对这些miRNAs的调控序列进行生物信息学分析发现其中miR-210、miR-338、miR-497、miR-29b/29c和miR-148b这6种miRNA调控序列含有HIF-1的识别序列HRE元件,提示低氧时它们的表达可能与HIF-1途径相关。叁、低氧时NSCs中miR-210表达调控机制的研究为了研究HIF-1是否调控了miR-210等的表达,我们将miR-210、miR-338和miR-497叁种miRNA的调控序列构建到pGL3-Basic荧光素酶载体中,同时构建了pEGFP-HIF-1过表达载体。载体共转染HeLa细胞后,用双荧光检测法检测荧光素酶活性,发现低氧能显着上调pGL3-210荧光素酶活性,而过表达HIF-1在常氧时也能显着增加pGL3-210荧光素酶活性。结果表明HIF-1直接参与了miR-210的表达调控,而miR-338和miR-497的表达则不受影响。此外,我们用染色质免疫沉淀法(ChIP)分析,发现从HIF-1蛋白上洗脱的DNA模板中能扩增出miR-210调控序列片段,证明了HIF-1直接结合miR-210基因序列从而调控其表达。我们接着分析了DNA甲基化对miR-210的表达调控。软件分析发现miR-210的基因正处于一个密集的CpG岛内。用DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine(Aza)处理NSCs后,定量PCR检测发现常氧下miR-210表达剂量依赖性地上调,用2μM Aza处理细胞48 h可以使miR-210的表达量增加3.75倍,而作为对照,调控序列上没有CpG岛的miR-338则表达完全不受Aza的影响。用重亚硫酸盐测序法检测了20% O2、3% O2和0.3% O2叁种环境下培养3天的NSCs中miR-210调控序列的甲基化水平,结果发现在基因片段上的63个CG位点中有26个位点检测出了甲基化修饰状态的存在。miR-210基因的甲基化水平在3%02和0.3%O2时分别下降了22%和49%。其中第58位CG位点由常氧时的半甲基化状态在低氧后变成接近去甲基化状态。上述结果表明低氧能够通过降低miR-210调控序列的甲基化水平而上调其表达。我们进一步对NSCs中DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase, Dnmts)和组蛋白乙酶转移酶(histone acetyltransferase, HAT)的表达及活性进行了分析。结果显示0.3%02能显着下调Dnmt3b的表达水平。而Dnmts家族的活性在低氧后呈下降趋势,HAT活性则在低氧后呈上升趋势。结果表明低氧有可能通过降低NSCs中Dnmts活性并增强HATs活性,来降低DNA甲基化水平并促进组蛋白乙酰化使染色质空间结构打开,从而有利于转录因子和RNA聚合酶对基因的转录调控。四、miR-210在神经干细胞及组织发育中的功能研究在本部分研究中,我们用miR-210的慢病毒过表达载体转染NSCs, CCK-8检测发现过表达miR-210能显着增强NSCs在缺氧环境中的存活率。另外,我们检测了E13、E17和E21胎鼠脑组织中miR-210的表达,发现随着胎龄增长,miR-210表达量也显着增加。合成特异抑制miR-210功能的寡核苷酸后,用子宫胚胎电穿孔法将其转染到E16大鼠胚胎的侧脑室中,发现miR-210功能被抑制的胎鼠发育停滞并表现出致死效应,而对照组则正常存活。这些结果表明miR-210可能在神经系统的发育中具有重要的调控作用。综上所述,HIF-1在低氧促进体外培养NSCs的增殖中起着重要的作用。低氧上调了一系列miRNAs的表达,其中miR-210表达水平变化最为明显。低氧一方面维持了HIF-1α的稳定,另一方面降低了miR-210调控序列的甲基化水平并影响组蛋白乙酰化,使DNA空间结构打开,加强转录因子和RNA聚合酶的结合从而上调miR-210的表达。miR-210的表达受转录因子HIF-1和DNA甲基化的共同调控。而低氧环境下NSCs中miR-210的高表达对于细胞的存活和组织的正常发育是必需的。
