刘玉梅[1]2003年在《甘蓝显性细胞核雄性不育的细胞学特征、生化基础及其分子标记的研究》文中研究说明甘蓝(Brassica oleracea var capitata L．)雄性不育在杂种优势利用中具有重要价值。甘蓝显性细胞核雄性不育(DGMS)源79-399-3已在甘蓝类蔬菜的杂种优势中得到利用。但对该不育材料的败育机理以及相关的分子生物学等方面的研究仍较欠缺。本研究以甘蓝DGMS材料为对象，对甘蓝DGMS的花粉形态、花药发育过程中的超微结构变化、花蕾发育过程中的生理生化变化及与该不育基因连锁的分子标记的筛选等方面进行了深入、系统的研究。研究结果如下： 首次对甘蓝显性细胞核雄性不育花药发育过程中的超微结构观察表明：甘蓝显性细胞核雄性不育花药败育最早发生在花粉母细胞早期，败育高峰在花粉母细胞减数分裂前期至小孢子单核期。败育的主要特征是：细胞核、线粒体、内质网、质体、液泡等细胞器结构破坏或解体；部分花粉母细胞不能正常进行减数分裂；绒毡层提前解体；花粉母细胞和小孢子外被一层很厚的膜状物包被着而不能正常生长发育；四分小孢子不能分开。 光学显微镜和扫描电镜观察结果表明：甘蓝显性细胞核雄性不育花粉粒形态异常。主要表现为花粉染色浅或不染色；花粉壁破坏成细片状；花粉外壁凹陷、皱缩成毡帽状；多个花粉粘连成莲座状。未发育好的早期花粉粒为棉花状和花椰菜状细胞团。 甘蓝不同育性类型的花粉在-20℃同一保存天数下，花粉生活力出现较明显差异。在-20℃下，0～210天保存天数内，甘蓝显性细胞核雄性不育敏感株微量花粉生活力显着地低于可育花粉，显性细胞核雄性不育极度敏感株的花粉生活力在多数系统内与可育花粉无差异。在-20℃下0-210天期间，不同育性类型的花粉生活力随着保存时间的延长，生活力逐渐下降，下降的幅度差异较大。在花粉保存到120天以前，可育花粉与显性细胞核雄性不育极度敏感株的花粉的生活力下降率基本相同。花粉保存到60天以后，显性细胞核雄性不育微量花粉生活力下降率显着地高于可育株。 从甘蓝花粉母细胞至小孢子二核期，不育花蕾中内源激素IAA、GA_3、ZR的含量明显低于可育花蕾，小孢子二核至成熟花粉期不育花蕾中的IAA、GA_3、则高于可育花蕾。四分体到小孢子单核期和小孢子二核后期至成熟花粉期不育花蕾ABA含量仍高于可育花蕾。表明在甘蓝花蕾发育前期IAA、GA_3、ZR的亏缺，ABA的盈积与甘蓝显性细胞核雄性不育材料的败育密切相关，而花蕾发育后期IAA、GA_3、ABA的积累很可能是败育的结果。 甘蓝显性细胞核雄性不育大花蕾中的17种游离氨基酸总含量高于可育大花蕾。甘蓝花蕾发育的整个时期，不育花蕾中谷氨酸含量显着高于可育花蕾。在小抱子单核期以前(败育高峰期)，天门冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸在不育花蕾中的含量显着高于可育花蕾，小抱子单核期以后多表现相反。表明这些氨基酸在甘蓝显性细胞核雄性不育花蕾发育前期的过量积累与花药败育密切相关。 运用RFLP、SSR技术，采用集群分析法(BSA)进行了与甘蓝显性细胞核雄性不育基因连锁分子标记及分子辅助育种的研究。分别找到了与甘蓝显性细胞核雄性不育基因连锁的一个RFLp标记(pBNll)和一个SsR标记(eo3，50)，经两个回交群体的检测，pBNll与甘蓝显性细胞核雄性不育基因的连锁距离为1.787一5.189cM，C03180与该不育基因的连锁距离为4.30一8.94cM。经过对174份不同类型的甘蓝类自交系及多个回交转育后代的检测，表明这两个标记均可用于甘蓝显性细胞核雄性不育基因辅助转育及纯合不育基因型的鉴定。在辅助进行甘蓝显性细胞核雄性不育基因回交转育中预测准确力达93%以上。该不育基因位于甘蓝的第一或第八条染色体。 综上所述，本研究从细胞形态、亚细胞水平、生理生化和分子生物学水平上首次对甘蓝显性细胞核雄性不育机理及相关分子标记进行了系统的研究。明确了该不育材料花药败育的时期和主要特征，探明了甘蓝显性细胞核雄性不育在某些生理生化方面的败育机理，筛选出两个分子标记并应用于实践。进一步揭示了甘蓝显性细胞核雄性不育发生的本质，为该基因的克隆、人工调控植物育性的表达及其分子育种提供了依据。对该不育基因在甘蓝类及其它十字花科作物中更有效、合理地利用具有重要意义。
舒金帅[2]2016年在《青花菜雄性不育系开花结实特性及花蜜分泌调控机制的研究》文中研究说明青花菜(Brassica oleracea var.italica)是一种重要蔬菜作物,利用雄性不育系进行新品种选育和杂交种子生产是其杂种优势利用的重要途径。我国青花菜遗传育种起步较晚,目前主要通过引进国外资源寻找优良的不育源,但引种获得的细胞质雄性不育(CMS)源的遗传背景往往不明确,常导致同一类不育源的重复转育,有的不育源在实际应用中存在死花蕾严重、雄蕊心皮化、开花时间晚、花小、花蜜分泌量少和制种产量低等问题。因此,解决上述问题对青花菜产业的发展具有重要的意义。本研究以青花菜自交系、CMS材料和显性细胞核雄性不育(DGMS)系为试材,对CMS材料的开花结实特性及不育源来源、雄蕊心皮化、死花蕾的基因表达特征、开花时间和花大小的遗传模式、蜜腺发育及花蜜分泌的调控机制进行了系统深入的研究,以期明确不同来源的不育源对青花菜开花结实特性的影响,开发出区分雄蕊心皮化的分子标记,发现参与死花蕾调控的基因,获得开花时间和花器官大小的遗传模式,解析花蜜分泌的调控机制。研究结果如下:1、不同来源的不育源转育获得的CMS系的开花结实特性和蜜蜂访花情况差异明显;筛选出4份开花结实优良的CMS材料:CMS738、CMSGD、CMS1169和CMS1183。2、首次获得1个能区分雄蕊心皮化和非心皮化细胞质的线粒体标记mtSSR2,雄蕊心皮化多态性产物与萝卜和埃塞俄比亚芥相似性最高,与非心皮化相比缺失51个碱基。