第三军医大学第一附属医院 急救部 重庆 400038
【摘 要】目的：探讨槲皮素(Quercetin)对大鼠重症急性胰腺炎(SAP)血小板功能的影响。方法：40只成年SD大鼠随机分为4组，每组10只，假手术组（Sham）、重症急性胰腺炎组（SAP）、槲皮素低剂量组（L-Que组：50 mg/kg）及槲皮素高剂量组（H-Que组：100 mg/kg）。逆行性胰胆管注射5%牛磺酸钠建立SAP大鼠模型。槲皮素组在胰腺炎模型基础上予槲皮素干预，Sham 组、SAP组给予等量生理盐水。分别于造摸后6 h测定血小板l min聚集率(PAR- 1)、最大聚集率(PAR-m)、血小板粘附率(PAR)及血浆血小板α颗粒膜蛋白水平(GMP-140)、血栓素B2(TXB2)水平。结果：SAP组大鼠PAR-1、PAR-m、PAR、GMP-140、TXB2水平显著高于Sham组（P＜0.05）。与SAP组比较，槲皮素低剂量组及高剂量组PAR-1、PAR-m、PAR、GMP-140、TXB2均明显下降。结论：Que可部分降低SAP大鼠血小板活化程度，改善血小板的聚集、粘附和释放功能。
【关键词】重症急性胰腺炎；槲皮素；血小板功能；血小扳α颗粒膜蛋白；血栓烷B2
【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）14-234-02
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是由于胰腺分泌的消化酶自我消化胰腺及其周围组织而导致的严重急性炎症反应，是临床较常见的急腹症，常可导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）[1-2]。重症急性胰腺炎发病机制复杂，目前仍未完全清楚。研究表明血小板活化可能参与了SAP整个病理生理过程，在SAP发生发展过程中占据比较重要的环节[3-4]。槲皮素（quercetin,Que）是一种广泛存在于水果、蔬菜和谷物等植物中的黄酮类化合物。研究表明其具有抗血小板聚集、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[5-6]。因此槲皮素可能具有改善SAP早期血小板功能紊乱，改善SAP凝血功能障碍的作用，但相关内容尚未见报道。本研究拟探讨槲皮素是否具有影响SAP血小板功能的作用，为SAP临床防治提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂、仪器及动物
槲皮素（Sigma）,GMP-140、TXB2购于苏州医学院血栓与止血研究室。牛磺胆酸钠（Sigma）,其他试剂均为国产分析纯。TYXN291型血小板自动分析仪(上海医疗仪器设备厂)。40只清洁级Spragne-Dawley（SD）大鼠，体质量(220±40)g，雌雄不限，由第三军医大学动物实验中心提供。
1.2 动物模型与分组
将40只清洁级SD大鼠随机分为对照组（sham）、重症急性胰腺炎组（SAP）、槲皮素低剂量组（Que-L组）、槲皮素高剂量组（Que-H组），每组10只。Sham组仅行开腹关腹手术，余下三组均经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠（2mL/kg）制作SAP模型。槲皮素组在SAP模型基础上予槲皮素干预，槲皮素溶于二甲亚砜溶液中，在注射制模前30 min腹腔注射(低剂量组50mg/kg，高剂量组100 mg/kg)。Sham组和SAP组给予等量生理盐水腹腔注射。各组于术后6 h采血检测相关指标。
1.3 血小板聚集率测定
从大鼠股动脉取血约5 mL，与抗凝剂(3.8%枸橼酸钠溶液)以9:l混合，抗凝血以600-800 r/min离心5 min。取上层富血小板血浆(PRP)，余血再以3 000 r/min离心15 min，取上层贫血小板血浆(PPP)，每次测定前用自身PPP调节PRP使血小板数目在(300-500)×109/L，取200uL PRP加入致聚剂ADP 10uL(终浓度10umol/L)， 在TYXN291型血小板自动分析仪上测定血小板l min聚集率(PAR-1)、最大聚集率(PAR-m)。
1.4 血小板粘附率（PAR）测定
采用Wright法（旋转法），用5 mL硅化注射器由颈总动脉采血1.2 mL，加入含有3.8%柠檬酸钠0.13 mL的硅化试管中混匀，从试管中取血1mL，加入容量为8 mL的长颈圆瓶中，置于XSD-RⅡ型体外血小板粘附两用仪转盘上，恒温37℃，以3.7r/min旋转15 min，分别测定旋转前后血小板数，计算2次平均值。计数血小板数和PAR。PAR=(旋转前血小板数-旋转后血小板数)/旋转前血小板数×100%。
1.5 血浆GNP-140、TXB2测定
采每只大鼠心脏血2 mL，采用放射免疫法测定血浆GMP-140和TXB2的值。
1.6 统计学处理
所有数据采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD多重比较法，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Que对SAP大鼠PAR-1/PAR-m及PAR的影响。
与Sham组比较，SAP组和Que各剂量组PAR-1、PAR-m及PAR明显升高，差异有统计学意义(P<O.05)；Que低、高剂量组PAR-1、PAR-m及PAR均较SAP组低，差异有统计学意义(P<0.05)；Que高剂量组PAR-1、PAR-m及PAR均较Que低剂量组低，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表1)。
