徐州医科大学附属医院儿科 江苏徐州 221002
【摘 要】目的 通过检测脂氧素A4（LXA4）作用于幼年肥胖SD大鼠内皮细胞前后内皮细胞增殖变化，探讨LXA4在改善幼年肥胖大鼠内皮细胞损伤中的可能作用。方法 40只三周龄断乳的雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为高脂组（HF组 n=32）与对照组（NC组 n=8）。对照组给予普通饲料，高脂组给予高脂饲料，饲养6周后，用贴块法培养内皮细胞，用MTT比色法检测不同浓度LXA4（0ug/ L、1ug/ L、10ug/L、100ug/ L）作用于原代培养的肥胖大鼠内皮细胞24h后的增殖情况，测定OD值。结果 不同浓度LXA4（0ug/ L、1ug/ L、10ug/L、100ug/ L）作用于原代培养肥胖大鼠内皮细胞24h后，可抑制其增殖，OD值显著降低，且呈浓度依赖性，对照组与实验组，实验组组间比较，均有统计学差异（P<0.01）。结论 LXA4可抑制肥胖大鼠内皮细胞增殖。
【关键词】肥胖；脂氧素A4；血管内皮细胞
Effect of Lipoxin A4 on proliferation of endothelial cells in childhood obesity rats
Zhao Tong，Wu xiao–lu，Gao li-li.Department of pediatrics，Affiliated Hospital of Xu Zhou Medical Collage，Xu Zhou 221002，China.
Abstract：Object To investigate the effect of LipoxinA4 on proliferation in vascular endothelial cell of young obesity rat．To investigate the role of LipoxinA4 may play on improving vascular endothelial cell dysfunction of young obesity rat.thus to provide some new ideas for preventing and treating of obesity and cardiovascular diseases.Methods Forty three-week old male SD weaning rats were randomly divided into two groups，the high fat group（n=32）and the control group（n=8）.And they were fed standard diet and a high fat diet.After six weeks endothelial cells of the obesity rats were cultured in vitro，the effect of different concentration of lipoxinA4（0、1、10and100ug/L）on primary cultured obesity rat endothelial cells proliferation was assessed by MTT colorimetry after 24 hours，and then determine their OD mV.Results Proliferation of primary cultured rat vascular endothelial cell was promoted by lipoxinA4（0、1、10and100ug/L）after 24 hours.Proliferation of endothelial cell was suppressed by lipoxinA4，significant difference was found in between the experimental groups and the control groups according to statistics，P<0.01．Conclusion LipoxinA4 inhibits proliferation of primary cultured obesity rat vascular endothelial cell.