3、青花菜39份不同来源CMS资源中均含有萝卜orf138片段,均属于ogu CMS类型,当相似系数>0.89时,39份CMS资源分为5个组,ogu CMS R3类型占79.49%。4、死花蕾与多聚半乳糖代谢、糖基水解、氧化还原过程、苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成相关,首次发现了12个可能参与调控死花蕾的基因和2个转录因子ERF115和bHLH137。5、花冠和花瓣宽、雄蕊和花药长受多基因控制,开花时间、花瓣和柱头长受两对主基因+多基因控制,花柱长受一对主基因+多基因控制。在2号染色体0.9-2.9 Mb获得主控开花时间、花瓣宽和花柱长的QTL,分别记为ft2.1、pw2.1和sl2.1。ft2.1的候选区域为228Kb,包含29个基因,其中14-3-3蛋白在拟南芥中促进开花。pw2.1和sl2.1存在共定位现象,候选区域为191.66Kb,包含21个基因,其中E3泛素连接酶在拟南芥中调控花器官大小。6、首次明确了保持系、DGMS系和ogu CMS系间花蜜分泌量和含糖量、蜜腺发生和发育过程中的异同。明确了花蜜分泌的细胞学途径:原蜜汁由筛管产生,通过孔状和泡状结构及胞间连丝运输,以淀粉粒形式贮存,在高尔基体和内质网中加工,通过蜜孔分泌。分析了导致上述材料花蜜分泌差异的相关基因,获得1个在DGMS系中高表达的特异性基因。
刘红艳[3]2013年在《芝麻细胞核雄性不育的遗传特性、生理生化及分子标记研究》文中认为芝麻是我国重要的油料作物之一,它富含脂肪、蛋白质、维生素A、维生素E、芝麻酚、芝麻明等营养物质,具有养颜抗衰老作用,是良好的保健食品。长期以来,选育高产、优质、抗病芝麻新品种一直是育种家的主要目标。实践证明,利用杂种优势可以大幅度提高农作物的产量。目前芝麻杂种优势利用的主要途径是细胞核雄性不育,已发现的具有实际利用价值的芝麻雄性不育材料不多,而且几乎都是隐性细胞核雄性不育类型,其特点是恢复源广泛,转育容易,但只能以“两系”的形式加以利用,在制种过程中需要大量拔除不育系中一半的可育株,费时费力,限制了其在生产上的大面积应用。在油菜等作物中,已经发现了显性和隐性的细胞核雄性不育类型,这些材料都存在保持系(临时保持系),可以实现“叁系”配套,因而在生产上得到广泛应用。上述进展为开展芝麻的杂种优势利用研究提供了良好借鉴。本研究通过自然突变、远缘杂交和回交转育,创制出两个新的芝麻不育系D248AB和W1098AB；以这两个新不育系为实验材料,系统开展了育性遗传分析、花粉败育形态特征、花药败育细胞学过程和生理生化基础、雄性不育性状的分子标记、强优势组合的选配等研究工作,取得的主要研究结果如下：1.芝麻隐性细胞核雄性不育系D248AB的创制与遗传分析在常规品种驻芝4号繁种圃中发现了2株天然不育株,通过多代兄妹交保持和选择,获得了兄妹交后代育性分离比例为1：1、可育株自交后代分离比例为3：1的不育系D248AB。该不育系与6份材料测交,F1后代全部可育；将F1自交,F2代出现3：1育性分离；F1与D248A回交,后代出现1：1的育性分离,由此推断D248AB的育性受1对隐性核基因控制。该不育系的花药呈绿色、扁平、卷曲状,用手捏无粉状物；花粉粒形状不规则,醋酸洋红染色浅或无染色；花粉粒在培养基中不能萌发,表明其败育十分彻底。不育株的花期比95ms-2等不育系长10-12天,单株产量高42-95%。D248A与4个骨干亲本测配,F1杂种的产量在931.4-13191kg/ha之间,比对照品种(中芝14)增产4.99-48.70%,增产潜力巨大,育种应用前景广阔。2.芝麻显性细胞核雄性不育系W1098AB的创制与遗传分析以野生芝麻(Sesamum. malabaricum L.)野芝2号为母本与栽培芝麻(Sesamum indicum L.)鄂芝1号杂交,在后代中选择不育株与鄂芝1号回交2代,在回交后代中再选择不育株和可育株兄妹交4代以上,获得了新的不育系W1098AB。W1098AB的兄妹交后代育性分离比例为1：1,可育株自交后代无分离；与26份材料测交后代全部出现育性分离(不育株比例为24-79%),表明其育性受1对显性基因控制。W1098A的育性在武汉和叁亚均比较彻底、稳定,不受环境因素影响,因而具有较大的应用价值。目前尚未找到恢复源。3.芝麻显性核不育系W1098AB花药败育过程的细胞学观察利用光学显微镜和扫描电镜观察了W1098AB花粉的形态,结果发现不育花药为白色,不饱满,但与可育花药形态差别不大,肉眼不易区分,手捏很少有花粉散出。败育花粉粒呈小圆形或凹陷形,无内含物。在电子显微镜下,不育花粉粒多呈半球状凹陷,也有少量花粉呈毡帽状等异常形态；可育花药饱满,手捏有大量花粉散出,花粉呈圆球形或椭圆形,具萌发沟10-12个。上述结果表明W1098AB的花粉败育较彻底。石蜡切片观察发现,花药败育时期起始于花粉母细胞期,以后逐渐败育,至小孢子后期达败育最高峰。败育的原因可能与绒毡层提早解体和不完全解体有关。透射电镜观察发现,花药败育时期也起始于花粉母细胞,但败育的原因可能是药壁结构出现了异常。随着花粉的发育,绒毡层细胞分泌的乌氏体的减少、绒毡层细胞的不完全降解、中层细胞的变形解体、药壁细胞的次生不均匀加厚、小孢子核膜不均匀加厚、基粒棒的减少及不均匀分布均会导致小孢子败育。至小孢子后期,败育达到最高峰。4.芝麻显性核不育系W1098AB花药败育的生理生化基础利用ELISA技术测定了不育系W1098AB叶片和花蕾中生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)以及水杨酸(SA)含量的动态变化,分析了不同内源激素的平衡关系,同时比较了不育株和可育株间的可溶性糖和淀粉含量差异。