王祥[1]2001年在《猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究》文中研究指明乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)，是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus，JEV)引起的人和动物共患的一种虫媒病毒性疾病。本病对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一；对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是本病毒的扩增宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失，而且也是防止人患乙脑的重要措施。本研究着眼于猪乙脑快速诊断方法和疫苗的开发利用，主要工作包括： 1．减毒活疫苗的研究 选用原代金黄地鼠肾(PHK)细胞作为培养基质，JEV SA14-14-2毒株为生产用疫苗毒株进行疫苗研制。测定表明SA14-14-2毒株能在PHK细胞上进行稳定增殖，且有较高的滴度(≥10~(-7.2TCID_(50)／1.0mL)。采用蔗糖明胶作为冻干保护剂，冻干后毒价≥10~(-6.8)TCID_(50)／1.0mL。 疫苗原液接种血清学阴性小白鼠和妊娠母猪，小鼠无死亡和异常反应，怀孕母猪无流产和产死胎、木乃伊胎，均正常分娩，胎儿发育正常，说明疫苗是安全的。 免疫原性测定说明，该疫苗能引起小鼠产生特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答；40日龄仔猪免疫后可产生JEV特异性抗体。 疫苗在4-8℃和．20℃可保存一年半。 综上，该疫苗安全，免疫原性好，且便于大规模生产。 2．滴金免疫法(DIGFA)的建立与应用 将浓缩的JEV抗原吸附到硝酸纤维素膜上，加入JEV阳性、阴性血清和红色胶体金颗粒标记的兔抗猪IgG探针，摸索最佳工作条件，结果表明硝酸纤维素膜上最佳抗原吸附浓度为0.147mg/mL，最佳探针浓度为1∶20，最佳封闭浓度为5％BSA。用该法与HI试验对比检测54份送检猪血清，两法总符合率为81.4％，阳性符合率为71.4％，阴性符合率为65％，其敏感性比HI高，整个过程可在数分钟内完成。 因此，DIGFA具有快速、简便、敏感、特异的特点，可用于实验室和现场JEV抗体的检测。 3．prM、E和NS1基因片段的克隆表达与基因免疫 从自行研制的乙脑减毒活疫苗中提取JEV基因组RNA，合成3对引物，以一步法RT-PCR技术扩增获得了3个主要免疫原性基因片段的编码序列，大小分别为prM(558bp)、E(615bp)、NS1(1146bp)，其中prM和NS1为全基因，E为前1／3(N端)片段。以pMD18-T为克隆载体，得到3个克隆质粒pTprM、pTE、pTNS1。构建3个基因的原核表达载体，实现了NS1基因在BL21(DE3)菌株中的高效表达，Western-blot检测表达的NS1蛋白具有生物活性。 以质粒peDNA3 .1为载体，构建3个基因的核酸疫苗质粒，均实现了在真核细胞BHK一21中的表达，且表达产物具有生物活性。核酸疫苗质粒免疫的小鼠产生了特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应。从效果上看，叁基因联合免疫最好，单基因以NSI为好。4. TK-/gG很51十重组病毒的构建 设计1对引物从p翎S1上亚克隆Nsl基因，将NSI基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK~NSI。将pUSK一S1与伪狂犬病毒Ea株TK一G，/ Lacz+突变株共转染真核细胞IBRS一2，通过空斑纯化得到了乙脑病毒NSI基因重组伪狂犬病毒TK一G水51+。经检测，重组病毒能表达具有生物活性的NSI蛋白。 该重组病毒可作为猪乙脑和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。