Key words：obesity；lipoxin A4；vascular endothelial cells
【中图分类号】R891+.1【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-07-427-02
肥胖儿常伴有高脂血症，故以后易并发动脉硬化（AS）、冠心病、高血压、胆石症等疾病。肥胖及相关心血管疾病的发生与血管内皮受损密切相关。一些研究证实肥胖是一个脂肪组织过度蓄积能量所诱导的炎症过程[1-2]，炎症因子可刺激血管内皮细胞释放多种细胞因子，促使其与内皮细胞黏附，从而致内皮细胞功能障碍。目前研究发现，单纯肥胖症儿童已存在血管内皮损伤及动脉内膜-中层厚度改变[3]。
脂氧素A4（LipoxinA4，LXA4）为LX家族的一员，对多种炎症细胞的功能及其相关基因的表达具有广泛调节作用，被称为炎症的“刹车信号”[4]。本研究以高脂饲料喂养的SD大鼠模拟儿童单纯性肥胖模型，予以不同浓度LXA4作用于SD大鼠内皮细胞，通过对内皮细胞增殖的检测，探讨LXA4在幼年肥胖大鼠内皮细胞损伤中的可能保护作用。
1.资料与方法
1.1实验动物
选取3周龄刚断乳的雄性，健康清洁级Sparague-Dawley（SD）大鼠40只，体重在30-40g之间，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂
脂氧素A4由美国Cayman公司生产；DMEM培养基由美国Hyclone公司生产；胎牛血清，II型胶原酶，胰蛋白酶，EDTA购自杭州四季青生物制剂公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）由美国Sigma公司生产。
1.3 主要仪器
二氧化碳培养箱、酶标仪由美国Thermo Forma公司生产，倒置显微镜由日本奥林巴斯公司生产。
1.4 方法
1.4.1实验动物模型建立
将40只SD大鼠采用随机数字表法随机分为对照组（NC组）及高脂组（HF组），对照组给予普通饲料（由徐州医学院实验动物中心提供），高脂组予高脂饲料（高脂饲料是10％猪油、1.5％胆固醇、0.2％胆酸钠、5.0％蛋黄粉、0.2％甲基硫氧嘧啶和83.1%普通饲料）。饲养6周后，以高脂组大鼠体重高于对照组的体重的20%作为肥胖大鼠。
1.4.2实验分组
本实验所需大鼠40只，其中对照组8只，高脂组32只，后分离主动脉，培养内皮细胞[5]，将高脂组造模成功的大鼠依据随机数字表法随机分为：模型组（LO组）即HF组未加LXA4组、LXA4低浓度组（LS组）、LXA4中浓度组（LB组）及LXA4高浓度组（LM组），每组8只，LS组、LB组及LM组细胞培养液中给予LXA4 1μg/L，10μg/L，100μg/L，LO组及对照组继续培养液培养，进行传代细胞培养。
1.4.3 MTT法检测内皮细胞增殖（OD值）
收集对数期内皮细胞，接种于24 孔板中（5×104cells/well），培养于含10%FBS的DMEM液中使其生长至融合；于5%CO2，37℃孵育48h后，倒置显微镜下观察，细胞单层铺满孔底；各处理组加入不同浓度LXA4（0ug/ L、1ug/ L、10ug/L、100ug/ L）预处理30min，培养20h，对照组仅用含有0.5%FBS的DMEM液培养，20h后收集上清液；按顺序转至96孔培养板（100Ul/孔），温育24h后取出，弃上清液，加入MTT10ul/孔避光培养4h，离心弃上清液，然后每孔加入DMSO150ul，置摇床上低速振荡10min，使形成的结晶完全溶解；在490nm波长下用全自动酶标仪测定各孔OD值，每一剂量设3复孔，并重复实验3次。
1.5 统计学处理
本实验中所有结果均使用SPSS16.0统计软件进行统计分析，所有计量、计数资料数据以平均数±标准差表示（ ），多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时采用LSD法，方差不齐采用Dunnett T3法，以P<0.01表示差异有统计学意义。
2.结果