2.2 Que对SAP大鼠的影响。
与Sham组比较，SAP组和Que各剂量组GMP-140、TXB2含量明显升高，差异有统计学意义(P<O.05)；Que低、高剂量组GMP-140、TXB2含量均较SAP组低，差异有统计学意义(P<0.05)；Que高剂量组GMP-140、TXB2含量均较Que低剂量组低，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表2)。
3 讨论
重症急性胰腺炎(SAP)常常导致多器官功能障碍综合征 (MODS)，发病过程有“二次攻击学说”,即将急性胰腺炎初期的胰酶激活和胰腺自身消化作为第一次攻击,而将损伤继发的免疫异常和血液循环障碍作为第二次攻击[7]。SAP病程中出现的凝血系统和抗凝血系统的失调是其中重要的组成部分。研究发现SAP中导致凝血-抗凝血系统功能失调的机制涉及很多方面，如炎症介质释放、血管内皮细胞的改变、细胞信号通路的变化、凝血系统的活化和抗凝系统的耗竭等等。这些改变互为因果，诱导和促进凝血、抗凝血系统各项指标变化,最终导致胰腺坏死、肺损伤及全身多脏器功能受损。另有研究表明在SAP的各个阶段，尤以早期血液常处于高凝状态，在体内形成大量微血栓形，这与胰腺炎患者微循环障碍的形成有明确的关系，而这些微血栓形成与血小板代谢活跃，聚集粘附力和止血性强密切关系，说明在SAP发病过程中存在着包括血小板功能在内的凝血和纤溶功能的障碍。治疗中早期改善SAP血小板功能紊乱，抑制血小板过度活化，将有助于改善急性胰腺炎患者的预后。
槲皮素是目前广泛研究的一种小分子黄酮类物质，其生物活性广泛，具有清除氧自由基、抗炎、调节免疫、减轻缺血/再灌注损伤、钙拮抗和蛋白激酶 C 抑制等多种生物学活性[14-15]。槲皮素在急性胰腺炎中的作用已进行了较多研究，郑俊媛[16]等发现槲皮素可以减轻大鼠高甘油三酯相关性胰腺炎的胰腺病理损伤, 尤其是腺泡坏死和炎性浸润。徐晓武[17-18]等发现槲皮素通过上调肺泡中性粒细胞(PMN)Bax蛋白表达、活化PMN TLR4/NF-κB信号通路、抑制Bcl-2蛋白表达，诱导PMN凋亡减轻SAP引起的肺损伤。我们研究中发现，Que各剂量组大鼠血小板聚集率、粘附率、血浆GMP-140和TXB2水平均显著低于SAP组。这说明应用Que后，很大程度上改善了SAP大鼠血小板聚 集、粘附和释放功能，抑制了血小板的过度活化，且上述改变呈剂量依赖性。因此早期应用Que治疗，可改善胰腺炎大鼠血小板功能，一定程度上改善凝血和纤溶功能障碍，缓解全身炎症反应，从 而可有效地降低SAP的病死率，改善SAP的预后。但Que通过何种途径和机制改善血小板的功能,持续效应如何，量效关系如何等均需要进一步研究明确。
参考文献
[1]Horibe M,Egi M,Sasaki M,et al.Continuous Regional Arterial Infusion of Protease Inhibitors for Treatment of Severe Acute Pancreatitis: Systematic Review and Meta-Analysis[J].Pancreas,2015,44(7):1017-1023.
[2]Ji L,Lv JC,Song ZF,et al.Risk factors of nfected pancreatic necrosis secondary to severe acute pancreatitis[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2016,15(4):428-433.
[3]Pan Z,Feng L,Long H,et al.Effects of Local Pancreatic Renin- Angiotensin System on the Microcirculation of Rat with Severe Acute Pancreatitis[J]. Korean J Physiol Pharmacol, 2015,19(4):299-307.
[4]Wang B,Peng Y,Dong J,et al.Human platelets express functional thymic stromal lymphopoietin receptors: a potential role in platelet activation in acute coronary syndrome[J].Cell Physiol Biochem, 2013,32(6):1741-1750.
[5]Ishizawa K,Izawa-Ishizawa Y,Ohnishi S,et al.Quercetin glucuronide inhibits cell migration and proliferation by platelet-derived growth factor in vascular smooth muscle cells[J]. J Pharmacol Sci,2009,109(2):257-264.
[6]张志琴,朱双雪.槲皮素的药理活性与临床应用研究进展[J].药学研究 2013,32(7):400-403,433.
论文作者:李燕,谢百发[通讯作者]
论文发表刊物:《系统医学》2016年14期
论文发表时间:2016/11/21
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