杨德全[1]2008年在《传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA检测方法的研究》文中进行了进一步梳理传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV的N蛋白在进化上较为保守,主要与基因组核酸的包裹、RNA的合成和细胞免疫有关,含有大量抗原决定簇,免疫原性仅次于S蛋白,能诱导机体产生交叉保护性抗体。本研究克隆表达了具有高度保守性的N蛋白基因,并将其作为免疫原制备多克隆抗体,建立检测IBV抗原的夹心ELISA法,为该病的早期诊断和控制提供了良好工具。IBV血清型较多,新的变异株在不断出现,且不同型毒株间缺乏交叉保护或仅有部分交叉保护,给免疫防治带来很大困难。本研究尝试利用霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit,CTB)的粘膜佐剂作用,将IBV N基因的表达产物与CTB混合或将N基因与CTB融合表达后,鼻腔免疫7日龄肉鸡,以期提高鸡鼻腔、气管和肠粘膜表面抗IBV sIgA的抗体水平,从而达到预防和控制IB的目的。本研究主要研究内容和研究结果如下:1.IBV核蛋白基因(np)与霍乱毒素B亚基基因(ctb)的融合表达将ctb基因和np基因融合后,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了成功表达,产物命名为rCTB-NP。复性后的表达产物经SDS-PAGE检测,出现了分子量大小为72.0kDa和92.0kDa的两条带。Western blot分析表明,融合蛋白rCTB-NP中的N蛋白具有良好的免疫反应性。GM_1-ELISA实验结果表明,融合蛋白rCTB-NP中的CTB蛋白具有良好的免疫学活性。2.传染性支气管炎病毒重组核蛋白粘膜免疫效果研究将融合蛋白rCTB-NP,rNP、rNP+rCTB分别免疫7日龄肉鸡,用ELISA法检测血清中的IgG-NP、IgA-NP及鼻、气管和肠粘膜部位的sIgA-NP。结果发现,二免和叁免后,血清中均能产生较高水平的IgG-NP抗体,但IgA-NP抗体水平较低;鼻、气管和肠粘膜部位rCTB+rNP组和rCTB-NP组的sIgA-NP抗体水平与NP组比较,前两组显着高于NP组(p＜0.05);气管粘膜部位sIgA-NP水平表现为rCTB-NP组＞rCTB+rNP组＞rNP组。结果表明,CTB与IBV N蛋白融合表达产物或与该蛋白混合进行鼻腔免疫时,能显着提高鸡鼻腔、气管和肠粘膜表面sIgA的抗体水平。3.检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立以鸡抗NP IgG为包被抗体,兔抗IBV IgG为二抗,建立了检测IBV的夹心ELISA法。结果表明,鸡抗IBV IgG的最佳包被浓度为2.5μg/mL,兔抗IBV IgG的最适工作浓度为5μg/mL;该方法比血球凝集试验敏感性高8倍以上,与NDV、AIV、EDS_(-76)V、IBDV等无交叉反应,说明该法特异性和敏感性较高。
高磊[2]2001年在《鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的序列分析与表达》文中研究说明本研究根据国内外已经发表的传染性支气管炎病毒（IBV）核蛋白（NP）基因核苷酸序列，设计并合成了核蛋白基因的特异性引物NP3、4和NP5、6。利用RT-PCR技术分别对IBV国内分离株DB株、XJ株、DC株、HD株的核蛋白基因进行了特异性扩增，得到了大小为1.4Kb左右的核苷酸片段。之后，利用平端连接的方法将四个核蛋白基因片段分别克隆到载体质粒PUC19的SmaI酶切位点，经过酶切、PCR鉴定和序列测定证实分别得到了含有IBV核蛋白基因的重组质粒PUC19-XJ-N、PUC19-DC-N、PUC19-HD-N、PUC19-DB-N。其中PUC19-DB-N包含有DB株IBV的核蛋白全基因序列，全长1.23Kb，另外叁个重组质粒分别包含有1.199Kb的核蛋白基因片段。 将四株IBV国内分离株的核蛋白基因序列同Genbank数据库中已经发表的十株参毒株的核蛋白基因序列进行了比较分析，各毒株之间的同源性在86％-98％之间。利用Genruner软件推导出各毒株的核蛋白氨基酸序列，在氨基酸水平上不同毒株之间表现出的同源性在88％-97％之间。系统进化分析表明，我国的四个分离株跟澳大利亚群的N1/62株和VICS株的亲缘关系最为密切。其中，DC株已经单独成为一个分支，发生了较大程度的变异。 设计并合成了另外一对核蛋白基因特异性引物NP7、8，上下游引物5′末端分别引入了BamHI和NcoI限制性内切酶位点，对pUC19-DB-N中的核蛋白基因进行了特异性扩增，扩增产物经过BamHI、NcoI的消化后，克隆到杆状病毒体外表达系统转移载体pBlueBacHis B的BamHI和NcoI位点之间，经过酶切、PCR鉴定证明得到了重组转移载体pBlue-DB-N，序列分析证实其中的核蛋白基因读码框完全正确可以用于转染实验。 