黄广海[10]2016年在《自噬在低氧促神经干细胞增殖及在脑缺血损伤中的调节作用》文中研究说明神经干细胞(Neural Stem Cell,NSC)是指具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力,能自我更新并能生成大量脑组织细胞的细胞群。在胚胎期,神经干细胞主要分布在大脑的皮层、海马、纹状体和中脑等区域;在成年期,神经干细胞主要局限在海马齿状回SGZ、环绕侧脑室的室脑膜下层SVZ和纹状体。神经干细胞因其具有自我更新能力和分化能力,通过移植神经干细胞给治疗神经退行性疾病带来了新的希望,因而对神经干细胞的增殖和分化的研究是最近几年的热点。神经干细胞的增殖受到多方面因素的影响和调节,其中内因主要有基因、神经干细胞内蛋白、转录因子等,外因则包括神经干细胞的营养因素、细胞间相互作用、各种理化因素如低氧等。在哺乳动物中由于脑部区域的特殊构造,通常情况下在胚胎发育阶段和成年脑组织中氧含量只有3%-5%,称之为“生理性低氧”。因此,研究生理性低氧情况下神经干细胞的增殖情况具有重要的生理意义。本实验即在生理性低氧条件下开展对神经干细胞增殖特性的研究,从细胞代谢的角度阐释低氧对神经干细胞增殖的调控作用。自噬(autophagy)是溶酶体介导细胞内蛋白质和细胞器降解的正常新陈代谢过程,在维持细胞自身内环境稳定,保护细胞免受应激损伤等方面发挥着重要作用。在各种应激状态下,自噬被激活,可以清除细胞内异常折迭的蛋白质和衰老、受损的细胞器,促进细胞的存活,但如果细胞自噬被过度激活,细胞自噬压力超出细胞自身可调节的程度,也会加速细胞的死亡。在神经干细胞的低氧过程中自噬会起到什么作用还不得而知。Wip1(Wild type p53-induced phosphatase 1)是一种原癌基因,属于丝氨酸/苏氨酸家族成员的磷酸酶,因此关于Wip1的研究主要集中在识别Wipl的靶蛋白与去磷酸化位点上。到目前为止已经发现至少7种Wipl靶蛋白,包括与细胞增殖周期密切相关的p53、p38等,Wip1通过使p53、p38发生去磷酸化解除它们抑制细胞增殖的作用,从而在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用。那么,在神经干细胞低氧过程中Wip1是否参与对细胞增殖的调控?该调控作用是否与自噬调节相关?本文将就这些问题分别进行讨论。在本研究中,我们采用3%O2低氧模型(以20%O2为常氧对照)首先探讨了低氧条件下神经干细胞中自噬的变化,及其对细胞存活的影响;然后检测了Wip1在低氧过程中的表达变化及其对细胞存活和自噬的影响,并进一步分析了Wip1与自噬在低氧条件下调节神经干细胞增殖时的关联。研究结果如下:1.低氧对神经干细胞活性的影响我们采用常氧(20%)和低氧(3%)对神经干细胞进行不同时间的处理,通过比较低氧和常氧对神经干细胞的存活和增殖的影响,以及不同氧浓度条件下神经干细胞中活性氧ROS的变化,探究低氧对神经干细胞活性的影响。1.1神经干细胞分离和培养取SD大鼠14.5天胚胎的中脑,接种于含有EGF,b FGF等因子的无血清培养基中,原代细胞经过一天的培养就可以观察到神经干细胞的增殖现象,神经干细胞悬浮在培养液中,2到3天可以观察到神经干细胞形成神经球,悬浮生长5天左右可以经消化传代。