郭龙飞[2]2014年在《猪2型圆环病毒病—猪细小病毒病—猪乙型脑炎叁联灭活疫苗的研制及对猪的免疫效力试验》文中研究说明猪圆环病毒2型（PCV2）主要引起猪多系统功能衰竭性疾病（PMWS），猪感染该病毒后产生免疫抑制，增加了对多种病原体的易感性。猪细小病毒（PPV）和猪流行性乙型脑炎脑病毒（JEV）均可以引发母猪的繁殖障碍及公猪的种用性能下降等疾病。PCV2与PPV、JEV，给养猪业带来了极大的经济损失，因此种猪均需要免疫接种这叁种疫苗。但是目前国内外市场上还没有上述疾病的叁联疫苗，给猪病免疫接种带来极大不便。为了有效地防控这叁种疾病，简化免疫程序、减少免疫应激、达到一针预防多病的目的，本研究利用实验室自行分离鉴定的XXX株PCV2、XXX株PPV和XXX株JEV，研制出猪2型圆环病毒病-猪细小病毒病-猪乙型脑炎叁联灭活疫苗。具体研究内容如下：1、叁联灭活疫苗的制备通过在PK-15细胞和BHK-21细胞分别上传代增殖，获得荧光定量拷贝数为XXX的PCV2病毒液，HA毒价为XXX的PPV病毒液和TCID50为XXX的JEV病毒液。对病毒液XXX倍透析浓缩、纯化，等体积混合制备疫苗的水相，加入XXX倍体积油相进行乳化，制备了PCV2-PPV-JEV叁联灭活疫苗；对浓缩的上述叁种病毒液XXX倍稀释，两两等体积混合，使用同样方法分别制备3种二联灭活疫苗；对浓缩的病毒液XXX倍稀释，制备3种灭活单苗。上述叁种病毒在等体积的各种灭活疫苗中同种抗原的含量相同，为单苗、二联和叁联灭活疫苗的不同免疫剂量和免疫效果比较奠定基础。2、灭活疫苗的检验按照国家兽药典对灭活疫苗做物理性状及无菌检验结果均符合要求。将灭活疫苗分别对KM小鼠、豚鼠、仔猪、后备母猪和妊娠母猪做了安全性试验。结果表明，受试动物精神、食欲正常，注射部位没有局部不良反应，妊娠母猪分娩率为100%，平均产仔11.4头，新生仔猪中弱仔比例为1.2%，无死胎、木乃伊胎。灭活疫苗对实验动物和本动物安全性良好，对妊娠母猪的繁殖性能和新生仔猪健康状况均无影响，表明本研究灭活疫苗安全可靠。3、灭活疫苗对35日龄仔猪的免疫效力检验本研究中二联、叁联灭活疫苗与的相应自制灭活单苗及对照商品单苗的免疫效力比较显示，多联灭活疫苗的不同剂量组免疫效果均高于商品灭活/弱毒疫苗及生理盐水对照组，且在低剂量（1mL/头）免疫时即可产生较高水平的抗体，同等免疫剂量时，的二联和叁联灭活疫苗诱导的抗体水平高于各的灭活疫苗，甚至个别联苗的低剂量免疫组产生的抗体水平也稍高于的灭活疫苗。7种灭活疫苗诱导产生的抗体均能维持10周以上。本研究为猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪乙型脑炎病的联合免疫提供了可能。而且本研究证实了的叁联灭活疫苗使用较低剂量（1mL/头）免疫猪后即可诱导产生相当于或高于商品疫苗的抗体水平。
李自力[3]2004年在《猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究》文中研究说明乙型脑炎病毒和伪狂犬病病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，同时乙型脑炎是一种人畜共患病，猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主，因此控制猪的乙型脑炎具有十分重要的意义。而预防和控制这两种传染病最有效的措施就是免疫接种。目前尚无商品化的猪用乙型脑炎疫苗，主要采用人用的两种乙型脑炎疫苗，而这些常规疫苗都存在一定的缺点。鉴于此，本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因PrM、PrM-E和NS1，构建了叁株表达猪乙型脑炎病毒主要免疫原性基因的重组伪狂犬病病毒，即TK~-／gG~-／PrM~+、TK~-／gG~-／PrM-E~+和TK~-／gG~-／PrM-E-NS1~+，在此基础上研制了猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗，并进行了动物试验。主要研究工作和结果如下： 1．乙型脑炎病毒PrM-E基因的克隆、测序与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列，设计了一对引物，以RT-PCR方法扩增了其主要免疫原性基因PrM-E，并克隆至pMD18-T载体中，命名为pTPrM-E，序列测定结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较，PrM的同源性均为100％，与SA14-14-2疫苗株比较，E基因发生了4个核苷酸的改变，即2181a-g，2317a-g，2441a-t，2443g-a，其中2317a-g为回复突变，共导致了3个氨基酸的改变，即E402 T-A，E447 D-G(为回复突变)和E489 G-D，而E488为无义突变，但未发生与毒力相关位点的突变。 2．