在脂质体转染试剂介导下，将重组杆状病毒转移载体pBlue-DB-N与线性化的杆状病毒DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞，经过叁轮蚀斑纯化，获得了重组杆状病毒rBac-DB-N。提取重组杆状病毒DNA利用特异性引物NPa/b进行PCR扩增得到了大小为2Kb左右的片段，证明目的基因片段克隆到了杆状病毒基因组中。Western blot实验结果表明核蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达，并且具有良好的生物学活性。SDS-PAGE电泳分析显示重组病毒表达的融合蛋白分子量为56KDa左右，薄层扫描显示核蛋白的表达量占细胞蛋白总量的19.4％左右。
邓小敏[3]2007年在《鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株N基因的克隆与分子遗传变异研究》文中认为由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是高度传染的全球性鸡病之一,严重危害养鸡业。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异给IB的免疫防控带来很大的困难。由IBV变异引起的疫苗免疫失败现象越来越多。IBV N基因及其编码蛋白在病毒RNA的复制、包装、核衣壳的形成、诱导体液免疫和细胞免疫应答等方面有重要意义。本研究对8株IBV陕西分离株的N基因的遗传变异进行了研究,目的是从分子水平上探索我国IB疫苗免疫失败的原因,并对N基因及其编码蛋白在IBV抗体水平监测、诊断和IBV基因工程疫苗等方面的应用进行了初探。研究内容如下:1.用RT-PCR方法对8个IBV陕西分离株(WH、YX、YL、BJ、WG、G5、FF2、B01)的N基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的7个IBV参考毒株的N基因进行核苷酸序列、氨基酸序列和系统进化树比较分析。结果表明,IBV陕西分离株与参考毒株的同源性差异较大(85.5%～87.3%),所有分离株N蛋白突变均以散在的点突变形式为主,其变异与组织嗜性无明显相关性;分离株WH、YX和YL与参考毒株Ark99及Gray在同一进化分支上,差异较小;而BJ、WG和G株则形成一个独立的进化分支,与我国疫苗毒株W93、H120及其他参考毒株差异较大;B01株与M41株在进化上接近,与Beaudette株、EP3株在同一进化分支;FF毒株与其他毒株N蛋白差异最大,排在进化树最始端。实验结果提示,我国IBV地方分离株N基因变异有不断加大的趋势。2. IBV陕西分离株G5(W118)已作为我国动物疫苗生产企业--杨凌绿方生物工程有限公司IBV多价灭活苗的制苗毒株之一,该灭活苗对于预防肾变型IB有明显效果。为了从分子水平上揭示W118株的遗传背景和免疫效果,用RT-PCR方法扩增了W118株S1、M和N基因,经克隆和测序后与GenBank登录的IBV参考毒株进行序列比较分析。结果表明,IBV W118株S1基因及N基因与14个参考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为71.0 %～85.3%和72.7%～83.9%及84.1%～95.7%和88.9%～96.1%,M基因与12个参考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为86.6%～98.1%和89.8%～98.2%;W118株的S1蛋白与IBV疫苗株H52、H120比较,在25aa位缺失一个氨基酸,73aa位插入了(T-N-G-N-D -V-G)7个氨基酸,其它区域存在多个点突变;S1蛋白潜在糖基化位点分析显示W118株与美国肾型Gray株、英国变异株793B在潜在糖基化位点上有相似性;W118株M蛋白在61aa, 204aa, 222aa出现了点突变,N蛋白在175～241aa抗原区域出现了5个点突变,这可能影响到此抗原区域的B细胞表位。W118株S1、M和N基因的缺失、插入和点突变,揭示了当前IBV弱毒疫苗H120、H52及W93临床保护力差的分子机制。3.运用生物信息软件对IBV W118株N基因蛋白的二级结构特点及抗原性进行了分析。结果表明,IBV W118株N蛋白的氨基酸组成和二级结构特点使其有利于与RNA结合,N蛋白的抗原性好并存在多个B细胞优势表位,与已鉴定的B细胞表位相比位置更明确。构建了W118株N基因原核表达载体N-pET32a,转化并筛选阳性克隆进行诱导表达,SDS- PAGE和Western-blotting检测表明,高量表达的N蛋白具有良好的反应原性,可用于IBV的诊断,为IBV ELISA检测试剂盒的开发提供了材料。4.