赵国栋１ 回丽妹２ 赵建军３ 通讯作者１．河北工程大学附属医院普外一科 河北 邯郸 ０５６００２;２．河北工程大学附属医院产科 河北 邯郸 ０５６００２;３．河北工程大学附属医院泌尿外科 河北 邯郸 ０５６００２
【摘要】 目的 观察携带人端粒酶逆转录酶基因的慢病毒表达载体转染SW６２６细胞(人卵巢腺癌细胞株)后hTERT基因在靶细胞中的表达.方法 将携带目的基因hTERT的重组慢病毒表达载体及包装系统共转染２９３T细胞(人胚肾上皮细胞株),通过超速离心沉淀法浓缩病毒上清后转染SW６２６细胞.转染前将靶细胞分为转染组、空转组及对照组,完成转染后于显微镜下观察靶细胞中绿色荧光蛋白显色,并应用PCR检测SW６２６细胞中hTERTmRNA 的表达.结果 ２９３T细胞经重组慢病毒与包装质粒共转染后能产生重组病毒并且能够成果的将目的基因hTERT高效地转导入靶细胞SW６２６细胞中并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察到GFP;转染后的SW６２６细胞经检测,其内hTERT基因mRNA 表达明显增强.结论 重组慢病毒表达载体LV４－pGLV－EF１a－EGFPhTERT能够高效稳定地将外源hTERT 基因导入SW６２６细胞并使其长久表达,为卵巢肿瘤生物治疗研究奠定了科研基础. 【关键词】 慢病毒; 转染; hTERT; 端粒酶【中图分类号】R３４６【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－０４２３－０１
端粒酶是一种核糖核酸蛋白复合体,能够延长端粒末端并保持端粒长度,主要有３个亚单位组成,即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白及其催化亚单位端粒酶逆转录酶基因(HumanTelomeraseReverseTranscriptase,hTERT).正常真核细胞的端粒可被称作“生命之钟”[１].伴随端粒酶活性的增加,hTERTmRNA表达水平也相对应成一定比例增加,hTERT是调控人类端粒酶活性的主要亚单位,只要hTERT表达其他亚单位就会与其共同构成高活性的端粒酶全酶[２].慢病毒载体具有感染宿主广、基因整合率高且稳定、性质较稳定等诸多优点[３],通过构建携带人端粒酶逆转录酶基因的慢病毒表达载体,并观察转染后靶细胞内hTERT基因表达,从而为卵巢肿瘤生物治疗提供一种有效的科研手段.
１ 材料与方法
１．１ 材料携带目的基因hTERT 的慢病毒表达载体(pGLV－EF１a－EGFPhTERT);不携带任何外源基因的表达载体pGLV－EF１a－EGFP;感受态DH５α、人胚肾上皮细胞株２９３T细胞、人卵巢癌细胞株SW６２６.
１．２ 主要仪器与试剂超净台,CO２细胞培养箱,DEME高糖细胞培养基、RPMI－１６４０细胞培养基、胎牛血清、２４孔及９６孔培养板,光学显微镜,５１８０R高速低温离心机,垂直电泳仪无内毒素质粒小提试剂盒,Lipofectamine２０００,PCR试剂.
１．３ 引物设计所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成.根据hTERTmRNA 序列用PrimerPremier５．０软件设计hTERT引物.GAPDH 作为内参.hTERT: 上游引物:５′－３′GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG 下游引物:５′－３′CGACGTAGTCCATGTTCACAA 拟扩增长度:２５４bpGAPDH: 上游引物:５′－３′GAAGGTGAAGGTCGGAGT 下游引物:５′－３′GAAGATGGTGATGGGATTTC 拟扩增长度:２２６bp
１．４ 方法
１．４．１ 慢病毒包装将处于对数生长期的２９３T细胞接种于六孔板中,每孔约３×１０６个细胞,使其生长到转染当天达到７０％左右的融合度,加入含１０％FBS的高糖DMEM 培养基,放于３７℃、５％CO２培养箱中过夜培养.根据质粒质量换算出所需的体积,取６个１．５mL灭菌的EP管,分别加入１．５μg包装混合质粒和０．５μg表达质粒及无血清的高糖DMEM 培养基,使总体积为２５０μL.轻轻混匀后于室温静置５min; 取６个１．５mL灭菌EP管,分别取１０μL脂质体２０００溶于２４０μL无血清DMEM 培养基中.轻轻混匀后于室温静置５min;将DNA溶液和脂质体溶液轻轻混匀. 室温静置２０min;PBS轻轻冲洗六孔板中的２９３T 细胞２－３次,各孔分别加入DNA溶液与脂质体的混合液５００μL,置于３７℃５％CO２培养箱中;６－８h后观察细胞,形态基本不改变说明细胞耐受,移去DNA溶液与脂质体的混合液,加２mL 含１０％FBS含双抗的新鲜高糖DMEM 培养基,可于镜下观察绿色荧光;７２h后收取病毒上清,超速离心沉淀(４℃,３００００rpm,２h),浓缩纯化病毒;每管５０μL分装,－８０℃保存.