1.2神经干细胞的鉴定为了证明我们所分离培养的细胞是神经干细胞,我们取生长状态良好、大小合适的神经球,进行Nestin染色鉴定。实验结果显示,神经干细胞生长时成球状,神经球中绝大部分细胞显示Nestin染色阳性,结果证实我们培养的细胞确实为神经干细胞,且细胞纯度较高,可以进行后续的实验。1.3低氧对神经干细胞存活的影响我们用CCK-8实验比较不同氧浓度、不同低氧处理时间对神经干细胞存活能力的影响。实验结果显示,神经干细胞经过3%低氧24 h、48 h、72 h处理后存活能力显着提高,表明3%低氧能够显着促进神经干细胞的存活。1.4低氧对神经干细胞增殖的影响为了进一步探究低氧对神经干细胞增殖的影响,我们通过Brd U和HPI(Hypoxyprobe?-1 Kit)低氧探针掺入法观察了不同氧浓度下神经干细胞的增殖状态。结果显示:神经干细胞经过3%低氧处理后Brd U阳性细胞较常氧组明显增加,并且Brd U阳性细胞主要分布在神经球的外围,表明该部位是神经干细胞增殖的主要区域。1.5低氧对神经干细胞中ROS含量的影响低氧与ROS联系密切,正常含量的ROS可作为第二信使影响细胞周期,过量的ROS将会造成细胞损伤。我们进一步应用ROS荧光分子探针孵育神经干细胞,经过染色后用流式细胞仪检测分析。结果显示:与常氧对照组相比,神经干细胞经过3%低氧处理不同时间点后ROS都明显升高,48 h时增加最为显着,其含量增加了约2.5倍,低氧72 h ROS含量降低,但仍明显高于常氧对照组。1.6自噬(线粒体自噬)抑制剂Mdivi-1对神经干细胞中ROS含量的影响ROS主要是在线粒体中产生,线粒体自噬作为自噬的一种类型,我们又进一步检测了线粒体自噬抑制剂Mdivi-1处理神经干细胞24 h后神经干细胞中的ROS含量,结果显示:与常氧对照组相比,低氧组和常氧给药组ROS含量增加明显;与低氧组相比,低氧给药组ROS水平明显升高,以上结果提示3%低氧下ROS含量适度增加,抑制自噬(线粒体自噬)后神经干细胞中的ROS水平明显升高,且低氧下增加更多。2.低氧对神经干细胞自噬的影响自噬是细胞的一种代谢机制,当细胞中ROS水平过高时会激发自噬来保护细胞免受过量ROS带来的伤害。为阐明低氧下神经干细胞的自噬水平及其与ROS和细胞存活的关系,我们分别进行了以下实验:2.1低氧条件下神经干细胞自噬水平的变化将神经干细胞进行3%低氧处理,在不同时间点应用Western Blot、免疫荧光等方法观察其自噬情况。结果显示:和常氧对照组相比,经过3%低氧处理后神经干细胞的自噬水平显着增加。2.2抑制自噬阻碍神经干细胞的增殖为了进一步验证自噬对神经干细胞存活的影响,我们应用自噬抑制剂3-MA处理神经干细胞,不同时间点后对其进行CCK-8检测。结果显示:抑制自噬后无论是低氧还是常氧条件下神经干细胞的存活能力均降低,在低氧下降低尤其显着,这提示自噬对神经干细胞的增殖有显着影响。3.低氧条件下神经干细胞中Wip1的表达变化及其在细胞增殖中的作用Wip1作为与细胞增殖周期蛋白密切相关的磷酸酶,在细胞增殖过程中发挥着重要作用。为了探究低氧条件下Wip1对神经干细胞增殖的调节作用,我们进行了以下实验:3.1低氧条件下神经干细胞中Wip1的表达变化我们首先检测了不同氧浓度不同时间点神经干细胞中Wip1的表达情况。结果显示:在常氧条件下,Wip1在神经干细胞中有少量的基础性表达;在3%低氧处理后Wip1的表达量明显升高。我们进一步应用real-time PCR技术检测不同氧浓度不同时间点处理神经干细胞后Wip1的m RNA水平,发现低氧处理24 h和72 h,与常氧对照相比,低氧组的Wip1 m RNA无明显改变,低氧48 h其m RNA水平明显低于常氧组,这些数据提示Wip1的转录活性并没有贡献低氧下Wip1蛋白水平的增加。