乙型脑炎病毒主要免疫原性基因重组伪狂犬病病毒的构建 采用3对引物(各引入一个酶切位点)分别从pTPrM-E和pTNS1扩增PrM、PrM-E和NS1基因，双酶切后分别将PrM、PrM-E和PrM-E-NS1基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体PgG-uni中，分别得到叁个重组转移载体，命名为PgG-PrM、PgG-PrM-E、PgG-PrM-E-NS1。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK~-／gG~-／LacZ~+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞，形成病变的转染物经空斑筛选纯化，PCR扩增和Southern印迹等鉴定，获得了叁株纯化的重组病毒，分别命名为TK~-／gG~-／PrM~+、TK~-／gG~-／PrM-E~+和TK~-／gG~-／PrM-E-NS1~+。重组病毒在IBRS-2、PK-15和CEF细胞上增殖滴度依次降低，Western印迹表明JEV PrM、E和NS1基因在重组病毒中均获得了表达。表达的蛋白质大小分别为19KD、53KD和46KD。重组病毒与载体病毒在IBRS-2细胞上的增殖比较试验表明外源基因的插入不影响重组伪狂犬病病毒在细胞上的增殖滴度。 3．叁株重组伪狂犬病病毒的免疫原性研究 利用已构建的叁株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上培养增殖后制备成冻干的猪乙华中农业大学博十学位论文型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗。动物实验表明,其对小鼠和猪是安全的,而且免疫的Balb/c小鼠和断奶仔猪均产生了针对PRV和JEV的特异性免疫应答。重组病毒TK,/gG’用rM一E+和TK一G护rM一E一Nsl+产生的JEV抗体和特异性cTL活性基本一致,均略低于JEv弱毒疫苗株,而TK一/gG护rM+产生的特异性免疫应答稍差些。统计分析表明所有重组病毒产生的CTL活性与阴性对照相比,差异极显着(P< 0.01)。叁株重组病毒和载体病毒免疫猪在首免后8周所产生的PRV抗体水平差异不显着印>0 .05)。结果表明重组病毒TK’/gG一用rM一E+和TK一/gG护rM一E一NSI+可以作为预防猪乙型脑炎和伪狂犬病的二价基因工程疫苗。关键词:乙型脑炎病毒:伪狂犬病病毒;基因克隆;重组病毒载体疫苗
刘维婷[4]2013年在《重组猪源OAS1抗日本脑炎病毒的特性研究》文中进行了进一步梳理2'-5’寡腺苷合成酶(2'-5'oligoadenylate synthetases,OAS)是哺乳动物先天性免疫系统的重要成分,OAS蛋白传统上认为是细胞内的抗病毒蛋白。它的本质是一种干扰素诱导的抗病毒蛋白。细胞内的OAS/RNaseL信号通路在宿主控制黄病毒、呼肠孤病毒和脑心肌炎病毒的先天性免疫反应中起重要作用。此外,近年来已有研究证实OAS存在不依赖于RNaseL途径的抗病毒作用。OAS蛋白能直接抑制病毒增殖而不需要已知的抗病毒信号通道的激活。小鼠、马和人中均发现OAS基因是抗黄病毒感染的生物标志基因,猪源与人源OAS1蛋白的氨基酸同源性为73%,具有相似的酶学特征,因此进一步研究猪是否也存在抗黄病毒(JEV)感染的生物标记基因以及OAS基因是否就是猪感染JEV致病的风险标志基因是必要的。鉴于日本乙型脑炎在中国的严重危害及其传播范围广泛；JEV疾病给养猪业带来了严重的经济损失,以及猪作为中间宿主在JEV传播过程中的重要作用,研究猪OAS在抗JEV感染中的作用及其分子机理具有重要的意义。本研究设计方案主要包括以下几个内容：1.重组OAS1蛋白的可溶性表达与纯化根据已发表的猪源OAS1的基因序列设计引物,利用RT-PCR的方法从PK细胞中扩增出猪源OAS1基因,其长度为1050bp,并将其与pMD18-T simple载体进行连接和测序鉴定。将鉴定正确的目的基因与pET28a(+)载体相连,构建原核表达的重组质粒,将其转化到大肠杆菌Rosetta2(DE3)中,经0.1mmol/LIPTG低温过夜诱导表达,SDS-PAGE结果显示得到了大量溶解性好的猪源OAS1蛋白,蛋白分子量大小约为40KDa.通过载体上的His标签及利用亲和层析的原理,用镍柱对表达的蛋白进行纯化。结果得到稳定且较为纯净的目的蛋白,SDS-PAGE鉴定结果表明,蛋白纯度达95%以上。用纯化的目的蛋白免疫小鼠制备特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与猪源OAS1蛋白相互作用后有明显的特异性条带。