（1新疆医科大学基础医学院病原学教研室 新疆 乌鲁木齐 830011）（2喀什地区结核病防治所 新疆 喀什 844000）（3新疆医科大学基础医学院法医学教研室 新疆 乌鲁木齐 830011）
【摘要】目的：对荧光定量PCR技术检测结核杆菌复合体的临床应用进行研究和探讨。方法：选取在喀什地区结核病防治所（喀什地区结核病医院）进行治疗的200例呼吸系统疾病的患者，其中肺结核患者119例作为试验组，非结核病患者81例作为对照组，应用荧光定量PCR法、痰涂片法、培养法检测结核分枝杆菌。结果：在本实验中，对200份标本进行检测，其中，荧光定量PCR法＞培养法＞涂片法，差异显著（P＜0.05）。在灵敏度检测中，荧光定量PCR法显阳性高于培养法和涂片法，差异显著（P＜0.05）。结论：荧光定量PCR技术检测结核杆菌具有较好的效果，灵敏度较好，特异性较高。
【关键词】荧光定量PCR技术；结核杆菌；临床应用研究
【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）08-0238-02
结核病是一种由结核分枝杆菌所引发的对人体造成慢性传染性的疾病。WHO 2017年的报道指出[1]，印度结核病患病人数居世界第一位，其次是印度尼西亚和中国。新疆地区结核病流调结果显示[2]，活动性肺结核患病率为1526.12人/10万。结核病给社会经济发展及社会稳定带来很大的负面影响，所以能够对结核疾病早发现早诊断是预防结核病的关键之所在。目前，较为常见的诊断方法主要有培养法、抗酸染色法和荧光定量PCR法，其中荧光定量PCR技术以其简单快速，成本低廉，高灵敏度和高特异度等特点而被广泛应用于传染病的诊断，可以弥补传统方法的某些缺陷。本研究通过采用荧光定量PCR技术分别对标准菌株、结核分枝杆菌PCR检测标准品和结核病拟诊病例痰标本进行PCR检测，与传统方法即痰涂片法，菌培养法进行比较，评价了结核分枝杆菌复合体核酸扩增荧光检测法快速检测痰标本的灵敏度和特异性。
1.资料和方法
1.1 一般资料
选取2015年4月—2016年8月在喀什地区结核病医院进行治疗的200例患者痰液标本200 份，其中肺结核患者119例作为试验组，女性57例，男性62例，平均年龄35.8±7.9岁，平均病程2.4±1.4个月；非结核病患者81例作为对照组，女性37例，男性44例，平均年龄36.1±8.6岁，平均病程2.4±1.7个月。其中肺结核疾病患者都与肺结核的诊断标准[3]相符。对患者的痰液标本进行采集备用。
1.2 仪器和试剂
BIO-RAD IQ5荧光定量PCR仪（广州东盛生物科技有限公司）；结核分枝杆菌复合体核酸扩增荧光检测试剂盒(新疆阿尔森生物科技有限公司)；结核分枝杆菌分离和鉴定培养基（上海哈灵生物科技有限公司），分枝杆菌抗酸染色液（上海哈灵生物科技有限公司），DNA提取试剂盒QIAamp DNA mini（德国凯杰公司）。
1.3 方法
1.3.1痰涂片抗酸染色镜检 依照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》进行常规方法操作，制作痰标本，染色后镜检分级计数。
1.3.2分枝杆菌培养和鉴定 痰标本在4%NaOH的消化后，在酸性罗氏培养基进行分枝杆菌的培养，利用PNB生长试验对分枝杆菌的菌型进行鉴定，具体过程为从生长状态良好的培养基上选取单一菌落制成菌液（10mg/mL），然后接种到PNB培养基上继续培养，观察盛装状况。分枝杆菌的培养和鉴定具体操作步骤依照《结核病诊断实验室检验规程》进行。
1.3.3痰液中DNA提取和荧光定量PCR技术 取50mLPBS（pH=6.8）加入到4%NaOH进行消化的痰标本中，15分钟后，离心（3000r/min）20分钟，弃去上清液，加入50μLTE进行灭活20分钟，然后沸水浴保持10分钟，离心（12000r/min）5分钟，取2μL上清液进行PCR扩增。按照PCR试剂盒操作说明书，将提取的样本DNA加入PCR反应管,按规定循环参数进行PCR反应。利用阳性梯度标准品的CT值(循环阈值)所制作的标准曲线制定出样品的DNA拷贝数。
1.4 统计学方法
数据采用SPSS20.0软件进行分析，计数资料进行χ2检验，计量资料用均数±标准差(x-±s)表示，进行t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
（1）阳性率比较
在本实验中，对200份标本进行检测，其中荧光定量PCR法72（61%）显阳性，培养法38（32%）显阳性，涂片法28（24%）显阳性，荧光定量PCR技术的检出率最高,细菌培养法次之且检测时间较长,涂片法检出率最低，（见表）检出率差异有显著性（P＜0.05）。
（2）灵敏度与准确度
荧光定量PCR法的灵敏度为96.77％，准确度为96.01％。
3.讨论
结核病的发病原因是感染了结核杆菌，一旦发病，会对各个器官造成严重影响，其中以肺结核最为多见。在我国，结核病的发病率较高，且彻底治愈较为困难[4]。对结核病进行早诊断早治疗是能够进一步控制结核病传染的基础，能够有效的改善患者的预后情况。虽然细菌培养法和痰涂片法是目前临床上常用的方法，但是细菌培养法耗时长，且灵敏度较低，又容易出现漏检[5]。痰涂片法阳性率较低，尤其是对脑脊液标本，平均为10％(0～87％)[6]。荧光定量PCR法是当标本加入一条与靶基因序列互补的荧光双标记寡核苷酸探针后能够在出现特异性PCR扩增时有特异性的荧光出现。通过检测荧光值的变化对扩增产物的量进行确定[7-9]。
在本实验中，对200份标本进行检测，其中，荧光定量法阳性检出率最高，差异显著（P＜0.05）。在灵敏度检测中，荧光定量PCR法显阳性高于培养法和涂片法，差异显著（P＜0.05）。实验结果表明荧光定量PCR法与传统方法比较，检出率较高，灵敏度好，特异性高。出现假阳性率的概率低，能够在结核病早期作出快速诊断，对于临床高度疑似病例而痰涂片和菌培养法都是阴性的患者以及对结核病患者治疗后的疗效监测都很适用，进一步为临床效果和预后提供参考价值。综上所述，荧光定量PCR技术检测结核杆菌的应用效果较好，建议将荧光定量PCR法作为常规检测，以提高结核分枝杆菌检测的准确率。
【参考文献】
[1] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/zh/
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基金项目：新疆维吾尔自治区中小企业创新基金项目（21-5100486）
论文作者:迪丽达尔?库德热提1,高剑1,黄巧玲2,郭南2,李慧
论文发表刊物:《医药前沿》2018年3月第8期
论文发表时间:2018/3/22
标签：荧光论文; 定量论文; 涂片论文; 分枝论文; 结核病论文; 杆菌论文; 结核论文; 《医药前沿》2018年3月第8期论文;