1.6自噬(线粒体自噬)抑制剂Mdivi-1对神经干细胞中ROS含量的影响3.2敲低Wip1后观察神经干细胞的存活情况为了进一步探究在低氧下Wip1对神经干细胞增殖的作用,我们应用si RNA技术敲低Wip1的表达,在低氧不同时间观察其对神经干细胞存活能力的影响。结果显示:用si RNA敲低Wip1表达,常氧和低氧下神经干细胞的存活能力都有所降低。3.3敲除Wip1后观察神经干细胞的存活情况进一步用Wip-/-小鼠来源的神经干细胞经低氧处理不同时间后同样发现低氧组与常氧组相比神经干细胞的存活率明显下降,且随时间增加更为显着,提示Wip1在低氧促神经干细胞增殖的过程中发挥着重要的调控作用。3.4敲低Wip1后对神经干细胞自噬活性的影响通过上述研究我们发现,自噬和Wip1都参与低氧下对神经干细胞增殖的调控,但是二者在调控神经干细胞增殖中的相互作用尚不清楚。为探明在低氧过程中Wip1与自噬的关系,我们先用Wip1 si RNA转染神经干细胞,然后以Western Blot检测si RNA干预Wip1后对神经干细胞自噬活性的影响。结果显示:应用Wip1 si RNA后低氧对神经干细胞自噬的激活作用受到抑制,常氧组未发现明显变化。综上所述,本研究证实了在低氧(3%)条件下神经干细胞的增殖能力增强,自噬水平随低氧时间增加而升高,同时发现在该低氧条件下神经干细胞中Wip1的表达水平升高,并初步阐明Wip1在调节神经干细胞增殖和促进自噬方面发挥重要作用。总之,本研究首次发现了低氧条件下在神经干细胞增殖过程中自噬和Wip1可能存在关联,这为探索低氧促进神经干细胞增殖的分子机制提供了新的思路。我们将在以后的研究中更深入地探讨自噬和Wip1在介导低氧促进神经干细胞增殖过程中的相互作用。脑卒中是一类严重危害人类健康的疾病,已经逐渐成为威胁人类生命的主要杀手。我国作为世界上人口最多的国家,随着人民生活水平的提高,我国的老年人数量在显着增加,与之而来的一些与年龄有关的疾病发病率也逐年增加,脑卒中作为其中的一种给患者本人及其家庭带来了的严重的负面影响。在脑卒中中其最主要类型是缺血性脑卒,缺血性脑卒中主要是由大脑动脉栓塞造成局部供血不足引起,可对脑组织造成严重损伤。由于缺血性脑卒中发病急促、治疗的时间窗短,危害严重,只有少数患者能够得到及时的治疗,因此进一步探究缺血性脑卒中的病理生理过程,为进一步的防治提供参考就显得尤为重要。自噬(autophagy)是一种细胞自身古老的自我保护机制,线粒体自噬作为其中的特殊类型,近年来成为研究的热点。线粒体自噬(mitophagy)是指在ROS(Reactive Oxygen Species,ROS)、营养缺乏、缺血/缺氧、细胞衰老等外界刺激的作用下,线粒体发生损伤或老化,受损线粒体被特异性识别包裹进自噬体中并进一步与溶酶体融合,从而将受损线粒体降解的过程,其概念由Lemasters等人在2005年首次提出,其最基本内容是:线粒体被自噬体包裹并运送至溶酶体进行分解代谢的过程。线粒体自噬活动受到多种分子蛋白的调节,而BNIP3作为其中的一种,其作用越来越受到关注。BNIP3(Bc1-2/adenovirus E1B 19 k D protein interacting protein 3)隶属于Bcl-2蛋白超家族,可与腺病毒转录基因E1B编码的E1B19k D蛋白或Bcl-2蛋白相互作用,在体内主要定位于线粒体外膜,BNIP3启动子区因含有结合HIF-1(HypoxiaInducible Factor 1,HIF-1)的低氧反应元件HRE,所以也是HIF-1的靶基因。