滨州医学院人体解剖学教研室 阚氏海摘要 目的 ：探讨二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对细胞因子信号转导抑制分子3（SOCS-3）在重症急性胰腺炎（SAP）肺损伤模型大鼠肺组织中的表达变化及作用。方法：将SD大鼠随机分为对照组、SAP组和PDTC组。建模后测定大鼠血清中IL-6、IL-18表达水平，取大鼠胰、肺组织行病理学观察，WB检测肺组织中SOCS-3表达情况。 结果 ：对照组无明显病理变化，肺组织内仅极少量SOCS-3表达。SAP组IL-6、IL-18表达水平显著上调，肺组织SOCS-3表达明显升高。PDTC组IL-6、IL-18表达下调，肺组织SOCS-3表达减少，但仍高于对照组。结论： SAP肺损伤的炎症反应可诱导SOCS-3在肺组织中表达。PDTC能显著缓解SAP肺损伤的病理症状，其机制可能是通过抑制SOCS-3的表达从而减轻炎症反应。
关键词 重症急性胰腺炎；SOCS-3；PDTC；肺损伤；大鼠
[中图分类号]R657.51文献标识码]A [文章编号]1439-3768-(2019)-06-ZM
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）起病急，进展迅速，易致多器官功能衰竭（multiple organ failure，MODS），病死率高达17%，其中以并发肺损伤为早期死亡的首要原因[1-2]。目前研究认为细胞因子信号转导抑制分子基因的表达在SAP病程进展中起着重要作用[3]。细胞因子信号转导抑制分子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS-3）可通过JAK/STAT信号通路特异性抑制炎症反应，但其在SAP肺损伤中的表达及作用尚未明确[4-5]。二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）具有抗肿瘤、抗菌的作用，是一种强抗氧化剂，对SAP肺损伤的临床治疗效果有非常重要的意义[6]。本研究旨在通过建立SD大鼠SAP及PDTC预处理组模型，探讨SAP肺损伤时SOCS-3的调节作用和PDTC对SOCS-3表达的影响，并为临床中SAP肺损伤所致的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）提供新的治疗思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
健康SD大鼠（山东济南朋悦实验动物繁育有限公司）；牛磺胆酸钠和PDTC（北京索莱宝生物科技有限公司）；兔抗大鼠SOCS3单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）；兔抗大鼠β-actin抗体和GAPDH标记的山羊抗兔IgG（武汉博士德生物有限公司）等。
1.2 动物分组及模型制备
健康SD大鼠45只，体重250～300 g，随机分为对照组、SAP组与PDTC预处理组（每组n=15），各组分为3、6、12h 3个亚组。
大鼠术前18h禁食不禁水，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.3ml/100g），固定四肢，备皮，常规消毒，上腹部正中切口入腹，牵出十二指肠及胰腺，动脉夹夹闭远端胆总管，用穿刺针逆行刺入胰胆管末端约1cm，紧捏穿刺处，缓慢推注5%牛磺胆酸钠（剂量0.1ml/100g,注射速度0.1ml/min），注射完成后，拔除针头，紧捏十二指肠，保持5min，防止牛磺胆酸钠逆流，打开动脉夹，还纳胰腺，逐层关腹，背部皮下注射生理盐水5ml补液。PDTC预处理组：在建立SAP模型前1h腹腔内注射PDTC（100mg/kg）,手术及处理方法同SAP组。对照组：大鼠行假手术，不注射，翻动及轻触胰腺3次。
1.3 样本收集与保存
各组大鼠造模成功后分别于3h、6h、12h乙醚吸入麻醉，打开胸腹腔肉眼观察胰、肺组织的病理变化及胸水、腹水情况。经左心室抽血约3～5ml，静置10min，4℃ 4 000 r/min离心5min，提取上清液，-20℃保存。切取肺组织约100 mg，置于液氮内过夜后-80℃冻存。剪开右心耳，使用4%多聚甲醛灌注固定，取胰、肺组织行石蜡包埋。
1.4 病理切片观察
常规H-E病理切片。
1.5 血清学检测
采用Olympus AU5400 全自动血生化分析仪检测血清淀粉酶及血清脂肪酶水平。
1.6 血清IL-6、IL-18含量检测
采用酶联免疫吸附法（ELISA）对各组大鼠血清中IL-6、IL-18的含量进行检测，具体步骤严格按照试剂盒使用说明书操作。
1.7 Western blotting检测