不同浓度的LXA4作用于内皮细胞，培养24小时后MTT比色法测定培养液OD值。结果表明，随着LXA4浓度增高，各组OD值显著降低，且呈浓度依赖性，对照组与高脂组，高脂组组间比较，均有显著性统计学差异（P<0.01）。见表1及图1。
3.讨 论
肥胖不仅影响儿童的健康，而且与成人代谢综合征密切相关。其中以心血管系统并发症的危害性最大。肥胖症除本身存在内分泌及代谢功能的紊乱外，同时还伴有炎症反应的发生，且肥胖相关性炎症反应参与了肥胖并发症的发病机制[6]，肥胖是一种慢性炎症状态，这一新的观点的提出及证明，为儿童单纯肥胖及相关心血管并发症的治疗及预防又提供一新的思路。
新近研究发现，脂肪组织不仅是一个具有多种内分泌、自分泌及旁分泌功能的内分泌器官，同时还可以合成多种生物活性物质，即脂肪因子，其中瘦素、脂联素、抵抗素、TNF-α、IL-6等因其对血管的功能及结构有着重要的调节作用，近年来成为肥胖引起血管损伤的相关研究热点。
血管内皮细胞（vascular endothelium cell VEC）作为防御血管的一道重要防线，其细胞结构的完整及正常功能的维持对炎症反应及免疫防御有着重要的作用。各种物理损伤、化学因素、炎症及免疫反应等多因素均可影响血管内皮的增殖活性，引起其凋亡及脱落等损伤。正常的血管内皮细胞覆盖于血管腔的内表面，是一种高度分化的单层细胞，作为管壁与血液之间的机械屏障，不但可以感知血液中包括压力、生化因子和激素水平的各种变化，同时还能通过各种分泌方式分泌生物效应因子，内皮细胞通过释放内源性舒张因子及收缩因子控制血管的舒张及收缩，调节血管的紧张度。各种因素如高血压、高胆固醇血症、内分泌等可显著损害内皮细胞，引起其内分泌及代谢功能紊乱，从而导致如动脉粥样硬化（AS）、高血压、胰岛素抵抗等相关代谢综合征。
儿童肥胖时所伴发的一系列代谢异常如胰岛素抵抗、血脂代谢的紊乱、脂肪因子的异常分泌均可影响血管内皮的功能，其中已有相关研究证明肥胖儿童存在动脉血管内皮功能紊乱，一氧化氮分泌量减少，内皮素分泌量增加[7]，致使血管舒张运动功能下降。Woo等[8]研究了超重（BMI>23 kg／m2）患儿的内皮功能和颈动脉内膜中层厚度（IMT）变化，结果发现其IMT明显增加，且内皮功能损伤程度与BMI呈正相关。本实验中，我们也证明了幼年肥胖模型中大鼠内皮细胞出现一定程度的损伤，并有不同程度增殖活性的提高，与之前相关研究相符。
脂氧素（LX）是二十烷类家族中一类花生四烯酸（AA）产物，其作为内源性的抗炎介质，具有广泛的抗炎作用[9]，局部可发挥抗炎与抗增殖作用[10]。LXA4主要是通过与脂氧素A4受体（LipxionA4 receptor，ALX）、半胱氨酸白三烯受体1（CysLT1）等结合后，调节蛋白激酶C（PKC）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路及核因子-kB（nuclearfactor- kB）等转录因子的活性来发挥炎症调节效应的[11]。阿司匹林诱生脂氧素被证明可抑制血管内皮生长因子（VEGF）或LTD4引起的血管内皮细胞增殖，减少血管生成[12][13]。
脂氧素与其受体结合后可对正常内皮细胞的增殖起到抑制作用，我们推测其对幼年肥胖大鼠的内皮细胞可能同样具有抑制作用。故本实验模拟幼年肥胖模型，予以不同浓度的LXA4作用于内皮细胞，对内皮细胞增殖活性进行检测来证明这一观点，本实验研究结果显示：高脂组内皮细胞的增殖程度与对照组相比，明显升高；给予LXA4干预后，内皮细胞的增殖程度收到明显抑制，且具有浓度依赖性，高浓度组与低浓度组相比，抑制作用更明显，说明LXA4呈浓度依赖性的抑制内皮细胞的增殖，与之前的BaKer[14]研究结果相符。本研究表明LXA4通过抑制幼年肥胖大鼠内皮细胞的增殖而对血管内皮起到保护作用。但其具体的作用机制尚不明确，可能与对炎性因子的抑制有关。
综上所述，LXA4可以抑制血管内皮细胞的增殖，在肥胖所致的血管内皮损伤中起着保护作用。我们推测这一作用可能对减少肥胖症合并心血管系统并发症的发生具有一定的作用。
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论文作者:赵彤,吴晓露,高莉莉
论文发表刊物:《系统医学》2016年第2卷第7期
论文发表时间:2016/6/24
标签：内皮论文; 细胞论文; 肥胖论文; 血管论文; 大鼠论文; 炎症论文; 浓度论文; 《系统医学》2016年第2卷第7期论文;