（1湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室 湖北 武汉 430064）
（2武汉生物工程学院 湖北 武汉 430415）
（3湖北三峡职业技术学院 湖北 宜昌 443000）
【摘要】 观察抑制Ras/Raf/Mek/Erk信号通路对胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响。将胶质瘤细胞悬液注射至大鼠颅脑造模，胎鼠神经干细胞植入模型内治疗。发现瘤体组织Raf-1、Erk及抑凋亡蛋白Bcl-2表达增高，移植后显著下降，而Caspase-3在移植前后分别呈低表达及显著升高。可见神经干细胞移植可通过抑制Ras/Raf/Mek/Erk信号通路，促进胶质瘤细胞凋亡。
【关键词】 信号通路；神经干细胞；胶质瘤细胞；凋亡
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）34-0102-02
脑胶质瘤起源于神经外胚层，是颅内高度异质性肿瘤[1]。神经干细胞具有多向分化潜能，可使肿瘤细胞的生长、增殖局限化[2]，但机制尚不清楚。
本实验观察神经干细胞移植后胶质瘤组织Ras/Raf/Mek/Erk信号通路中相关信号分子表达的变化，探讨神经干细胞移植、Ras/Raf/Mek/Erk信号通路及胶质瘤细胞凋亡三者之间的内在关系。
1.材料和方法
1.1 清洁级4～6月龄成年雄性SD大鼠30只，(120±20)g。随机分3组，正常组、模型组与干细胞移植组。
制备脑胶质瘤模型：含10%小牛血清的DMEM培养基中培养大鼠神经胶质母细胞瘤细胞C6制成细胞悬液，两组大鼠腹腔注射麻醉，切开头皮，暴露颅骨钻孔[3]，骨孔内注射含3×106个C6胶质瘤细胞的细胞悬液50μL，留置5分钟，缝合头皮，肌注青霉素。造模后1周MRI检测两组大鼠造模情况。
1.2 孕14周的Wistar孕鼠1只制备胎鼠神经干细胞
分离孕鼠胚胎海马组织并剪碎，加入DMEM/F12消化至呈单细胞悬液，分离、溶解、培养，调整细胞浓度。CO2常规培养传代，标记后鉴定。
1.3 神经干细胞移植
干细胞移植组大鼠麻醉后俯卧位固定，Bregma点前1毫米，旁开2毫米[4]，距颅骨表面5毫米穿刺。注射1×105/μL浓度的胎鼠神经干细胞悬液5μL，骨蜡封缝合伤口。模型组向脑组织注射等量免疫抑制剂环孢素及生理盐水。正常组不作任何处理。
1.4 Western blot检测肿瘤组织Raf-1、Erk、Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达：免疫组化染色观察其表达：
1.5 统计学分析
SPSS13对所有数据进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 脑胶质瘤模型大鼠脑组织的影像学表现
造模1周后MRI检查显示所有脑胶质瘤大鼠造模成功。肿瘤呈长T1T2信号，病灶边界欠清晰，内部信号不均，周围轻度水肿，中线结构轻度移位，脑室系统受压变形。
2.2 神经干细胞的形态及鉴定
神经干细胞接种后悬浮生长，24小时开始贴壁，8天后传代即形成大小均一圆形细胞球，悬浮生长。免疫荧光染色见Nestin阳性、GFAP阳性，证明用于移植的细胞具神经干细胞特性和多向分化潜能。
2.3 western blot检测相关信号因子蛋白表达
移植后模型组肿瘤组织Raf-1、Erk、Bcl-2蛋白表达显著增高(P＜0.05)，Caspase-3蛋白表达显著降低(P＜0.05)；与之相较，移植组各项指标表达显著降低(P＜0.05)，而Caspase-3蛋白表达显著升高(P＜0.05)，见下图及表。
表 移植后脑胶质瘤模型大鼠肿瘤组织相关因子的蛋白表达
3.讨论
脑胶质瘤的发生、发展及恶性生物学特征与肿瘤细胞内的异常信号转导网络有关[5]。
激活Raf/Mek/Erk信号通路能引起蛋白激酶级联反应，将细胞外信号传入细胞内，调控细胞生长和分化，其失调对肿瘤发生、发展具有重要意义，是影响胶质瘤异常生物学特性的信号网络中重要的通路之一[6]。
神经干细胞是具有高度自我更新能力，可通过不对等分裂方式产生神经组织的各类细胞，其分化调控机制的研究对于其治疗神经系统退行性疾病及功能修复具有重大意义[7]。本研究中干细胞移植组的Raf-1、Erk阳性表达率较模型组显著降低；另外，移植神经干细胞后，Raf-1、Erk蛋白表达也显著降低。由此推测，神经干细胞移植可能抑制Ras/Raf/Mek/Erk信号通路的异常激活，从而抑制胶质瘤的增长与发展，与前期研究结果一致。
Bcl-2蛋白家族是参与凋亡蛋白激活的重要调节分子，在抑制肿瘤细胞凋亡过程中起着主要作用，移植神经干细胞后大鼠Bcl-2阳性表达率显著降低，可推测，神经干细胞移植下调了Bcl-2的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡。
Caspase与细胞凋亡联系紧密，各种Caspase层层激活，最终引发细胞凋亡。实验发现，干细胞移植组的Caspase-3阳性表达率较模型组显著升高，Caspase-3蛋白表达显著增强，由此说明神经干细胞移植会增强Caspase-3活性，促进肿瘤细胞的凋亡。
【参考文献】
[1]张仲，苏宁，王忠.利用组织芯片技术研究Survivin、Bcl-2在人脑胶质瘤中的表达[N].内蒙古民族大学学报.2009;15(5):18-20.
[2]华咏，徐荣，韩俊毅，等.细胞周期和bcl-2、bax表达与脑胶质瘤病理分级的相关性研究[J].Tumor，2009，6(29):578-582.
[3]李承晏，李涛，李玲莉，等.鼠脑胶质瘤模型制作方法的改良[J].肿瘤防治研究，2001;28(6):234-237.
[4]李承晏，李涛，李玲莉，等.鼠脑胶质瘤模型制作方法的改良[J].肿瘤防治研究，2001，28(6):234-237.
[5]包翠芬，刘霞，魏嘉，等.胚胎小鼠大脑c-junN-末端激酶表达的定量分析[J].数理医药学杂志.2009;22(2):152-153.
[6]李国生，张道荣，刘冬，等.p34cdc2在非小细胞肺癌中的表达及意义[N].中国医科大学学报.2002;31(2):88-92.
[7] Xuan YH,lin ZH.Expression of Indian Hedgehog signaling molecules in breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol.2009;135(2):235-40.
论文作者:林郑云1，2,陈圆圆1，2,周黎1,欧阳艳3,毕延震
论文发表刊物:《医药前沿》2017年11月第34期
论文发表时间:2018/1/6
标签：干细胞论文; 细胞论文; 神经论文; 胶质瘤论文; 肿瘤论文; 信号论文; 蛋白论文; 《医药前沿》2017年11月第34期论文;