1，内蒙古医科大学 内蒙古呼和浩特 010059；2，广东医学院生理教研室 524023
3，湛江市霞山骨伤科医院 524030；4，湛江市索奇生物技术有限公司 广东湛江 524000
摘要：目的：通过检测MT-GAG对HgCl2引起的红细胞溶血率减少的百分数，考察其稳定性和活性。方法：用新鲜兔全血制备红细胞悬液，在使红细胞全部溶血的Hg离子环境中加入不同受热时间的MT、MT-GAG溶液，测定417nm下的吸光值。结果：MT-GAG在105℃受热30分钟时溶血率减少的百分数HMT≥77%。结论：MT- GAG比MT可耐受更长的受热时间，对HgCl2引起的红细胞溶血具有抑制作用。
关键词：MT；MT-GAG；红细胞溶血；抑制作用；汞
金属硫蛋白（MT）是一种广存于生物体内富含半胱氨酸的金属结合蛋白。自从Margoshes（1）首次从马肾中分离出金属硫蛋白后，对其在Cd、Hg、Pb等重金属解毒的重要性方面已有大量的研究报道（2-7）。在机体组织受到损伤、炎症、射线辐照和重金属含量增大时，体内的金属硫蛋白含量剧增，并参与机体应激时的细胞适应反应，是机体损伤的第一防御蛋白（8）。
糖胺聚糖（GAG）是由含已糖醛酸和己糖胺成分的重复二糖单元连接成的直链杂多糖。专利产品MT-GAG是糖胺聚糖与金属硫蛋白组成的糖蛋白，分子中的寡糖可通过改变蛋白质的疏水性、电荷、溶解度、粘度、质量和大小修饰蛋白质的理化性质，可起着稳定糖蛋白，使其能抵抗变性的作用。为验证MT-GAG的稳定性和活性，我们使用由广东湛江市索奇生物技术有限公司课题组提供的MT、GAG和MT-GAG进行实验，以观察105℃不同受热时间下三种物质对HgCl2引起的红细胞溶血的抑制作用。
材料、方法与结果：
1.材料：
MT、GAG和MT-GAG（均由湛江市索奇生物技术有限公司课题组提供）；氯化汞由贵州铜仁汞矿试剂厂生产；离心机（XY180-2T）；分光光度计（53WB UV/VIS）；三公斤以上的家兔由广东医学院动物中心提供；
2.方法与结果：
2.1红细胞悬液的制备：
取新鲜兔肝素抗凝血2ml，2500 r/min离心5 min，吸掉血浆与白细胞，红细胞用10倍PBS清洗后，2500r/min离心5 min，弃掉上清液，重复清洗三次后，配成1×108 红细胞/ml悬液，备用。
2.2氯化汞浓度与溶血率的关系：
测定Hg2+浓度0～2×10-4mol/L对兔血红细胞溶血的影响。取以上配制的红细胞悬液，吸取0.1ml，分别加入7.90ml不同浓度的HgCl2溶液（Hg2+浓度0～2×10-4mol/L），轻摇后于37℃温育30min，然后在3000r/min离心5 min，取上清液测定417nm下的吸光值，计算溶血率Hp=（A-A0）/（A∝-A0），式中A0为不加HgCl2时上清液的吸光值，A为加入一定HgCl2后对应的上清液吸光值，A∝为HgCl2浓度大到红细胞完全溶血时对应的吸光值。从下表中可见随Hg2+浓度增加，Hp%增大，当Hg2+浓度＞37.5×10-6mol/L时，Hp%有突跃，大于56.3×10-6mol/L时，红细胞全部溶血，试验重复5次取平均值。见表1。
2.3 MT对HgCl2引起的红细胞溶血的抑制作用：
取用NaCI调等渗后的1×10-6mol/L MT一定量，加入到2×10-5mol/L HgCl21.0ml溶液中，使MT与HgCl2浓度比达到一定值，用PBS调体积到7.9ml，混合均匀后，放置5min再加0.1ml红细胞悬液，使总体积为8 ml，轻摇后于37℃温育30min，然后在3000r/min离心5 min，取上清液测定417nm下的吸光值，每个浓度比分别以相应CMT浓度中不加HgCl2为空白对照管，试验重复5次取平均值。A∝=0.620±0.015是不加MT红细胞完全溶血时吸光值，计算溶血率减少的百分数HMT=1－A/ A∝，以下数据可以看出随体系中MT含量的增高，红细胞溶血率减少的百分数 HMT就增大。见表2。
