（南京市建邺医院药剂科 江苏 南京 210017）
【摘要】 目的：建立人血中茶碱的HPLC测定方法，开展茶碱血药浓度检测。方法：采用反相色谱法，色谱柱为Hypersil ODS2依利特，检测波长为274 nm，流速1ml/min，温度30℃，对流动相、内标、提取方法进行考察。结果：确定用高氯酸处理血样，流动相为甲醇：水=25：75，内标物为咖啡因达到良好的分离效果。茶碱标准曲线回归方程为Y=0.0735X+0.0373，r=0.9992(n= 8)，线性范围为0.7353～29.4118μg/ml。茶碱低、中、高血药浓度的日内RSD%均＜3，日间RSD%均＜5。结论：本测定方法简便、灵敏、快速、准确，在临床应用中能最大限度地降低茶碱毒副作用，产生较佳的治疗作用。
【关键词】 茶碱；血药浓度；HPLC
【中图分类号】R55 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）32-0336-03
治疗药物监测是用血药浓度检测数据对个体病人用药剂量进行调整，使临床用药更加安全有效。对一部分病人来说，药物在体内消除较慢，血药浓度超过中毒浓度而出现毒副反应[1]。因此对某些药物进行血药浓度的检测有其必要性。
茶碱是甲基嘌呤类药物，具有强心、利尿、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌和兴奋中枢经系统等作用。主要用于治疗支气管哮喘、肺气肿、支气管炎、心脏性呼吸困难。茶碱的药理作用与血浓度有关，有效血浓度安全范围很窄，如血浓度10～20μg/ml时扩张支气管，超过20μg/ml即能引起毒性反应[2]。茶碱的毒性常出现在血清浓度为15～20μg/ml，多见的有恶心、呕吐、易激动、失眠等，当血清浓度超过20μg/ml可出现心动过速、心率失常，血清中茶碱超过40μg/ml，可发生发热、失水、惊厥等症状，严重的甚至呼吸、心跳停止致死。老年人及儿童血浆清除率降低，潜在毒性增加，应慎用。
HPLC法检测药物浓度专属性强，准确，可同时测定多种药物及其代谢产物且相互之间无干扰。因此对茶碱的血药浓度检测中我们选用了HPLC法。
1.实验内容及方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1仪器 日本岛津LC-10Avp高效液相色谱仪系统、1612-1型高速离心机、AL104电子天平、1.5ml塑料离心管、量筒、移液管、10ml锥形瓶、10ml烧杯等
1.1.2试剂 茶碱、咖啡因、高氯酸500ml、甲醇、双蒸水
1.2 色谱条件
流动相：甲醇∶水= 25∶75(V/V) ；检测波长：274nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；灵敏度：1 AUFS。
1.3 对照品及供试品溶液的制备
1.3.1茶碱对照品 精密称取茶碱对照品5.6mg置于1.5ml的离心管中，配制4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml的茶碱标准溶液。
1.3.2咖啡因 精密称取咖啡因白色粉末3mg于1.5ml的离心管中，配制300μg/ml的咖啡因溶液作为内标。
1.3.3血清对照品 取健康人空白血清500μl，加入不同浓度的茶碱标准液5μl及咖啡因25μl。混匀振荡10s，加入15%的高氯酸150μl，混匀振荡1min，15000r/min的高速离心机离心10min。吸取400μl上清液，抽滤后转入1.5ml的离心管中。即配成0.7353，1.4706，2.2059，2.9412，3.6765，7.3529，14.7059，29.4118μg/ml的茶碱血清标准品溶液。进样针取20μl进行色谱分析。
1.3.4血清供试品 取服用茶碱的病人血清样品（按“3.3”方法）配成茶碱血清供试品溶液。
1.4 标准曲线
茶碱血清标准品溶液制成系列标准血样。
1.5 精密度试验