从液氮内取肺组织，PBS液冲洗3遍，用RIPA裂解液裂解后冰浴下玻璃匀浆器中匀浆，4℃ 10 000r/min 离心15min，提取总蛋白，-70℃冻存。每孔加样总蛋白50 ug，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，将蛋白转移至PVDF膜。室温下用含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液将PVDF膜封闭1h，加入兔抗大鼠SOCS-3单克隆抗体（1:1000）与兔抗大鼠β-actin抗体（1:1000），4℃过夜。室温下取出PVDF膜，TBST漂洗3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育2h。采用ECL试剂盒显影，Image-Pro 7.0 Plus图像分析系统特异性显示SOCS-3条带,测定内对照β-actin的光密度值。
1.8 统计学处理
应用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据结果以( ±s)表示，组间差异显著性比较采用单因素方差分析，相关性采用线性分析，P＜0.05差异显著。
2 结果
2.1 病理组织学改变
大体观察：对照组大鼠胰、肺组织未见明显病理改变。SAP组大鼠胰腺组织充血坏死；肺水肿明显，肺表面有散在出血点，部分大鼠有少量胸水，以上表现随病程进展加重，12h组偶见局部肺不张。PDTC组较SAP组病理改变均有不同程度的减轻。
光镜观察：对照组大鼠胰、肺组织结构清晰完整，间质无渗出（图1，4）。SAP组大鼠可见明显的肺泡和腺泡细胞肿胀及间质水肿，间质内有红细胞及炎性细胞渗出,可观察到肺泡壁破裂或塌陷实变（图2,5）.PDTC组损伤程度均较同时间段SAP组明显降低（图3，6）。
2.2 血清淀粉酶与脂肪酶变化
SAP组大鼠各组血清淀粉酶与血清脂肪酶表达均高于同时间段对照组（P＜0.05），且6h可达到峰值，其后随病程发展可发生降低，但仍处于高水平。PDTC组大鼠的表达均明显高于对照组，但低于SAP组（P＜0.05）（表1,2）。
表1 各组大鼠不同时间血清淀粉酶含量比较( ±s)
Group 3h(u/L) 6h(u/L) 12h(u/L) Control 1193.02±49.32 1886.71±157.74 2193.25±189.13 SAP 8162.44±613.81D 20873.09±1936.54D 14371.62±969.20D PDTC 4397.51±318.67D# 5531.40±368.39D# 7570.93±447.91D# DP＜0.05 vs Control group; #P＜0.05 vs SAP group
表2 各组大鼠不同时间血清脂肪酶含量比较( ±s)
Group 3h(u/L) 6h(u/L) 12h(u/L) Control 8.14±0.79 7.75±0.62 11.02±1.13 SAP 1795.33±146.28D 2208.49±177.53D 847.18±82.82D PDTC 716.24±69.95D# 791.56±72.70D# 689.38±65.45D# DP＜0.05 vs Control group; #P＜0.05 vs SAP group
2.3 血清IL-6、IL-18含量变化
SAP组大鼠血清中IL-6、IL-18表达均明显高于对照组，且各时间段有明显差异（P＜0.05）。PDTC组大鼠的表达高于对照组而低于SAP组，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。
表3 各组大鼠不同时间血清IL-6、IL-18含量比较( ±s)
Group IL-6(pg/ml) IL-18(pg/ml) Control 30.32±4.13 11.93±2.58 SAP 3h 61.38±5.39D 172.56±13.52D SAP 6h 118.59±14.64D 317.47±19.26D SAP 12h 327.47±15.63D 479.21±23.75D PDTC 3h 43.75±3.64D# 125.63±11.73D# PDTC 6h 92.84±3.73D# 213.29±17.35D# PDTC 12h 263.81±12.94D# 319.55±21.60D# DP＜0.05 vs Control group; #P＜0.05 vs SAP group
2.4 肺组织SOCS-3表达情况
WB结果表明，对照组大鼠肺组织中有少量SOCS-3表达。SAP组大鼠肺组织中SOCS-3的表达均明显强于对照组（P＜0.05），且随病程进展而增强，SAP 12h组表达最强。PDTC组大鼠肺组织中SOCS-3的表达高于对照组，但低于SAP组同时间段的表达情况（P＜0.05）（图7,8）。
3 讨论