重新设计一对引物扩增W118株N基因,将其PCR产物连接pMD18-T载体后,切下目的片段插入到复制型DNA疫苗载体pSCA1。BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定和序列测定结果表明,得到了N基因自杀性DNA免疫质粒W118N-pSCA1,这为进一步研究IBV N基因DNA疫苗提供了素材。有关W118株N基因自杀性DNA疫苗与S1基因的DNA疫苗或IBV分离株灭活苗的联合应用正在试验之中。从本研究的结果来看,8株IBV陕西分离毒N基因核苷酸及氨基酸序列均发生了一定的变异,并与我国疫苗株H120、H52和W93有较大差异,这也许是近年来我国IB疫苗免疫失败的原因之一。IBV W118株主要结构基因(特别是S1基因)的序列分析,揭示了其作为灭活苗制苗毒株能有效预防肾型IBV地方流行强毒株的分子机制以及H120、H52和W93弱毒株在IB临床免疫预防上的缺陷。本研究不仅为新型IBV基因工程疫苗的开发提供了理论依据,而且也丰富了我国IBV的分子流行病学资料。
孟凡磊[4]2007年在《IBV 793/B株N基因的序列分析及地高辛标记探针、双重RT-PCR检测方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。自30年代在美国爆发以来,现已成为世界各地流行的重要禽病。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可因点突变和重组而发生变异,故传染性支气管炎病毒血清型较多。已知的血清型有以侵害呼吸道为主的Conn、Iowa97、JMK、Florida、Arkansas99等和以侵害肾脏为主的M41、Holte、Gray、Australia“T”等30余种。Gough等(Gough et al,1992)报道了英国一种新的793/B血清型的IBV,该毒株和其它血清型传支毒株之间无交叉血清学关系;其免疫原基因S1的序列与欧洲17个传支毒株之间差异高达21～25%。2003年刁有祥、杨杰华等从山东省某蛋鸡饲养场产蛋异常下降鸡群中分离到一株793/B传染性支气管炎毒株,命名为TA03株。目前,该血清型IBV在西班牙、德国、荷兰、中国、意大利、泰国等国均有发生和流行,对养鸡业危害较大。根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBV N基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。参照GenBank已经发表的793/B和多株IBV的N基因和S1基因,设计两对引物,对样品的核酸模板进行扩增,建立了一种能够同时检测鸡传染性支气管炎病毒和鉴定出793/B血清型的双重RT-PCR方法。该方法对793/B血清型可检测到582bp和891bp两条核酸片断,其他的血清型只出现582bp一条核酸片断,而新城疫病毒、传染性喉气管炎、鹅副粘病毒菌未检测到特异型条带。该方法简化了聚合酶链式反应程序和缩短了检测时间。根据Genbank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV 793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV 793/B的N基因由1229bp组成,与Genbank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV 793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9～91.4%,氨基酸同源性为75.8～77.5%。表明IBV 93/B的N基因存在着较大的变异性。
李中华[5]2006年在《传染性支气管炎病毒纤突蛋白、核蛋白基因的克隆、表达及其在抗体检测中的初步应用》文中提出鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。各种年龄、类型的鸡均易感。该病呈世界分布，是严重危害养鸡业的重大传染病之一。传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为不分节段的单股正链RNA病毒，包含至少3种结构蛋白基因：纤突蛋白(S)基因、核蛋白(N)基因、膜蛋白(M)基因。IBV的S蛋白由S1蛋白和S2蛋白两部分组成，在病毒进化中最为活跃，是最重要的保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体，在病毒吸附细胞过程中发挥重要作用，在血清学分类、疫苗免疫防治上起决定性作用；N蛋白进化上最为保守，主要与基因组核酸的包裹、RNA的复制和细胞免疫有关，含有大量抗原决定簇，免疫原性仅次于S蛋白，能诱导机体产生大量抗体。自1931年发现该病以来，至少已有二十九种血清型被报道，并且新的血清型和变异株仍在不断出现。