在发生脑卒中时,机体发生缺血缺氧,此时HIF-1能够作用于BNIP3,使其表达水平上调。BNIP3的功能研究主要集中于两个方面:一方面BNIP3可以促进细胞凋亡或者坏死,起促进死亡的作用,另一方面BNIP3可以引起线粒体自噬,进而促进细胞存活。现在的研究热点越来越倾向于聚焦BNIP3的促存活作用。本研究采用大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型(permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,p MCAO),在MCAO处理不同时间后,观察BNIP3、线粒体自噬相关蛋白的表达变化,分析脑缺血损伤程度与BNIP3表达水平之间的关系,探讨线粒体自噬和BNIP3在缺血性脑卒中发病过程中的可能作用。本研究发现在脑缺血早期线粒体自噬被激活,缺血晚期线粒体自噬被抑制而导致脑损伤加重,在此过程中BNIP3可能发挥重要的调控作用。主要研究结果如下:1.脑缺血不同时间点大鼠脑梗死体积的变化1.1大鼠脑组织TTC染色为进一步评价大鼠p MCAO后的脑损伤情况,我们对p MCAO不同时间点处理的大鼠脑组织进行切片,用TTC染色来确定脑损伤程度。发现0 h(sham)组大鼠无脑梗死发生,其余各组均存在脑梗死区,且随缺血时间(3 h、9 h、24 h)大鼠脑梗死体积逐渐增加,24 h组脑梗死体积到50%以上。2.线粒体形态在脑缺血过程中的改变2.1 p MCAO后不同时间点线粒体自噬自噬体的变化用透射电镜观察p MCAO后不同时间点的线粒体自噬自噬体的形态和结构,0 h(sham)大鼠脑组织中神经细胞的线粒体结构正常,缺血3 h和9 h线粒体多变圆,并可见典型的线粒体自噬情况,线粒体被溶酶体包裹,形成具有双层膜的自噬溶酶体结构;缺血24 h线粒体形态结构受到严重破坏:双层膜结构不完整,嵴消失,线粒体肿胀明显加剧,且多呈空泡化,完全观察不到线粒体自噬结构。3.BNIP3和线粒体自噬相关蛋白在脑缺血中的表达变化3.1 p MCAO后不同时间点BNIP3表达的动态变化为检测p MCAO后不同时间点BNIP3的变化情况,我们收集p MCAO后不同时间点的脑组织进行Western Blot实验。实验结果显示,当p MCAO处理3 h和9 h时BNIP3蛋白表达水平升高,而p MCAO处理24 h时BNIP3表达水平下调,这提示BNIP3在p MCAO后不同时间点有先升后降的特点,其可能在脑缺血早期发挥作用。3.2 p MCAO后不同时间点线粒体自噬相关蛋白的变化我们又进一步检测了p MCAO后不同时间点线粒体自噬相关蛋白的表达变化,结果显示,当p MCAO处理3 h和9 h时自噬上游调控分子Beclin-1表达增加,自噬标记分子LC3-II/I比值升高,接头蛋白P62和线粒体标记蛋白TOM20、HSP60水平下降,提示线粒体自噬被激活;但是,随着缺血时间的延长这些蛋白表达发生了明显改变,脑缺血24 h时Beclin-1表达下调,LC3-II/I比值降低,而P62和TOM20、HSP60水平增加。以上结果提示,在脑缺血早期线粒体自噬被激活,而在脑缺血晚期线粒体自噬受到抑制。综上所述,本研究发现在脑缺血过程中线粒体自噬以及BNIP3的表达变化与脑缺血损伤程度密切相关:线粒体自噬在脑缺血早期被激活,而在脑缺血晚期受到抑制;BNIP3高表达有利于减轻缺血性脑损伤,BNIP3低表达可能会加重其损伤程度。该结果为今后研究BNIP3的潜在的脑保护作用提供了直接证据,同时也为临床治疗缺血性脑损伤疾病提供了新的干预靶点。
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