SOCS-3是一种在JAK/STAT信号通路中通过负反馈调节表达特异性抑炎作用的因子，可通过竞争性地阻碍JAK与底物结合和转录因子STAT活化，以及通过泛素化降解SOCS-3的结合蛋白来阻断信号在细胞因子中的传递，从而抑制炎症反应[7]。大鼠血清中IL-6、IL-18的含量水平对反映SAP炎症程度有良好的代表性[8]。本研究中显示，IL-6、IL-18炎症因子在SAP组大鼠中均随病程高度表达，同时作为SAP敏感指标的血清淀粉酶与血清脂肪酶呈先升后降的变化趋势，6h到达高峰，与镜下观察到的胰、肺组织的病理变化一致。在大鼠SAP模型中可观察到SOCS-3的明显激活，且随病程的发展逐渐增多，表明随SAP炎症反应的加重，SOCS-3的表达也随之增强，从而抑制了炎症反应。
PDTC可通过在细胞内发生去乙酰化生成半胱氨酸的反应，进而产生抗氧化作用[9]。同时研究表明PDTC能够选择性地抑制NF-κB的活化，减少炎症因子的释放，抑制炎症反应的发生发展，从而减轻对胰、肺组织的损伤[10]。目前，有关PDTC对SAP肺损伤中SOCS-3表达影响的研究尚未见报道。本研究通过设立PDTC预处理的SAP模型组，检测肺组织中SOCS-3的表达，以进一步探讨PDTC在大鼠SAP肺损伤中对SOCS-3表达影响。结果显示PDTC预处理组大鼠胰、肺组织的病理情况均有所减轻，血清学检测指标较SAP组大鼠均明显降低。且SOCS-3表达较SAP组有下调趋势。由此可认为，在SAP肺损伤的保护机制中PDTC可能是通过影响SOCS-3的表达来负反馈调节JAK/STAT信号通路，缓解炎性症状。
综上所述，阻碍SOCS-3的释放，抑制炎症反应对治疗SAP肺损伤至关重要。PDTC可降低SOCS-3的表达，减轻炎症反应，进一步改善胰、肺组织的损伤情况。因此，深入研究SAP肺损伤中PDTC对SOCS-3影响的作用机制，进一步证实理论基础，可为其临床治疗提供重要的新思路。
参考文献
[1] Gasparovic'V, Dakovic'K, Gornik I, et al. Severe acute pancreatitis as a part of multiple dysfunction syndrome[J]. Coll Antropol. 2014; 38(1): 125-128.
[2] Garip G, Sarandol E, Kaya E. Effects of disease severity and necrosis on pancreatic dysfunction after acute pancreatitis[J]. World J Gastroenterol. 2013; 19(44): 8065-8070.
[3] 李敏利, 朱人敏, 张晓华, 等. JAK/STAT信号通路在胰弹性蛋白酶诱导大鼠 Kupffer细胞分泌IL-18中的作用[J]. 世界华人消化杂志. 2009; 17: 877-881.
[4]Kershaw N.J, Babon J.J, Murphy JM, et al. SOCS3 binds specific receptor-JAK complexes to control cytokine signaling by direct kinase inhibition[J]. Nature structural & molecular biology, 2013, 20(4): 469-476.
[5] Williams, JJ, Munro KM, Palmer TM. Role of ubiquitylation in controlling suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) function and expression[J]. Cells, 2014, 3(2): 546-562.
[6] 高云, 唐霓, 余崇林. PDTC对实验性重症急性胰腺炎肺损伤的保护作用[J]. 中国医疗前沿, 2012, 07(15): 1-2.
[7] Yoshimura A [Suppression of leptin and insulin signaling by SOCS3] Nihon Rinsho 2011; 69 Suppl 1: 782-789.
[8] 王彬, 张晓华, 杨妙芳, 等. SOCS3在重症急性胰腺炎合并肝损伤大鼠肝组织中的表达及意义[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(11): 1036-1039.
[9] 章忠渭. 抗氧化剂对重症急性胰腺炎大鼠胰腺高迁移率蛋白－1表达的影响及意义[J].
实用医学杂志, 2016, 32(8): 1244-1246.
[10] 阚氏海, 唐菁, 于振海, 等. 二硫代氨基甲酸吡咯烷对重症急性胰腺炎肺损伤中核因子-κB表达及细胞凋亡作用[J]. 解剖学杂志, 2015, 38(4): 393-398, 封2.
论文作者:王浛睿 王丽艳 张滢泉 原苗苗 曲鹏 郝宇鹤 阚氏海
论文发表刊物:《药物与人》2019年6月上
论文发表时间:2019/9/28
标签：大鼠论文; 损伤论文; 血清论文; 组织论文; 炎症论文; 对照组论文; 胰腺炎论文; 《药物与人》2019年6月上论文;