鉴于此，通过克隆表达具有高度保守性的N蛋白基因，并其为诊断抗原建立检测IBV抗体的ELISA法，为监测群体的抗体水平，预防和控制该病提供可靠的依据和有效的技术保障。同时克隆、表达具有型特异性的S1蛋白基因以便为下一步研究该病的基因工程疫苗奠定基础。本课题的主要研究内容包括： 1、传染性支气管炎病毒纤突蛋白S1基因和核蛋白基因的克隆与序列分析 以GenBank公布的IBV基因组的序列为依据，分别设计针对S1基因和N基因的特异性引物，通过RT-PCR法从IBV基因组中扩增出完整的S1和N片断，将扩增片断分别克隆到pMD18-T载体，经酶切和序列测定，S1、N基因片断大小分别为1685bp和1230bp；用BLAST比对发现：S1基因与GX1-98毒株同源性为98％，N基因与H52毒株LKQ3同源性为97％。 2、传染性支气管炎病毒纤突蛋白S1基因和核蛋白基因在大肠杆菌中的表达 构建了弃信号肽区S1基因表达载体pGEX-S1和N基因表达载体pGEX-NP，并成功进行了表达，对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定，结果表明S1分子量大约为80kDa；N蛋白表达于细胞质中，有两种主要产物，大小分别为80 kDa和60 kDa，并利用GST亲和层析柱进行了纯化，获得了相应纯化产物，Western-blot显示纯化产物均能与鸡IBV标准阳性血清发生特异性反应，说明有很好的免疫学活性。 3、基于重组N蛋白的IBV抗体ELISA检测方法的建立
郝春丽[6]2007年在《鸡传染性支气管炎病毒S1和NP基因的表达及NP-ELISA方法的建立》文中研究表明IBV血清型众多,不同血清型间交叉保护差,给诊断与防制带来很大的困难;为建立一种更为简便、快速、群特异性、能用于大面积检测抗体的方法,来补充中和试验和HI试验,以评价疫苗的免疫效果,本研究将对NP-ELISA和S1-ELISA进行探讨。本研究利用RT-PCR技术成功地扩增了传染性支气管炎病毒M41株的NP基因,克隆并重组于原核表达载体pET-28a,经PCR、酶切鉴定及序列测定成功地构建了重组表达载体pET-NP。重组菌pET-NP经IPTG诱导,获得了高效表达,分子量约为49kDa,且以可溶性蛋白形式存在。重组菌pET-NP经大量诱导表达后,收集菌体,超声波裂解,取上清透析后,采用Ni亲和层析柱纯化重组NP蛋白,经12%的SDS-PAGE分析,表明获得了纯度较高的重组NP蛋白。用纯化的NP蛋白作包被抗原,建立了检测IBV抗体的NP-ELISA。抗原最佳包被浓度为1.45μg/孔,待检血清最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳工作浓度为1:800。确定阳性判定标准为0D450≥0.270。NP-ELISA与AIV H9、H5、H7、IBD、ND、EDS_(76)的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性,且灵敏度高、重复性好,但试验表明与HI试验、攻毒保护试验结果没有相关性,故不能用于IB免疫效果的评价方法。本研究利用RT-PCR技术成功地获得了完整的S1基因(S1-1),片段大小为1614bp。在分析全长S1基因的基础上,又扩增了去掉信号肽及包含主要抗原位点的S1-2和S1-3片段,大小分别为1533bp和801bp。将叁个片段分别克隆并重组于原核表达载体pGEX-6P-1,构建了pGEX-S1-1、pGEX-S1-2、pGEX-S1-3重组原核表达载体,经PCR、酶切鉴定及序列测定证明叁个基因片段均正确地插入到表达载体中,且阅读框正确。叁种重组质粒分别转化于宿主菌BL21(DE3),经IPTG进行诱导表达,表达产物经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果表明,重组质粒pGEX-S1-1和pGEX-S1-3没有得到有效表达,而重组质粒pGEX-S1-2获得了表达,表达产物以包涵体形式存在,表达产物的分子量约为80kDa,与理论上推测的分子量大小一致。表达产物经Western-blotting分析表明,该表达蛋白能与M41株标准阳性血清反应,说明此表达蛋白具有良好的生物学活性。S1蛋白是最重要的保护性抗原,可诱导机体产生中和、血凝抑制及保护性抗体,通过实现S1蛋白的有效表达,并建立S1-ELISA,探讨S1-ELISA效价与攻毒保护间的关系,有望替代HI试验和中和试验,用于免疫后抗体的检测和疫苗质量的评价,S1蛋白的表达也可为S1蛋白结构与功能的深入研究和基因工程疫苗的研制奠定良好基础。