１．４．２ 重组慢病毒感染SW６２６细胞接种３－５×１０３ 个SW６２６ 细胞于９６ 孔培养板的每孔中,加１００μLRPMI１６４０培养基,使病毒感染时细胞的融合度为５０％左右;感染前为细胞换液, 吸去细胞上清,将靶细胞分为转染组、空转组和对照组加入所需的培养基９０μL, 每组重复三个孔;预先从－８０℃冰箱中取出病毒液,冰上融化备用.转染组加入pGLV－EF１a－EGFP－hTERT慢病毒、空转组加入pGLV－EF１a－EGFP慢病毒、对照组加入等量的培养基;感染３－５d后,观察荧光表达情况;１．４．３ RT－PCR检测靶细胞中hTERT基因mRNA的表达分别提取三组细胞转染后３天的总RNA,逆转录cDNA作为模板,同时扩增目的基因hTERT(２５４bp)及内参GAPDH (２２６bp).PCR 反应体系２０μL.循环参数为:９４℃ 预变性５min;９４℃变性３０s,５５℃退火４５s,７２℃延伸１min,３４个循环;７２℃继续延伸１０min. １．５ 统计学处理采用SPSS１３．０软件进行统计学分析.实验结果的计量数据以均数±标准差(±s)表示,数据之间比较采用单因素方差分析.以P＜０．０５为差异有统计学意义.
２ 结果
２．１ 包装细胞２９３T转导pGLV－EF１a－EGFP－hTERT后GFP的表达图１A为pGLV－EF１a－EGFP－hTERT质粒转导入２９３T细胞７２h后,在荧光显微镜下可以看到GFP的表达呈阳性,其表达率达９０％以上.图１B为重组慢病毒感染SW６２６细胞３d后可见GFP的表达,第５天时最强,表明包装出的慢病毒可以成功感染目的细胞SW６２６.MarkerI(１００bp－６００bp)
３ 讨论
人的端粒是由６个碱基重复序列和结合蛋白组成.端粒有重要的生物学功能, 可稳定染色体的功能,防止染色体DNA 降解、末端融合,保护染色体结构基因DNA,调节正常细胞生长.正常细胞由于线性DNA 复制５＇末端消失,随体细胞不断增殖,端粒逐渐缩短,当细胞端粒缩至一定程度后细胞停止分裂从而处于静止状态.故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”,端粒长短和稳定性决定了细胞寿命,并与细胞衰老和癌变密切相关.细胞中有种酵素负责端粒的延长,即端粒酶.端粒酶是核糖核酸蛋白复合体,主要有３个亚单位组成,即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白(TPI)及其催化亚单位端粒酶逆转录酶基因(hTERT).hTERT表达与端粒酶活性密切相关,在端粒酶表达中起决定性作用[４－５].它能以自身RNA组分为模板,合成端粒DNA 序列,维持端粒保持一定长度,因而避免因端粒丢失而引起的细胞凋亡,这与多种肿瘤的发生有关,同时使得细胞维持永生性[６]. 慢病毒感染机制是在宿主细胞内以病毒RNA为模板,在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板合成双链DNA,经环化后整合在宿主细染色体上并长期表达.本研究应用慢病毒感染SW６２６细胞,使得靶细胞能够长期稳定的表达目的基因,可以得到长期稳定表达hTERT目的基因的细胞株,从而能够达到研究目的基因对细胞功能的影响,以及进行进一步实验的目的,为进一步的实验进展提供充足的细胞来源. 参考文献[１] 张嵩,王玉虎,陈乃耀．端粒,端粒酶及其与肿瘤关系的研究进展[J]．中国综合临床,２００７,２３(３):２８５－２８８． [２] 庞建新,程希远,吴曙光．转录因子Sp１和Sp３对JurkatT细胞端粒酶活性的调节作用[J]．第一军医大学学报,２００２,２２(６):４８１－４８５． [３] 杨静,邓锡云,邓琳,等．EBVLMP１通过诱导cMyc表达活化端粒酶hTERT [J]．病毒学报,２００３,１９(３):２４０－２４４． [４] BODNARAG．Extensionoflife－spantelomeraseintonormalhumancells [J]．Science,１９９８,２７９(５３４９):３４９－３５２． [５] COUNTERCM．TelomeraseactivitybyectopicthecatalyticsubunitoftelomＧ[ erase[J]．Oncogene,１９９８,１６(９):１２１７． ６] 徐杰．双反义腺病毒载体Ad－ODC－AdoMetDCas对食管癌细胞凋亡及抑制细胞生长影响的研究[J]中国肿瘤临床２００８,３５(２３):５１７－５１９
论文作者:赵国栋１ 回丽妹２ 赵建军３
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/2/24
标签：细胞论文; 转染论文; 端粒论文; 基因论文; 目的论文; 病毒论文; 培养基论文; 《中国综合临床》2015年9月供稿论文;