研究结果表明：(a)在整个花药发育时期,不育株和可育株中的4种内源激素含量变化趋势明显不同,且含量高低差异明显；IAA含量的降低及ABA含量的提高可能与芝麻雄性不育的发生密切相关；(b)不育株叶片中的IAA含量显着下降,JA和ABA显着上升；(c)IAA/ABA、IAA/SA和IAA/JA在不育株和可育株间的变化趋势不一致,且大小差异很大,表明4种内源激素之间平衡关系受到破坏可能会影响到花药的正常生长发育；(d)不育系花蕾中的可溶性糖含量、淀粉含量充足,含量过高也可能与花药败育有关。测定分析了不育系W1098AB花蕾中游离氨基酸含量的动态变化,结果发现不育株和可育株在孢原细胞、花粉母细胞、四分体、小孢子期的氨基酸含量差别不明显,但在成熟花粉期,不育株的主要游离氨基酸(如苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸)突然升高,这可能是花药败育的结果,而不是原因(因为败育主要发生在小孢子期)。5.芝麻显性细胞核雄性不育的分子标记在包含224个单株的W1098AB兄妹交群体中,运用BSA法构建了不育集团和可育集团,在集团间共筛选了1500对SSR引物,获得多态性标记15个；进一步经大群体分析,发现其中的13个标记与不育基因紧密连锁,重组交换率为0.45-14.73%。利用JoinMap软件构建了一个连锁群,所有标记都在连锁群上,其中的7个SSR标记位于不育基因的一侧,其余6个标记位于另外一侧；两侧与不育基因最近的分子标记分别为SBM298(0.15cM)和GB50(0.70cM)。这些结果为显性核不育的分子标记辅助选择以及不育基因的图位克隆奠定了良好基础。
刘海河[4]2005年在《西瓜G17AB核雄性不育两用系的不育机理研究》文中研究表明本文以西瓜G17AB细胞核雄性不育系为试材,对其雄性不育遗传规律及花药和雄花蕾发育过程中的细胞学、超微结构、生理生化特性进行了系统的研究,对育性基因进行了RAPD和AFLP标记,并对雄花蕾发育过程中的mRNA进行了差异显示分析。主要研究结果如下: 1.西瓜雄性不育系的农艺性状比较及遗传分析 对西瓜G17AB雄性不育材料的不育株和可育株的农艺性状进行了比较观察,结果发现不育株与可育株的性状差异仅表现在雄花器上,不育花药瘦小而皱缩,不产生花粉。遗传分析表明,不育性状由一对核隐性基因所控制。 2.西瓜G17AB雄性不育花药的细胞学及组织化学研究 西瓜G17AB雄性不育两用系细胞学观察表明,败育发生于四分体形成之前,花粉母细胞不能进行正常减数分裂,出现多核现象后解体,无花粉粒形成。不育花药绒毡层细胞分化异常,败育后期,药壁细胞解体,药室收缩变形。组织化学染色显示雄性不育花药组织内的不溶性多糖和蛋白质含量均低于可育花药。 3.西瓜G17AB雄性不育系花药发育超微结构研究 利用透视电镜技术对不同发育时期西瓜G17AB核雄性不育系的花药超微结构进行了对比观察,结果表明:不育花药的绒毡层细胞分化异常,细胞体积小,细胞器少,减数分裂过程中,绒毡层细胞内的物质降解消失,形成仅残留细胞壁的空腔;而不育花药的小孢子母细胞在减数分裂过程中,细胞质内液胞增多,在液泡消失之后,细胞器畸变,细胞质凝结成团,导致发生质壁分离现象,并最终降解消失。在此基础上对西瓜雄性不育的原因进行了讨论。 4.西瓜细胞核雄性不育系的生理生化特性分析 以西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系为试材,对不同发育时期的不育与可育
易斌[5]2008年在《甘蓝型油菜隐性核不育基因Bnms1的精细定位和克隆》文中研究说明杂种优势利用是提高油菜产量、品质和抗性的有效途径。雄性不育是油菜杂种优势利用主要的途径,但是对于雄性不育机理的研究却远远滞后。甘蓝型油菜细胞核雄性不育(GMS)败育彻底,不育性表现稳定,细胞质来源丰富,恢复源广泛,在国内已成为油菜杂种优势利用的重要途径之一。S45AB来源于四川大学,由潘涛等(1988)在Oro中发现的自然突变体衍生而来,经过多代的兄妹交(25代以上)保存,通过杂交试验证明S45A的不育性受两对重迭隐性基因控制(潘涛等,1988)。在近等基因系S45AB中,一个不育位点处于杂合状态,另外一个不育位点处于隐性纯合状态。本研究以S45AB作为基础材料,对处于杂合状态的隐性核不育基因进行了遗传定位和克隆的研究,主要结果如下:1.3年的育性调查结果表明:兄妹交后代的育性分离比稳定在1:1,可育株自交后代的育性比例符合3:1。这一结果进一步证实了在两型系S45AB中控制育性的两个位点中只有一个处于分离状态,我们将这个位点的不育基因命名为Bnms1;另外一个位点处于隐性纯合状态,不育基因命名为Bnms2。2.半薄切片观察发现可育花药和不育花药在减数分裂前没有明显差异。四分体时期四分体没有明显差异,不育花药的绒毡层比可育花药的稍厚。在单核花粉期小孢子差异明显,不育小孢子没有花粉外壁的合成,发育长时间停留在单核花粉期并最终解体;不育花药的绒毡层表现为径向扩大,液泡化明显。S45A败育发生的关键时期在四分体至单核花粉期,绒毡层异常、花粉外壁的缺失是导致败育的主要原因。3.应用AFLP与BSA结合的方法分析近等基因系S45AB,共筛选了2560对AFLP引物组合,获得7个与目的基因(Bnms1)连锁的AFLP标记AF1-AF7。用包含310个单株的近等基因系群体将Bnms1基因定位在标记AF3和AF7之间,标记与基因间的遗传距离分别为1.6cM和0.3cM,标记AF1和AF2与基因共分离。4.回收、克隆了以上7个AFLP特异片段,测序结果表明AF1-AF7的精确长度分别为203bp、241bp、211bp、186bp、187bp、284bp和362bp。