徐佳[7]2009年在《鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究》文中认为鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。各种日龄的鸡均易感染。该病主要造成蛋鸡产蛋量和蛋品质下降,引起肉鸡的增重和饲料转化率下降,雏鸡可由于呼吸道或肾脏感染而造成死亡。此外,IBV往往引起其他病原微生物的混合感染,从而加重了对鸡群的危害,给全球养禽业带来巨大经济损失。IBV病毒含有4种结构蛋白:纤突蛋白(Spike,S)、小膜蛋白(Small envelope,E)、膜蛋白(Membrane,M)和核蛋白(Nucleocapsid,N)。其中N蛋白是磷酸化蛋白质,可与病毒RNA结合,构成螺旋状核衣壳。N蛋白又是诱导机体免疫应答,尤其是细胞免疫应答的重要免疫原蛋白。因而N基因及其编码蛋白是IBV研究的一个热点。本研究以鸡传染性支气管炎病毒核蛋白作为研究的靶蛋白。利用鸡传染性支气管炎病毒中国分离株tl/CH/LDT3/03,经4次免疫BALB/c小鼠,无菌取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG1450进行化学融合。通过经典杂交瘤技术获得了4株杂交瘤细胞。以本研究表达的重组IBV N蛋白和全病毒作为抗原,采用间接ELISA和western blotting分析,证明4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)均能够特异地与tl/CH/LDT3/03全病毒和重组N蛋白反应,为抗传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03N蛋白的单克隆抗体,分别命名为6H3、5E12、2C4和6F9。其染色体数目分别为90、99、91和102条,单克隆抗体亚类鉴定结果为mAb 6H3、mAb 2C4属于IgG1、mAb 5E12属于IgM、mAb 6F9为IgG2b,轻链均为κ链。在此基础上,本研究对2株单克隆抗体6H3和6F9的抗原表位进行初步鉴定。首先将N基因分成相互重迭的8个片段(N1、N2、N、N4、N5、N1-1、N1-2、N1-3)克隆至pGEX-6p-1载体GST标签下游,并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,重组蛋白分别命名为GST-N1、GST-N2、GST-N3、GST-N4、GST-N5、GST-N1-1、GST-N1-2和GST-N1-3。经western blotting分析,mAb 6H3表位的初步定位在80-99aa。而mAb 6F9表位的初步定位在64-82aa。同时,选用不同致病型和组织嗜性的IBV中国分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ、CK/CH/LHN/00Ⅰ、CK/CH/LSD/05Ⅰ、CK/CH/LSC/99Ⅰ、CK/CH/LHLJ/04Ⅴ、CK/CH/LHB/08Ⅰ和CK/CH/LAH/08Ⅱ以及4株不同致病性的其他毒株IBN、M41、H120和T作为抗原进行了western blotting分析,结果显示mAb 6H3可与除CK/CH/LHB/08Ⅰ以外的其他IBV发生反应。推测这11个IBV分离株氨基端第80-99aa区域内含有相同的一个B细胞表位。而mAb 6F9则不与CK/CH/LAH/08Ⅱ和CK/CH/LHB/08Ⅰ这两个分离株发生反应。此外,本研究选择了mAb 6H3作为研究对象,构建了抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体(single chain variable fragment,scFv)。利用TRIzol法提取杂交瘤细胞株6H3的mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,利用重迭延伸PCR将重链和轻链通过linker连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。对表达产物应用ProBond~(TM)Purification System纯化系统进行蛋白纯化,将纯化后蛋白用6～0mol/L尿素梯度复性溶液对scFv变性蛋白进行复性。纯化复性后,用夹心ELISA和Western blotting测定scFv的活性,结果表明scFv不但可以与亲本病毒tl/CH/LDT3/03发生反应,而且可以与重组N蛋白发生特异性结合,这与它的亲本杂交瘤细胞株分泌的单抗的反应是一致的。该结果为IBV单链抗体作为治疗性生物制剂的研究提供了进一步研究的工具,同时对其他冠状病毒的相关研究具有借鉴意义。
