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【摘要】 目的：探讨大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化比较。方法：对大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞采用序列酶消化及 EDTA 整合法进行分析纯化，并进行染色，对活性进行检测。结果：骨细胞有多个突触结构，形态比较丰满，呈现树枝状和星状，细胞之间都是通过突触相互连接的；成骨细胞呈现纤维细胞状形态和梭形细胞形态；经过Ⅰ型胶原免疫组化染色，骨细胞表达量低，为浅棕色，成骨细胞表达量高，为深棕黄色；经过BGP 免疫荧光染色，骨细胞表达高，成骨细胞表达低；经过ALP免疫组化染色，成骨细胞的ALP活性高于骨细胞，呈现棕黄色。经过ALP 活性检测，骨细胞 ALP 活性低于成骨细胞，两者比较具有统计学意义（P<0.05）。结论：采用序列酶消化及 EDTA 整合法可以获得纯度较高的成骨细胞和骨细胞。
【关键词】大鼠颅骨成骨细胞；骨细胞；分离纯化
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）27-0345-02
在本次研究中，通过对大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化进行研究，从而为骨质疏松症等骨代谢疾病的治疗机制提供帮助，具体的操作如下。
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1.材料与方法
1.1 实验试剂、动物和仪器
实验试剂、动物：选择12只洁净条件下生长的SD大鼠，使用的实验试剂包括免疫组化染色试剂盒、ALP测定试剂盒、DAB显色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Ⅰ型胶原酶、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原酶、骨钙素(BGP)一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、FITC标记的免疫荧光二抗、伊红、苏木素、新生牛血清 CS(PAA)胰蛋白酶、胎牛血清FBS和α-MEM培养基。
实验仪器：使用到的实验仪器主要包括数码凝胶图像分析仪、紫外分光光度计、台式高速冷冻离心机、电泳仪、酶标仪、电转移仪、倒置相差显微镜、二氧化碳细胞培养箱、正置荧光显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1骨细胞的分离培养
将骨细胞通过序列消化分离和培养传代，分离过程中消化剩余的骨碎片，将其上清液弃去，骨片采用PBS进行清洗，然后采用EDTA溶液消化骨片，弃去上清液，采用PBS进行清洗，采用Ⅰ型胶原酶进行第七次消化，将上清液收集到新的培养瓶中，加入培养基进行止酶消化，采用EDTA溶液和Ⅰ型胶原酶化进行第八次和第九次消化，将上清液收集合并。对上清液进行过滤、离心，将上清液弃去，加入α-MEM 培养基，吹打然后进行计数。将浓度为3×105个/ml的原代细胞接种到Ⅰ型胶原酶的培养皿中，放置在适宜的温度下培养，3天换一次培养基，进行胰蛋白酶细化传代。
1.2.2成骨细胞的分离培养
将乳鼠浸泡在75%的酒精中处死，在无菌的条件下取颅骨，将结缔组织和骨膜等去除，采用磷酸盐缓冲液进行清洗、把骨片剪碎，将骨片放到培养瓶中，采用胰酶进行消化，将上清液去除，然后采用Ⅱ型胶原酶进行消化，将上清液弃去，再次使用Ⅱ型胶原酶进行消化4次，收集合并上清液，加入培养基中进行止酶消化，然后进行过滤和离心，弃上清液，加入α-MEM 培养基，吹打然后进行计数。将浓度为3×105个/ml的原代细胞接种到Ⅰ型胶原酶的培养皿中，放置在适宜的温度下培养，3天换一次培养基，进行胰蛋白酶细化传代。
对两种细胞进行HE染色、Ⅰ型胶原的免疫组化染色、骨钙素(BGP)免疫荧光染色、ALP的偶氮偶合法染色，测定ALP活性，对两种细胞进行蛋白质印迹( Western blot) 分析。
1.3 统计学分析
两组的统计方法为：采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 骨细胞和成骨细胞的形态学结果
在光学显微镜下，骨细胞有多个突触结构，形态比较丰满，呈现树枝状和星状，细胞之间都是通过突触相互连接的；成骨细胞呈现纤维细胞状形态和梭形细胞形态。两者经过HE染色之后，表现出明显的差异，骨细胞呈现放射状，成骨细胞呈现长梭形。
2.2 骨细胞和成骨细胞的染色结果和活性对比
经过Ⅰ型胶原免疫组化染色，骨细胞表达量低，为浅棕色，成骨细胞表达量高，为深棕黄色；经过BGP免疫荧光染色，骨细胞表达高，成骨细胞表达低；经过ALP免疫组化染色，成骨细胞的ALP活性高于骨细胞，呈现棕黄色。经过ALP活性检测，骨细胞ALP活性低于成骨细胞，两者比较具有统计学意义（P<0.05）。
3.讨论
成骨细胞在骨重建和骨修复中占据非常重要的地位，主要位于骨基质表面，而骨细胞是一种高度分化的细胞，主要位于骨基质内的矿化陷窝，骨细胞在骨基质的合成与矿物盐的分泌中并没有发挥主导地位，而是决定是否启动骨形成和骨吸收的关键细胞，可以感知体内神经系统和血液的一系列信号，在骨代谢的疾病诊治中具有比成骨细胞更加重要的作用[1-2]。对大鼠成骨细胞进行分离纯化的技术已经比较成熟，当成骨细胞向骨细胞转化的过程中，会伴随着一定指标的变化[3-4]。在本次研究中，成骨细胞的Ⅰ型胶原、BGP和ALP的表达都存在着明显的差异，可以作为骨细胞鉴定的指标。
【参考文献】
[1]谢艳芳，陈克明，马小妮等.大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化与比较研究[J].解放军医药杂志，2015，14(3):15-16.
[2]赵尚昆.不同来源大鼠成骨细胞增殖和成骨活性比较的实验研究[D].天津医科大学，2008.
[3]孙太存，邓展生.两种方法分离新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的比较[J].临床医学工程，2012，19(9):1475-1476.
[4]明磊国，陈克明，葛宝丰等．淫羊藿苷与染料木黄酮对体外培养成骨细胞增殖及矿化成熟影响的对比研究[J].中国中药杂志，2011，36(16):2240-2245．
论文作者:徐旭
论文发表刊物:《医药前沿》2016年9月第27期
论文发表时间:2016/10/9
标签：细胞论文; 胶原酶论文; 颅骨论文; 活性论文; 培养基论文; 免疫论文; 大鼠论文; 《医药前沿》2016年9月第27期论文;