通过PCR-walking分离AFLP标记的侧翼序列,将AF1、AF3、AF6和AF7分别延长至7,499bp、997bp、1,203bp和656bp,并转化为4个SCAR标记SC1、SC3和SC6和SC7。用1,974个单株的S45AB近等基因系将Bnms1基因定位在标记SC1和SC7之间,标记与Bnms1基因间的遗传距离分别为0.1cM和0.3cM。5.利用DH群体(Zhongyou821×Bao604)为作图群体,构建了一张包含237个标记的遗传图谱,图谱总长1,625.6cM,包括2个RFLP标记,65个RAPD标记,86个SSR标记,84个SRAP标记。利用两个DH群体(Tapidor×Ningyou7、Zhongyou821×Ba0604)的遗传图谱将不育基因Bnms1定位于N7连锁群,并在N7连锁群上找到一个与Bnms1基因连锁的共显性标记Na12A02,Na12A02与基因的距离为2.6cM。6.以分子标记SC7、SC1和SC6的特异片段为探针筛选Tapidor BAC文库,得到41个阳性克隆。利用标记SC1和SC7将Bnms1基因定位在BAC克隆BAC1上,对克隆BAC1进行shotgun测序。基于BAC序列开发了6个新标记SCS-SC13,在4132个单株群体中Bnms1基因被定位在标记SC8和SC11之间,标记与Bnms1基因间的遗传距离分别为0.05cM和0.15cM,SC8和SC11在BAC克隆BAC1上的物理距离为21.2-kb。7.用21.2-kb的序列检索GenBank的EST数据库和拟南芥数据库(AGIGenes),结果表明该区域存在四个候选基因,四个候选基因在甘蓝型油菜上的排列顺序与拟南芥基因的排列顺序一致。第一个和第四个候选基因是功能未知的基因,第二个候选基因属于NAP类型基因,第叁个候选基因是CYP450基因家族成员,分析认为第二和第叁个候选基因可能与花粉发育相关,以下用G14、G15表示。8.Northern blot分析表明G14和G15的表达量在S45A和S45B之间没有明显差异。在小于1mm、1mm～2mm、2mm～3mm和3mm～4mm四种大小的花蕾之间G14的表达量没有变化,表达水平很低;G15在1mm～2mm、2mm～3mm大小的的花蕾中特异表达。9.比较测序发现,G14在S45A和S45B之间存在2个错义突变,导致第79位的缬氨酸突变为丙氨酸;第226位的丙氨酸突变为丝氨酸。G15在S45A和S45B之间也有2个错义突变,导致第179位的甘氨酸突变为精氨酸;第297位的缬氨酸突变为丙氨酸。10.构建了转基因载体pBnG15、pAtG15RNAi-1和pAtG15RNAi-2,获得了5株甘蓝型油菜的阳性转化植株和2株表现为雄性不育的拟南芥植株。
汪志伟[6]2006年在《萝卜细胞质雄性不育胞质和核基因的分子标记的开发及其分子特征》文中提出萝卜(Raphanus sativus L．)是深受世界人民喜爱的根菜类蔬菜。萝卜的杂种优势非常显着，能够有效地提高产量和改善纤维品质。在植物中，细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)是一种不能产生正常功能花粉的母性遗传性状，被广泛地应用于商业化生产F_1代杂种。萝卜CMS系的细胞质即能导致萝卜属植物雄性不育，又能导致芸薹属植物雄性不育，而且其CMS不易受环境条件和不同遗传背景的影响，从而是十字花科植物中最受关注的不育细胞质之一。目前已有一种萝卜CMS及其对应的恢复位点从萝卜导入到油菜中，但一些不良的农艺性状随着恢复基因的导入而出现。远期目标在于阐明萝卜CMS及育性恢复以及使萝卜CMS在十字花科杂种优势育种中得到充分利用。本篇论文中，我们就萝卜CMS胞质不育和核基因的分子标记及其分子特征进行了描述。取得的主要研究结果如下： 获得了一个萝卜CMS系统，该系统由雄性不育系9802A、保持系9802B和恢复系9802H组成。该不育系花药外观皱缩或正常，无可见花粉，而Ogu CMS系花药外观皱缩未完全发育；NWB CMS系则花药外观正常、花药内有部分花粉。不育系9802A和恢复系9802H杂交产生的F_1植株全部表现雄性可育，表明CMS的恢复表现型是一种显性性状。获得了由300个单株组成的F_2代育性分离群体。卡平方测验表明分离群体中可育与不育的分离比符合3∶1的比例，证明9802A雄性不育的育性恢复受单一显性基因控制。 用萝卜Ogu orf138基因的特异引物组合ORF-F和ORF-R，在萝卜CMS系9802A总DNA中扩增出了一条DNA片段，而在保持系9802B和恢复系9802H中未扩增出任何产物。序列分析表明该片段与特异诱导Ogu CMS相关基因orf138序列完全一致。该DNA片段可以作为选育萝卜CMS的分子标记。 合成了能够扩增出萝卜NWB CMS系的特异分子标记的引物组合NWB-F和NWB-R，该引物组合在萝卜CMS保持系9802B和恢复系9802H总DNA中扩增出了单一DNA片段，而在CMS系9802A总DNA中未扩增出任何产物。该DNA片段可以作为辅助选育萝卜CMS保持系的分子标记。 采用混合分群分析法和F_2代的300个单株筛选了萝卜CMS恢复基因Rfw的RAPD标记。对100条RAPD引物的扩增产物进行筛选后，发现RAPD标记OPC06-1900与恢复基因Rfw连锁。通过分子克隆和核苷酸测序将该RAPD标记转换成了显性的SCAR标记SCC06-1894。BLAST搜索表明SCC06-1894与拟南芥和甘蓝硫酸盐转运蛋白基因的对应区域高度同源。设计了等位特异引物，扩增出了SCAR标记SCC06-415。用F_2代的分离群体进行PCR分析及序列分析表明SCC06-1894和SCC06-415等位，与Rfw／rfw的遗传距离为8.0cM。根据一个萝卜