1.5.1日内差 取茶碱标准品0.7353、3.6765、29.4118μg/ml低、中、高三种浓度。吸取20μl进样，连续进6针，计算日内精密度RSD。
1.5.2日间差 取“5.1”相同茶碱标准品溶液进行精密度实验。吸取20μl进样，每日上午固定时间进行色谱分析，连续5天，计算日间精密度RSD。
1.6 稳定性试验
精密吸取同一样品，按“3.4”制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10h精密吸取20μl进样，按上述色谱条件测定。
1.7 重复性试验
精密吸取同一份样品5份，按“3.4”制备供试品溶液，每份样品取20μl进一针，于同一条件下进行色谱分析。
2.实验结果
2.1 色谱行为
茶碱和咖啡因的保留时间分别是5.8min、8.1min，两峰分离完全，峰形良好，内源性物质对测定无干扰，表明本HPLC方法有较强的专属性。
空白血清、患者服用茶碱后血清的色谱图、健康人血清加茶碱和咖啡因色谱图见图1、图2、图3所示。
图3
A 表示血清 B 表示茶碱 C 表示咖啡因
2.2 标准曲线
以浓度(X)为横坐标，各浓度茶碱标准品峰面积与内标峰面积之比(Y)为纵坐标进行线性回归，计算标准曲线方程。如图4。
图4
回归方程为Y=0.0735X+0.0373，r=0.9992(n=8)，线性范围为0.7353～29.4118μg/ml。结果表明茶碱标准品在0.7353～29.4118μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好。
2.3 精密度试验
日内差RSD%分别为2.1、1.2、1.1，日间差RSD%分别为3.2、2.7、2.0。表明仪器精密度良好。
2.4 稳定性试验
茶碱峰面积与咖啡因峰面积之比（Ai/As）的RSD%为1.8。表明供试品在10h内稳定性良好。
2.5 重复性试验
茶碱峰面积与咖啡因峰面积之比（Ai/As）的RSD%为3.4。表明此方法重复性较好。
3.讨论
3.1 流动相的条件
HPLC测定茶碱中，多用含乙酸盐的流动相，但存在一定不足。其一久置可能降低柱效、缩短柱寿命；若清洗不彻底，盐结晶还会损害泵头并造成堵塞[3]。其二作为流动相耗费较大，甲醇与水更经济实惠。根据参考文献选择甲醇：水=20:80，结果保留时间过长。调节比例，选择甲醇：水=40:60及30:70，但组分分离效果不理想。改用甲醇：水=25:75，茶碱以及咖啡因的保留时间均在15分钟以内，茶碱的出峰时间亦在5分钟左右，与中国药典（2010版）要求的原始记录是主峰出峰时间的3倍相吻合。被测成分分离效果较好，峰形也良好。
3.2 内标物的选定
内标法的优点是色谱条件对结果影响不大，准确度、精度高；缺点是选择合适的内标物质比较困难。
茶碱选用的相应内标物是咖啡因。茶碱为甲基嘌呤类药物。咖啡因也属于甲基黄嘌呤的生物碱。茶碱为白色结晶或结晶性粉末。纯的咖啡因是白色的，强烈苦味的粉状物或六角棱柱状结晶。茶碱的溶解性与咖啡因的溶解性相似。根据以上性质，选用咖啡因为茶碱的内标物。
3.3 血药浓度的影响因素
影响血药浓度的因素是多方面的，它与药物剂型、给药剂量、给药方式及病人的生理状况、病理状况等是密切相关的。这些因素都会影响药物在体内的分布、吸收、代谢及排泄，从而影响了病人体内的血药浓度。临床可依据此方法检测出的数据，做适当的调整，使给药剂量达到治疗药物浓度，更好地服务病人。
【参考文献】
[1]王广基.药物代谢动力学[M].北京:化学工业出社,2005,6.127-128.
[2]周美霞,陈光,管茶英.两种方法测定茶碱血药浓度的比较[J].临床荟萃,2006,21(11): 814-816.
[3]杨广杰,郭新社,李禄辉.对HPLC法测定茶碱血药浓度的改进[J].河南大学学报,2004, 23(4):38-39.
论文作者:周玉
论文发表刊物:《医药前沿》2016年11月第32期
论文发表时间:2016/11/15
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