2.4 MT、GAG与MT-GAG在不同受热时间对HgCl2引起的红细胞溶血的抑制作用：
取2.25×10-4mol/L HgCl2 溶液2ml，分别加入经105℃不同受热时间处理后1×10-6mol/L 的MT、GAG、MT-GAG 0.4ml，用NaCI调等渗，使MT、GAG、MT-GAG与HgCl2摩尔浓度比达到8.89×10-4，用PBS调体积到7.9ml，混合均匀后，放置5min再加0.1ml红细胞悬液，使总体积为8 ml，轻摇后于37℃温育30min，然后在3000r/min离心5 min，取上清液测定417nm下的吸光值。计算溶血率减少的百分数HMT=1－A/ A∝，=以HMT≥77%为不溶血，HMT＜77%为溶血。由表3中数据可以看出MT在105℃受热3分钟时可以保护红细胞不发生溶血，受热3分钟以上红细胞完全溶血；MT-GAG在105℃受热30分钟时仍可以保护红细胞不发生溶血，GAG没有保护红细胞不发生溶血作用。见表3。
讨论：
Hg2+与红细胞蛋白—SH和Typ结合成R—S—Hg+和R—Typ—Hg2+，阻碍膜的变形运动，造成膜的脆性增加，从而加速红细胞膜溶血，血红细胞中含大量血红蛋白，在417nm有强吸收，且浓度与吸收值呈线性关系。MT可以吸附在红细胞的表面，形成的吸附层会对细胞免受各种异物（重金属、自由基等）进攻起到积极的防护作用（9）（10）。加入MT后分子中的—SH夺取Hg2+，使红细胞膜受到保护，溶血率降低（3）。本实验显示HgCl2浓度为56.3 ×10-6mol/L时，红细胞溶血率为95.9%。当MT与HgCl2浓度比为0.2时红细胞溶血率减少的百分数77.7，证明MT 对汞中毒而引起的红细胞溶血有显著抑制作用，该点与文献报道相符（3）。在MT、GAG和MT-GAG的对比实验中，三种物质对Hg2+引起的红细胞溶血的抑制作用各有不同。其中，GAG没有抑制作用，MT和MT-GAG均有抑制作用，但MT-GAG对温度的稳定性较MT更强，可能是GAG多糖对MT蛋白产生了实质性的保护作用，具体机理有待进一步研究。
参考文献：
[1]Margoshes，M.，Vallee，B.L，J.Am.chem.Soc.，1957，79：4813~4814
[2]Webb.M.，Experimentia Suppl.，1987，52：109~134
[3]张保林等 ZnMT对汞化合物引起红细胞溶血的抑制作用 生物化学与生物物理学报 1993，25（4）425~431
[4]邱炳源 锌金属硫蛋白预防甲基汞对细胞膜损伤作用的实验研究 广东微量元素科学 1999，6（2）15~18
[5]吴怡 金属硫蛋白对大鼠体内铅促排作用的研究 环境与健康杂志 1998，15（6）
[6]李铉 金属硫蛋白的α、β结构域与铅结合形式及稳定性的研究 卫生研究 2001，30（4）198~200
[7]Zalaps RK.Renal MT metabolism after a reduction of renal mass.Toxicology，1992，71（1-2）：83~86
[8]Korin，M.，Metallothionein：protein in search of function.Cell，1985，4，9
[9]张保林等 金属硫蛋白与红细胞的相互作用 生物化学与生物物理学进展 1994，21（5）
[10]徐乐焱 锌金属硫蛋白拮抗甲基汞对红细胞膜损伤的作用 卫生研究 2000 29（2）
△基金项目：广东省湛江市科技攻关项目，项目编号：2012C01027
作者简介：张敏惠，1962年生，教授，从事药物分析研究。
* 通讯作者：李国跃，1958年生，工程师，从事生物制品研究及产品开发
论文作者:张敏惠1,陈春玲2,尤建芳3,许海珍4,李国跃4（通
论文发表刊物:《健康世界》2015年10期供稿
论文发表时间:2016/1/14
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