陶兴林[7]2017年在《花椰菜温敏雄性不育系的育性转换机理及分子标记研究》文中研究表明花椰菜是十字花科芸薹属甘蓝种中的一个变种,以花球为食用器官,花球营养丰富,被公认为是最有营养的作物之一,特别是钙,抗氧化剂,维生素A、维生素K、胡萝卜素、核黄素及铁的含量很丰富。此外,还含有多种吲哚衍生物,具有抗癌作用。近年来栽培面积迅速扩大,据联合国粮食与农业组织(FAO)统计,2014年全世界花椰菜种植面积达1165737 hm~2,我国种植面积占到了41.0%,达478252 hm~2,已成为世界第一花椰菜生产和消费国。由于花椰菜为异花授粉的十字花科植物,具有很强的杂种优势,而雄性不育是杂种优势体现的主要途径。因此,为探讨花椰菜温敏雄性不育发生的机理,加快其利用进程,采用形态学、遗传学、细胞遗传及分子标记等方法,分别从不育的特征、育性转换特点、遗传规律、生理生化特性和细胞学特征方面进行了研究,获得以下结果:(1)为了促进花椰菜“两系法”杂交育种的利用,温敏雄性不育突变体2004-A19经过连续多年自交和田间优异性状选择,选育出了花椰菜温敏雄性不育系“GS-19”。该不育系植株长势中等,叶色灰绿,株高62 cm,株幅64 cm,叶数21片,花球扁圆、白色、中紧,单球重0.8-1.0 kg,抗病性强。(2)为了明确GS-19育性转换过程中形态特征差异,采用游标卡尺测量和扫描电镜的方法进行比较分析,发现不育和可育株的花器及花药发育上存在明显差异。在花的结构组成上,除雄蕊数目没有明显差异外,不育株的花蕾长、花蕾宽、花冠开度、花丝长、花丝和花药总长及花柱长都显着小于可育株。不育株花期看不到雄蕊,雄蕊萎缩在基部,不产生花粉,只有柱头明显外露,而可育株的雄蕊与雌蕊高度一致,能产生大量花粉。此外,扫描电镜观测发现不育株花药发育初期的花药壁出现轻微萎缩现象,表面变得粗糙,横切面中空明显,随着花药的进一步发育,不育株花药变成干瘪状,明显萎缩,只剩下开裂的花药壁,无花粉粒。可育株花药发育正常,外壁饱满光滑,内部被小孢子填充,小孢子进一步发育可以形成成熟花粉粒,花粉粒呈椭圆形,表面光滑,饱满。(3)为了找到与GS-19育性转换有关的环境因子,通过日光温室的周年播种,自助式温度计记录温度,育性统计分析发现日光温室的日平均温度变化与GS-19的育性转换密切相关。GS-19的花期在2月10日到11月31日。2月10日到3月22日,日平均温度变化范围为5.81-15.28℃,GS-19育性正常,可育率达到100%。3月23日到5月21日,日平均温度变化范围为6.75-21.24℃,表现为部分可育,育性变化范围为2%-98%。5月22日到10月6日,日平均温度变化范围为13.38-25.50℃,完全不育。10月7日到10月21日,日平均温度变化范围为8.62-16.34℃,表现为部分可育,可育率为3%-86%。10月22日到11月31日,日平均温度变化范围为4.59-17.86℃,育性恢复正常。对照材料祁连白雪始终表现为育性正常。由此说明,育性转换只与温度有关,与光周期无关,属于温敏型雄性不育,育性转换温度临界点为17.6℃,日平均温度低于16℃,育性恢复,高于17.6℃,表现为不育。(4)为了阐明GS-19的遗传特性,通过对GS-19杂交F1和F2的花期育性统计分析,发现F1的育性完全正常,F2的可育与不育的分离比例为2.8-2.9︰1,卡方测验结果为x~2=1.4168,小于x~2=3.84,表明实际观察次数和理论次数差异不显着,认为可育与不育比例符合孟德尔的遗传定律3:1的分离比例规律。结果表明温敏雄性不育性是由一对隐性细胞核基因所控制,其作用不受细胞质类型的影响。(5)为了明确内源激素与GS-19的育性转换关系,采用高效液相色谱方法,研究了GS-19花蕾不同发育时期和叶片中内源激素含量的变化,发现在GS-19花蕾和叶片发育过程中,不育和可育株内源激素GA、IAA、ABA和ZR的变化均存在明显差异。不育株花蕾中的GA和ABA含量总体呈上升趋势,GA含量在造孢时期、四分体时期及花粉成熟期的含量均显着高于可育株,分别比可育株花蕾高45.1%、210.4%和54.5%,而ABA含量只在四分体时期和花粉成熟期显着高于可育株,分别比可育株花蕾高82%和35.2%;不育株花蕾中的IAA含量先降后升,在造孢时期和花粉成熟期显着高于可育株,分别比可育株花蕾高52.7%和82.1%,但不育株花蕾的ZR含量先升后降,在四分体和花粉成熟期显着高于可育株,分别比可育株花蕾高580.9%和243.9%。与可育株相比,不育株的IAA/ABA呈“V”字型变化,在四分体时期比值最低,而GA/ABA和ZR/ABA呈倒“V”字型的变化,在四分体时期比值最高。叶片中ABA和ZR未检出,不育株叶片的GA和IAA含量仍显着高于可育株。因此,推断GA和IAA是引起花椰菜温敏性不育的主要内源激素。(6)为了解释GS-19花药败育的生物学过程,通过石蜡切片和透射电镜细胞学技术观察了GS-19花药败育的生物学过程,发现不育和可育株花药发育的生物学过程存在显着差异,GS-19的花药发育过程中有造孢细胞和花粉母细胞的分化,可形成正常花粉囊,但不产生花粉粒或者产生微量的无生活力的花粉粒,在花粉母细胞到四分体期花药发育受阻,形成了花粉粒外壁发育异常的拟“四分体孢子”。随着小孢子发育,拟“四分体孢子”逐渐降解,只剩下花粉空壳,属于花粉母细胞败育类型。(7)采用子ISSR标记技术,选用90条随机引物,对不育和可育基因池标记,找到了与花椰菜温敏雄性不育连锁的分子标记IT13-600,对特异片段进行克隆测序,获得片段长度为559 bp的片段。运用此标记对30份花椰菜种质资源进行筛选,获得具有温敏雄性不育稳定遗传的花椰菜新种质资源3份。