吴此玲[8]2011年在《鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析》文中认为鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异对IB的免疫防控造成了很大的困难,而且引起的疫苗免疫失败的现象越来越多。许多学者认为大量变异株的出现与活毒疫苗的应用有关,但目前我国IBV地方流行株的基因序列还不够完备,分子生物学方面有待更深入研究。因此,对地方分离株的分离鉴定及遗传变异的研究显得尤为重要。本研究从陕西分离到的两毒株进行了M、N基因的克隆及遗传变异分析。主要获得以下结果:1.从临床疑似鸡传染性支气管炎疾病的发病鸡群中先后分离到2株病毒,经过接种鸡胚、血凝试验、鸡胚矮小试验及动物回归试验,通过鉴定,2毒株均为鸡传染性支气管炎病毒,而且具有很强的嗜肾性和致病力。2.参照GenBank中收录的IBV M基因序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV SX-H09株和SX-W09株的M基因,扩增产物克隆测序后,测序结果与H52、W118、Ark99等参考毒株进行序列分析。结果表明,SX-H09株M基因全长678 bp,编码225个氨基酸,而SX-W09株M基因全长670 bp,编码222个氨基酸,两毒株与参考毒株的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为86.5%～99.6%和84.5%～99.6%。两毒株都存在碱基的突变、插入和缺失。遗传进化树显示SX-H09株与DY07株亲缘关系较近,SX-W09株与其他毒株亲缘关系均较远。3.用RT-PCR方法扩增IBV SX-W09株的N基因并测序,与GenBank所收录IBV毒株的N基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,建立N基因系统发育进化树。结果表明, SX-W09株N基因全长1230 bp,编码一条由409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与Ark99、H120、Gray等毒株的相似性为86.5%～89.9%,氨基酸相似性为89.0%～94.1%。SX-W09株存在碱基的突变。SX-W09株与Ark99、H120、Gray等其他参考毒株的亲缘关系均较远。4.将IBV SX-W09株N基因PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体,转化BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测制备的抗体。结果表明,成功构建原核表达载体,ELISA检测多克隆抗体效价为1:12800,Western blot检测具有良好的反应性,可以特异性识别IBV N蛋白。本研究分离鉴定了2株IBV陕西地方流行毒株,通过对毒株M、N基因核苷酸序列分析、遗传进化关系分析以及N蛋白在原核系统的高效表达,为IBV的防治提供参考。
叶焕春[9]2010年在《鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析》文中指出鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。此病在世界各地均有发生,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可由于点突变和重组而发生变异,因此IBV的血清型较多,已达30余种之多。不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用,从而给本病的防治带来困难。我国目前虽然已广泛使用IB疫苗,但由于IBV的易变异型,IB仍然呈高度流行趋势,尤其是在已免疫鸡群中也常常爆发IB,造成严重的经济损失。因此,对IB的发生、流行和病原变异的分析和研究,将为该病的综合防控提供有用的参考依据。本研究对江苏地区疑似鸡传染性支气管炎的病料进行了实验室病毒分离和鉴定。结果表明,四株分离株均能引起胚体发育不良,个体小,头、爪合抱,呈蜷缩现象；其尿囊液不能凝集鸡红细胞,但经2%胰酶处理后能凝集鸡红细胞；在鸡胚内对NDV LaSota株有干扰作用；动物回归试验复制出的病例表现出的临床症状、病理变化与自然发病的病例相同。所以可初步断定所分离的四株病毒为鸡传染性支气管炎病毒。应用RT-PCR方法扩增出四株IBV分离株的S1基因和N基因,将其进行了克隆、序列测定及分析。构建了系统进化树,分析了四株IBV分离株与参考毒株之间的系统进化关系。四株IBV分离株S1基因的长度分别由1611、1611、1650、1641个核苷酸组成,分别编码537、537、550、547个氨基酸。四株分离株之间S1基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为80.0%～97.4%、82.9%～95.9%。分离株JS3、JS4与其它参考毒株同源性较低,在72.9%～81.8%之间,基因序列内有大量的碱基突变、插入和缺失。系统进化树分析表明,分离株JS1、JS2与呼吸型毒株归属于一个分支,分离株JS3、JS4与国内分离的肾型毒株归于一个分支。四株分离株的S蛋白裂解位点均为RRFRR,与标准呼吸型毒株裂解位点一致。