该研究为猪源OAS1蛋白抗病毒的效果鉴定与机制研究奠定了基础。2.重组OAS1蛋白抗病毒特性的研究分析纯化原核表达猪源OAS1蛋白,用脱盐柱对蛋白进行脱盐处理,并用MTT比色法检测外源蛋白对细胞存活和生长的影响。结果表明,经脱盐处理的蛋白在低浓度条件下(200μg/mL),对细胞的生长和活性几乎没有影响。通过Real Time PCR的方法检测猪源OAS1蛋白在PK细胞系对伪狂犬病毒的抗病毒效果,以及在Marc-145细胞系对猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)和在BHK-21细胞系上对日本乙型脑炎病毒(JEV)抑制病毒感染细胞的活性,结果表明外源表达的猪源OAS1蛋白具有广谱的抗病毒活性,对DNA病毒和RNA病毒均有抑制病毒感染细胞的活性。用蛋白预处理细胞能显着降低细胞内病毒的DNA或mRNA水平。且抑制病毒感染细胞的效果呈剂量依赖关系。就我们检测结果而言,尤其是蛋白在BHK-21细胞上抑制JEV感染细胞效果最为显着。当蛋白浓度为200μg/mL,对照组细胞中JEV的mRNA水平是蛋白预处理组中JEV的mRNA水平的8.04倍。并在病毒感染细胞的不同阶段用猪源OAS1蛋白处理细胞,通过Real Time PCR的方法和空斑减少试验来检测猪源OAS1蛋白抑制病毒感染细胞的最佳作用时间,结果发现,蛋白浓度在100μg/mL预处理细胞能显着抑制病毒感染细胞,并抑制病毒在细胞内复制,降低子代病毒的数量,而蛋白对病毒本身几乎没有作用,对病毒无钝化作用；用蛋白处理接毒后的感染细胞时,发现猪源OAS1蛋白(100μg/mL)仍有一定的抑制病毒感染细胞的效力,但是效果不明显。因此,猪源OAS1蛋白在抑制病毒感染细胞时主要是通过用它来预处理细胞,激活下游的信号通路,使得病毒无法在细胞内增殖,而蛋白对病毒本身几乎没有影响,对已感染病毒的细胞抗病毒效果不佳。这为我们进一步研究猪源OAS蛋白体外抗病毒机制奠定了基础。3.重组OAS1蛋白抗日本脑炎病毒的作用机制研究根据外源表达猪源OAS1蛋白在体外抗病毒谱和抗病毒最佳作用时机的分析,我们对其抗JEV作用机制展开了进一步讨论。利用猪源OAS1蛋白预处理细胞,通过控制病毒接种量和病毒接种细胞后的作用时间,分别在蛋白,基因和病毒滴度水平上检测猪源OAS1蛋白的抗病毒感染细胞的效果。结果表明：猪源OAS1蛋白能够有效发挥其抗病毒感染细胞的作用,主要是通过其抑制病毒在细胞内的复制,即使是在较高的蛋白浓度下(200μg/mL),猪源OAS1蛋白对病毒感染细胞的感作阶段几乎也没有影响,不影响病毒吸附细胞,不能有效控制病毒吸附细胞,阻止病毒入胞。蛋白预处理细胞,接毒后6h细胞内病毒的mRNA水平和滴度均略有降低。接毒后12h细胞培养的上清中病毒滴度有明显的降低,细胞内病毒的mRNA水平也显着有降低。蛋白处理组病毒蛋白含量与阳性对照相比显着下降。接毒后24h,猪源OAS1蛋白能够极显着抑制病毒在细胞内的复制。无论是细胞培养的上清中病毒滴度,还是细胞内病毒的mRNA水平都显着低于阳性对照组。蛋白处理组病毒蛋白含量与阳性对照相比亦有显着下降,而且当蛋白浓度为200μg/mL时,依然检测不到病毒蛋白的存在。猪源OAS1蛋白的D74和D76氨基酸残基是OAS/RNaseL途径主要的依赖性氨基酸残基,它们决定了RNaseL的催化活性。本研究通过Quick change PCR定点突变技术使猪源OAS1蛋白的D74和D76氨基酸残基发生改变,为研究猪源OAS1蛋白是否存在多个分子信号途径奠定了基础。结果表明,突变的猪源OAS1蛋白仍然具有抗病毒活性,在抗病毒感染的效力上,比亲本猪源OAS1蛋白略低,而且也是剂量依赖型的。由此看来,猪源OAS1蛋白在发挥抗病毒功能时存在多个分子信号途径。
参考文献：
[1]. 猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究[D]. 王祥. 华中农业大学. 2001
[2]. 猪2型圆环病毒病—猪细小病毒病—猪乙型脑炎叁联灭活疫苗的研制及对猪的免疫效力试验[D]. 郭龙飞. 河南农业大学. 2014
[3]. 猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D]. 李自力. 华中农业大学. 2004
[4]. 重组猪源OAS1抗日本脑炎病毒的特性研究[D]. 刘维婷. 南京农业大学. 2013
标签：畜牧与动物医学论文; 灭活疫苗论文; 猪伪狂犬病论文; 细胞免疫论文; 基因合成论文; 狂犬疫苗论文; 重组蛋白论文; 传染病论文; 生物技术论文;