张慧[8]2010年在《大白菜细胞核雄性不育基因的分子标记及定位》文中研究说明大白菜是起源于中国的十字花科芸薹属作物,也是中国及很多其他国家和地区十分重要的蔬菜作物之一。大白菜为典型的异花授粉作物,存在明显的杂种优势。利用自交不亲和系和雄性不育系制种是目前最常用的杂交制种技术。自交不亲和系在利用上存在亲本繁殖困难成本提高、多代自交生活力下降;易受环境影响使杂种纯度不高。利用雄性不育系制种是一种理想的杂种生产模式。雄性不育系又被分为细胞质雄性不育系和细胞核雄性不育系。细胞核雄性不育系不育性完全,不会影响植株生活力。目前,对大白菜细胞核雄性不育的遗传解释存在多种遗传模式,不同遗传模式将直接影响雄性不育的转育。同时,利用分子标记方法对不育基因和恢复基因的研究较为初步。本研究对两个隐性细胞核雄性不育系(452AB和454AB)和一个显性细胞核雄性不育系(451AB)进行了遗传学研究,判断不育系的遗传模式,不育基因在自交系中的分布,并对叁个不育系的育性恢复基因和不育基因进行了分子标记、基因定位。主要结果如下:1.隐性雄性不育系452AB和454AB的可育株和不育株分别与显性雄性不育系451AB中的可育株杂交,并进一步回交。通过数据分析推断451AB系不育基因与454AB系恢复基因为等位基因,这两个系属于复等位遗传模式。452AB系与另外两个系不同,表现为独立遗传。叁个不育系与17个自交系进行测交,判断自交系基因型。根据测交结果,4个自交系的可育基因对452AB系不育基因有保持作用。进一步研究判断452AB系也为一复等位雄性不育系。两复等位雄性不育系在基因组中的位置不同,并不存在关联。2.隐性细胞核雄性不育系452AB包含164个单株。利用混合分组分离法(BSA)对不育系进行标记分析,并优化SRAP反应体系。在构建的基因池中筛选SRAP引物1 256对,SSR引物187对。获得与大白菜隐性细胞核雄性不育系恢复基因(BrMsf2)连锁的标记两个,PM8K4和Me2M49,与恢复基因的遗传距离分别为2.98 cM和10.92 cM。通过调查PM8K4标记在大白菜DH作图群体中的多态性,将该恢复基因定位在大白菜染色体A08。根据大白菜基因组测序信息,筛选来自染色体A08候选区域的Indel标记23个,其中scaffold20上的标记S20-1与恢复基因的遗传距离为4.22 cM。通过S20-1和PM8K4标记在染色体上的位置,将BrMsf2定位在scaffold20的附近。3.显性细胞核雄性不育系451AB包含480个单株。利用混合分组分离法、SRAP和SSR标记技术筛选与不育基因BrMs1连锁的标记。在1 378对SRAP标记和238对SSR标记中,筛选到与不育基因连锁的SRAP标记5个(CuMe7BEm12, BMe9E32, PM8E38, E35BEm10, and M51K2),SSR标记1个(ENA6)。其中PM8E38标记与不育基因的距离最近,为0.37 cM。将该标记多态性片段进行克隆测序,成功的转化为较为简易的SCAR标记PM8E38S。通过SSR标记ENA6在DH作图群体中的位置,不育基因BrMs1被定位在大白菜染色体A07上。4.利用2357个单株对451AB系不育基因进行精细定位。初步定位标记PM8E38S在精细定位群体中与不育基因的遗传距离为0.59cM。将初步定位标记的序列与基因组序列进行比对,没有比对在染色体A07上。筛选根据白菜基因组序列设计的内含子多态性(Intron Polymorphism,IP)标记13对,与芥菜中设计的IP标记28对,筛选到一个与不育基因距离较远的标记A0703-2。设计开发基于测序技术的酶切标签标记,并首次应用于雄性不育基因的精细定位中。筛选酶切标签标记76个,获得4个基因组位置已知的标记S17-52、S1727-5、S1727-6、S1729-5和6个基因组位置未知的标记SNONE-2、SNONE-7、SNONE-9,SNONE-16,SNONE-27和SNONE-44,其中SNONE-9与不育基因遗传距离最小(0.51 cM)。S1727-6是与不育基因距离最短(0.76 cM)的位置已知的标记。进一步对该区域Indel标记进行筛选,从26对引物中,筛选到4对存在多态性的Indel标记(S17-1、S17-2、S69-1和S69-2)。通过Indel标记以及酶切标签标记在基因组中的位置,将标记与基因之间的遗传距离与物理距离想对应。通过基因所在区域序列分析结果,预测该基因位于重复序列较多的中心粒区。5. 454AB系为隐性细胞核雄性不育系,它包含320个单株。利用混合分组分离法根据育性构建育性池。筛选SRAP标记1 128个,SSR标记187个。筛选出与恢复基因BrMsf3连锁的SRAP标记两个,BMe10SA4和M52K2,与恢复基因的连锁距离为4.38 cM和7.46 cM,这两个标记位于基因的同侧; SSR标记ENA6与恢复基因的遗传连锁距离为11.57cM。通过ENA6标记在DH作图群体中的位置,将该恢复基因定位在大白菜染色体A07上。进一步筛选位于A07上的Indel标记26个,酶切标签标记65个,未发现与恢复基因(BrMsf3)连锁的标记。基因定位结果证实了451AB系和454AB系的复等位遗传关系。6.通过遗传学分析和基因定位结果,得到451AB系和454AB系属于复等位遗传,不育基因位于染色体A07上,452AB系属于复等位遗传,不育基因位于染色体A08上,证明大白菜中存在一个以上复等位雄性不育系统。