四株IBV分离株N基因的长度均为1230bp,编码409个氨基酸。四株分离株之间N基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为86.7%～96.1%、88.0%～98.3%。N基因系统进化树也显示分离株JS1、JS2与JS3、JS4位于两个分支。N基因序列内没有碱基的插入与缺失,但是大量的点突变造成氨基酸的替代,氨基酸的替代也出现在N蛋白的叁个保守碱性氨基酸区内。以上分析结果表明,本实验分离的IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是IBV变异株产生的另一主要原因。本实验中分离株JS1、JS2属于呼吸型毒株；分离株JS3、JS4属于肾型毒株。本研究将IBV N基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-N,并转化至表达菌BL21 (DE3),通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,重组质粒得到高效表达。Western blot分析显示,N基因表达产物能够与IBV多抗血清IgG反应,具有较好的抗原性。
周生[10]2007年在《禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究》文中指出禽传染性支气管炎(IB)呈世界广泛流行，是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(IBV)很容易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护力弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了严重的经济损失。在前期工作基础上，本研究对IBV肾型分离株SAIBk株的全基因组和11株分离株的3′端非编码区进行了序列测定和分析，并进一步构建了SAIBk株S1、M、N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行表达研究，在此基础上构建了S1、M、N基因的真核表达质粒并对其免疫原性进行了比较研究，为从分子水平研究IBV的流行进化及研制预防和控制IB的DNA疫苗奠定基础。1．选择具有一定代表性的IBV致肾病变型分离株SAIBk株，采用RT-PCR方法将其基因组分19个片段进行了扩增、测序及分析。结果表明：SAIBk株能引起鸡胚矮化，形成侏儒胚；其病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后，在电镜下可观察到典型的冠状病毒粒子；SAIBk株基因组全长27520bp，核苷酸组成中A+T的含量占61.74％；具有典型的冠状病毒基因组结构，其528-20410位为RNA依赖的RNA聚合酶基因，编码两个多聚蛋白ORF1a和ORF1b，20361-27155位主要编码病毒的各种结构蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白；SAIBk株与Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因组序列的同源率介于85.6％-87.6％之间；不同区域的同源性比较结果表明，3′UTR和5′UTR是基因组中最为保守的区域，同源率介于90％-98％之间，而S1基因是基因组中变异最大的区域，同源率介于74.8％-83.2％之间。本试验在国内外首次对IBV肾型分离株的基因组全序列进行了测定，丰富了冠状病毒的生物信息数据库，为进一步研究该病的分子流行病学和DNA疫苗奠定了基础。2．选择11株IBV分离株，采用RT-PCR方法对其3′端非编码区进行了测序及分析。结果表明：11株分离株3′端非编码区的PCR扩增片断长度介于328bp—512bp之间；将11株分离株与Genbank上登录的15个毒株的序列进行比较分析，表明3′非编码区存在大量的碱基插入和缺失，不同毒株之间碱基数目最大相差208bp；根据不同毒株在3′非编码区片段的大小，可以将26个毒株分成4组；26株毒株3′非编码区的进化树分析结果与按照3′非编码区片段大小进行分组有较一致的结果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均属于第二组，基因Ⅲ型毒株属于第叁组，基因Ⅳ型毒株属于第四组，而第一组的毒株均为国外分离毒株。本试验通过测定11株IBV分离株3′端非编码区的序列，为IBV分离株的分子流行病学研究提供科学依据。3．构建S1、M和N基因的荧光融合表达质粒，转染Vero细胞后观察结构蛋白在细胞内的表达与分布。