张德双[9]2006年在《大白菜CMS96细胞质雄性不育的分子特性及育种应用研究》文中研究说明大白菜)Brassica campestris L．ssp．pekinensis)起源于我国，是最具中国特色、国内播种面积最大、产量最高的重要叶用蔬菜。我国大白菜资源丰富、品种类型多样，商品菜生产已经基本实现周年供应。由于大白菜具有明显的杂种优势，当前主栽品种几乎均为杂种一代。利用雄性不育系生产一代杂种已经成为大白菜育种的一种发展趋势，而细胞质雄性不育系的选育和利用是以营养器官为食用对象的大白菜等蔬菜杂种优势育种的理想途径。目前，大白菜细胞质雄性不育主要来源有3种：萝卜Ogu CMS、甘蓝型油菜Pol CMS和新型甘蓝型油菜CMS96。以往的研究主要集中在对单一大白菜细胞质雄性不育系和保持系进行比较研究，本研究从分子生物学、同工酶或蛋白质、细胞学和植物学等方面初步探索3种大白菜细胞质雄性不育(Ogu CMS、Pol CMS和CMS96)的不育特征、特性，研究大白菜细胞质雄性不育这一具有重要理论意义和经济价值的遗传现象本质，特别是探索大白菜CMS96不育系的败育机理，为更好地在大白菜育种中应用CMS96细胞质雄性不育源奠定基础。基于上述情况，本论文开展了以下五个方面的研究工作，获得的主要结论如下：1．采用RAPD和AFLP技术，对3组11份大白菜不育系、保持系的mtDNA以及nDNA进行多态性研究，RAPD和AFLP结果的聚类分析表明，大白菜CMS96和Ogu CMS不育系更为相近，遗传相似性较大。筛选了153个RAPD随机引物，其中4个RAPD引物OPB20、OP004、OPU04和OPAH16获得与大白菜Ogu CMS和CMS96不育系相关的20条RAPD片段；其中1个RAPD引物OPB06获得仅与大白菜Ogu CMS不育系相关的3条RAPD片段。将OPAH16引物在大白菜Ogu CMS、CMS96不育系扩增得到的1300bp片段和在全部材料扩增得到的900bp片段转化为SCAR标记SCAR-1300和SCAR-900；筛选了64组AFLP引物，其中3组引物E-ACC／M-CAT 500、E-ACG／M-CTG 650和E-ACT／M-CTT 370获得与大白菜CMS96不育系相关的6条AFLP片段；2组引物E-ACG／M-CAT 540和E-ACT／M-CAT 610获得与大白菜Ogu CMS不育系相关的6条AFLP片段；由5组引物获得与大白菜CMS96和Ogu CMS不育系相关的22条AFLP片段；由5组引物获得与3种大白菜不育系相关的26条AFLP片段。2．采用基于同源序列基因扩增法，利用设计的7组引物PCR扩增11份大白菜不育系和保持系mtDNA，结果表明，由atp6、orf222和orf224单一引物PCR扩增产物或atp6、orf222二组混合引物多重PCR扩增产物可以将3种大白菜不育系以及保持系区分开；综合已获得的研究结果，提出大白菜CMS96不育系的不育基因为Ogu CMS orf138和Nap CMS orf222／nad5c二组已有不育嵌合基因有机结合、重组形成的新型不育嵌合基因；推测大白菜CMS96原始不育源的获得是甘蓝型油菜Ogu CMS和Nap CMS不育系原生质体对称融合的结果。利用7组引物PCR扩增11份大白菜不育系和保持系mtDNA，获得多态性扩增结果；RT-PCR技术进一步验证片段的特异性；克隆、测序和同源性比较，研究特异片段的核苷酸和氨基酸序列特性。结果表明，7组引物在11份大白菜材料中均有扩增产物，除了atp9和coxⅠ引物外，其余5组引物扩增产物均存在差异。atp6引物扩增的200bp产物可以将大白菜Ogu CMS不育系与其它不育系、保持系区别开；orf224引物只在大白菜Pol CMS不育系中有扩增产物；atpA和orf138引物扩增产物可将大白菜Ogu CMS、CMS96不育系与其余不育系、保持系区别开；orf222引物仅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系中有扩增产物，可以将二者与其它不育系和保持系区别开，但orf222引物扩增产物存在3点不同：前者序列长度为675bp，具有ORF224开放阅读框，没有保守结构域；后者序列长度为669bp，具有ORF222开放阅读框，与Nap CMS的orf222、nad5c核甘酸序列同源性为99％，具有YFM16保守结构域；同时，利用orf138和orf222二组引物的5种组合扩增大白菜CMS96不育系mtDNA，获得3组特异扩增产物。通过atp6和orf222二组引物混合，多重PCR扩增11份大白菜mtDNA，可以将大白菜3种不育系和保持系仅一次PCR反应完全区别开，建立了一种快速鉴定3种大白菜细胞质雄性不育系和保持系的分子技术方法：所有保持系仅扩增出1条800bp带型，可以作为保持系的区分带型；大白菜Pol CMS不育系可扩增出3条带型，其中1500bp和2300bp为其特有带型，二者不是单引物扩增的产物，而是atp6和orf222引物混合后综合扩增的产物；大白菜Ogu CMS不育系可扩增出3条带型，其中200bp为其特有带型。大白菜Ogu CMS不育系多重PCR的扩增产物与单一引物的扩增结果相同，即只有atp6引物的扩增结果；大白菜CMS96不育系可扩增出2条带型：700bp和800bp，其中700bp为其特异带型。大白菜CMS96不育系多重PCR扩增产物是单一PCR扩增产物的简单累加。3．应用水平板等电聚焦(IEF)聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，开展了2组8份大白菜不育系和保持系花、4级蕾、叶片的EST、ACP、POD同工酶和全蛋白的比较研究。结果表明，除EST外，3种大白菜不育系和保持系ACP、POD同工酶和全蛋白酶带存在差异。EST同工酶研究表明，供试材料EST酶带没有差异，均有10～11条EST酶带；POD同工酶研究表明，8份大白菜不育系和保持系花和4级蕾的POD酶带存在差异：3种不育系的C酶带活性比保持系C酶带活性强，Ogu CMS和CMS96不育系的C酶带活性又比Pol CMS不育系的C酶带活性强。所有不育系大于0.45cm蕾的C酶带活性比小于0.45cm蕾的C酶带活性强。但2组大白菜CMS96不育系的POD酶带不一致：第2组CMS96不育系B酶带活性明显比第3组CMS96不育系的B酶带活性强，也比同一组其它材料的B酶带活性强。第2组中，CMS96不育系比同一组其它材料多出1条A酶带，并与第3组材料的A酶带相同。第3组中，4种材料POD酶带数相同；ACP同工酶研究表明，大白菜Ogu CMS不育系花具有活性强的A、B酶带。大白菜Ogu CMS和CMS96不育系大于0.45cm蕾具有活性强的A、B酶带。保持系大于0.45cm蕾具有活性强的C、D酶带。所有供试材料小于0.45cm蕾的ACP酶带没有差异，均有5～6条ACP酶带；全蛋白研究表明，保持系0.35～0.55cm蕾具有活性强的A酶带，3种不育系的全蛋白酶带没有差异。4．采用透射和扫描电镜，观察大白菜CMS96不育系、保持系的花药、小孢子发育过程和表面结构。初步认为，大白菜CMS96不育系的主要败育特征为：在花粉母细胞初期，绒毡层与中层细胞提前分开，花粉母细胞虽然可以正常减数分裂，但形状不规则，花粉母细胞之间空隙大；大白菜CMS96不育系可以形成花粉，也具有花粉的纹蚀和花粉壁结构，但花粉内部营养物丧失，只有空瘪花粉粒，而且粘附在花药内，不散开。5．通过比较大白菜CMS96不育系、保持系以及试配的F1代主要植物学性状，进一步肯定了大白菜CMS96不育系和其F1代具有如下优越性：转育容易、不育度、不育株率100％、多代回交不易退化、配合力强、杂交种纯度可达100％等。获得性状优良、稳定的大白菜CMS96不育系31份；繁殖并示范推广大白菜CMS96不育系配制的4个组合：03-10、04-2、05-4和06-5；初步提出了大白菜CMS96不育系F1代良种繁育的技术规程：不育系与父本系的适宜定植比例为3比1。研究表明，大白菜CMS96不育系具有良好的育种应用前景。
刘静[10]2006年在《白菜型油菜细胞质雄性不育新材料1815A的研究及其杂交种纯度鉴定》文中研究指明油菜杂种优势的利用途径主要有两系法和叁系法,细胞质雄性不育是当前叁系法中应用最广泛、最有效的途径。本研究对白菜型油菜细胞质雄性不育新材料“1815A”的细胞学、遗传学方面进行了一些基础研究,以期对白菜型油菜杂种优势的利用提供理论依据,并对1815A的子一代杂交种“白杂1号”进行了纯度鉴定,希望为它的品种保护和推广提供一定的保障。不育系1815A的细胞学研究根据经典的遗传学理论,采用自交、回交以及反交组建子代群体,调查育性分离情况,经数据分析后判断鉴定;细胞学研究时,对不育系1815A的花药进行石蜡显微切片,观察花药的败育过程;“白杂1号”种子纯度鉴定采用随机扩增多态性( RAPD )分析。研究结果如下:1.通过对1815A及其保持系1815B、恢复系143C、杂种F_1、F_2和( 1815A×143C ) F_1×143C回交组合及( 1815A×143C ) F_1×1815B反交组合等群体个体进行育性调查分析,结果显示:1815A属孢子体不育,其不育性状是由胞质不育基因和一对隐性核不育基因共同控制的结果。这和大多数甘蓝型油菜是相同的。2.以1815A不育系对应的保持系1815B作对照,对不育系进行细胞学观察,结果表明:随着花蕾的发育,败育的雄蕊一直处于孢原细胞时期,不能形成花粉囊并产生花粉母细胞,但雌蕊和维管束组织发育正常。因此,1815A花药败育的时期为孢原细胞时期,其主要特点是花药的发育受阻于孢原细胞时期,无孢原细胞和药室分化,属无花粉囊型不育系。3.用238个10-mer随机引物对“白杂1号”父母本及F_1代种子进行了RAPD分析鉴定,结果显示:引物S_(24)、S_(83)和S_(104)条带稳定,并且杂交种条带为双亲互补型;引物S_(176)为偏父型,可扩增出母本特征带,而其在父本中呈阴性。选取S104( GGAAGTCGCC )对“白杂1号”进行了纯度检测,结果与预期结果基本一致,可以用来鉴别“白杂1号”种子纯度。
参考文献：
[1]. 甘蓝显性细胞核雄性不育的细胞学特征、生化基础及其分子标记的研究[D]. 刘玉梅. 中国农业科学院. 2003
[2]. 青花菜雄性不育系开花结实特性及花蜜分泌调控机制的研究[D]. 舒金帅. 中国农业科学院. 2016
[3]. 芝麻细胞核雄性不育的遗传特性、生理生化及分子标记研究[D]. 刘红艳. 中国农业科学院. 2013
[4]. 西瓜G17AB核雄性不育两用系的不育机理研究[D]. 刘海河. 南京农业大学. 2005
[5]. 甘蓝型油菜隐性核不育基因Bnms1的精细定位和克隆[D]. 易斌. 华中农业大学. 2008
[6]. 萝卜细胞质雄性不育胞质和核基因的分子标记的开发及其分子特征[D]. 汪志伟. 华中农业大学. 2006
[7]. 花椰菜温敏雄性不育系的育性转换机理及分子标记研究[D]. 陶兴林. 甘肃农业大学. 2017
[8]. 大白菜细胞核雄性不育基因的分子标记及定位[D]. 张慧. 中国农业科学院. 2010
[9]. 大白菜CMS96细胞质雄性不育的分子特性及育种应用研究[D]. 张德双. 中国农业科学院. 2006
[10]. 白菜型油菜细胞质雄性不育新材料1815A的研究及其杂交种纯度鉴定[D]. 刘静. 西北农林科技大学. 2006
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