结果表明：酶切分析和测序结果证明构建了融合表达质粒pS1-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed；在S1、M、N结构蛋白上均未分析出有核定位信号；转染了pS1-EGFP、pS1-DsRed质粒的Vero细胞，细胞的胞浆和胞核区均显示出绿色荧光或红色荧光，荧光的强度随着转染时间的增加而增强；pM-EGFP、pM-DsRed质粒转染的Vero细胞，激发的绿色和红色荧光仅分布在胞浆区域，且分布不均匀，表明pM-EGFP、pM-DsRed质粒表达的M-EGFP和M-DsRed在胞浆中发生了聚集；pN-EGFP、pN-DsRed质粒表达的融合蛋白在胞浆区域或胞核区域发生了部分聚集。本试验首次构建了S1、M和N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行了表达研究，为进一步研制的IBV DNA疫苗提供了理论基础。4．选择高效的真核表达载体pcDNA3.1(+)，将分离株SAIBk株的S1、M、N基因分别插入其多克隆位点，构建真核表达质粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN，对构建的表达质粒进行酶切和测序鉴定，用脂质体转染Vero细胞，进行蛋白的表达和鉴定。结果表明：酶切和DNA测序证实重组质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN构建正确；通过RT-PCR、间接免疫荧光检测证实IBV的S1、M、N基因能在细胞中正确的转录和表达。本试验构建了S1、M和N基因的真核表达质粒，并在细胞中进行了表达检测，为进一步的DNA疫苗免疫试验提供了材料。5．将构建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒单独或按比例混合进行动物免疫试验。结果表明：雏鸡免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒后，均能产生特异性抗体，对强毒的攻击具有一定的保护力，其中pIBVM的保护率为37.5％；将pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒混合免疫所产生的抗体水平和对强毒攻击的保护力，均要优于单基因的效果；将叁基因混合的质粒以脂质体为佐剂进行免疫原性研究，在试验期间脂质体包裹DNA疫苗组与裸质粒疫苗组的抗体水平差异不显着，但前者的抗体水平一直要高于后者；脂质体包裹DNA疫苗组的外周血CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量要显着高于裸质粒疫苗组，两者差异显着(P＜0.05)或极显着(P＜0.01)；在攻毒保护率上，脂质体包裹DNA疫苗组的保护率为72.7％，要优于叁基因混合裸质粒DNA疫苗组的54.5％。本研究首次在国内外对M基因及S1、M、N基因混合DNA疫苗的免疫原性进行了比较研究，研制出脂质体包裹的叁基因混合DNA疫苗，对有效的预防和控制IB的流行具有重要的意义。
参考文献：
[1]. 传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA检测方法的研究[D]. 杨德全. 华中农业大学. 2008
[2]. 鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的序列分析与表达[D]. 高磊. 中国农业科学院. 2001
[3]. 鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株N基因的克隆与分子遗传变异研究[D]. 邓小敏. 西北农林科技大学. 2007
[4]. IBV 793/B株N基因的序列分析及地高辛标记探针、双重RT-PCR检测方法的建立与应用[D]. 孟凡磊. 山东农业大学. 2007
[5]. 传染性支气管炎病毒纤突蛋白、核蛋白基因的克隆、表达及其在抗体检测中的初步应用[D]. 李中华. 华中农业大学. 2006
[6]. 鸡传染性支气管炎病毒S1和NP基因的表达及NP-ELISA方法的建立[D]. 郝春丽. 河南农业大学. 2007
[7]. 鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究[D]. 徐佳. 中国农业科学院. 2009
[8]. 鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析[D]. 吴此玲. 西北农林科技大学. 2011
[9]. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析[D]. 叶焕春. 南京农业大学. 2010
[10]. 禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究[D]. 周生. 四川农业大学. 2007
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