姜令绪[1]2004年在《环境因子对甲壳动物免疫力和抗氧化酶活力的影响》文中研究指明本论文综述了环境因子对甲壳动物免疫力和抗氧化酶活力的影响，主要探讨了①盐度、pH对中国对虾和凡纳滨对虾免疫力的影响。②温度对凡纳滨对虾免疫力的影响。③氨氮对凡纳摈对虾免疫力的影响。④重金属离子对中华绒螯蟹组织抗氧化酶活力的影响。主要结果如下： 1、盐度、pH突变对中国对虾、凡纳滨对虾免疫力的影响。结果表明：盐度、pH突变对两种养殖对虾抗菌活力、酚氧化酶活力的影响是显着的(P＜0.05)，而盐度突变对溶菌活力的影响也是显着的(P＜0.05)，对低pH突变影响明显，对高pH突变影响不明显。随着盐度突变值和向低pH、高pH突变梯度的增加，两种养殖对虾的抗菌活力逐渐减小，酚氧化酶活力逐渐增大，而溶菌活力则随着盐度突变值和向低pH突变梯度的增加呈逐渐下降。在各实验梯度中，随着盐度、pH突变后时间的增加，突变组两种养殖对虾的抗菌活力呈下降趋势，酚氧化酶活力呈上升趋势，而溶菌活力在盐度突变和向低pH突变实验组中呈递减趋势，其它实验组变化不明显；未突变组两种养殖对虾的免疫力指标变化很小。在同一实验梯度中，中国对虾的抗菌活力和溶菌活力要比凡纳滨对虾的低，而其酚氧化酶活力则比凡纳滨对虾的高。 2、温度对凡纳滨对虾免疫力的影响。结果表明：经单因素方差分析(ANOVO)，温度对凡纳滨对虾血细胞数量、溶菌活力、抗菌活力的影响显着(F＞F_(0.05))，无论向低温还是高温突变，温度突变值越大，各免疫指标变化越大。在实验时间内各免疫指标呈峰值变化，但是达到峰值和趋于稳定的时间不具有同步性。血细胞数量至1d时达到最低值，3d或9d后保持稳定，且在实验温度范围内与温度呈正相关性；酚氧化酶活力至1d时达到最高值值，3d或6d后趋于稳定，之后除了温度为18℃的处理组明显高于对照组外，其它各处理组与对照组差异不显着；溶菌活力在第12h或1d时达到最低值，3d后各处理组趋于稳定，其中向高温突变的组与对照组差异不显着，向低温突变的组与对照组差异显着，且温度越低，溶菌活力越低；各温度下的抗菌活力分别在第6h、12h或1d时达到最低值，6d后趋于稳定，且大小差异显着，其大小依次为27℃＞30℃＞24℃＞21℃＞18℃。环境因子对甲壳动物免疫力和抗氧化酶活力的影响3、氨氮对凡纳滨对虾免疫力的影响。对虾生物体长为8.5士0.scm，氨氮梯度为0 .12士0.05、0.53士0.02、1.08士0.10、1.48士0.05、2.06士0.07、2.58士0.04mg/L。实验结果表明:经单因素方差分析(ANOVO)，氨氮对凡纳滨对虾血细胞数量、血淋巴中酚氧化酶活力、溶菌和抗菌活力的影响显着(F>FO.。。)。氨氮浓度越高，对虾血细胞数量以及溶菌、抗菌活力越低，酚氧化酶活力越高;随着取样时间的增加，除了对照组，其它各处理组中对虾血细胞数量和溶菌、抗菌活力呈下降趋势，酚氧化酶活力呈上升趋势，24h后趋于稳定。4、种重金属离子对中华绒鳌蟹组织抗氧化酶活力的影响。实验结果表明:肝胰脏和鳃丝SOD，CAT活力在3种重金属离子作用下分别随取样时间变化显着 (P 曾媛媛[2]2009年在《环境因子对拟穴青蟹生理生化影响》文中研究说明运用酶学分析方法和组织学技术,研究了水体中不同浓度氨氮、亚硝酸盐、pH和盐度胁迫对拟穴青蟹生理生化以及鳃、肝胰腺显微结构的影响,探讨环境因子胁迫下拟穴青蟹生理生化的响应及免疫防御机制,以期为其健康养殖和水质管理提供理论指导,并为甲壳动物环境生理学研究积累基础资料。本试验的主要结果和结论如下:1氨氮胁迫对拟穴青蟹生理生化以及鳃、肝胰腺显微结构的影响过滤海水中分别添加氨氮(以氯化铵作为氨氮源)0 mg·L~(-1)(对照组)、10mg·L~(-1)、20 mg·L~(-1)、30 mg·L~(-1)、40 mg·L~(-1),胁迫24 h,48 h,72 h,96 h对拟穴青蟹生理生化及组织、器官显微结构影响的结果表明,拟穴青蟹血清PO活性在氨氮胁迫前期(24 h、48 h)随氨氮浓度的升高而增高,而在胁迫后期(72 h、96 h)却无明显规律;各组的拟穴青蟹血清PO活性,胁迫48 h时最高,与其它各组间差异显着(P<0.05),胁迫72 h时均为最低,这与拟穴青蟹THC变化有些相似,各组拟穴青蟹THC也是在胁迫48 h时最高,但在胁迫96 h时最低。此外,高浓度胁迫(C30、C40)时,拟穴青蟹THC一直处于较低水平,C40组与其它各组间差异显着(P<0.05)。拟穴青蟹鳃中SOD活性除C40组外,其余各组在胁迫前期随氨氮浓度的升高而升高,而在胁迫后期则随氨氮浓度的升高而下降,C40组拟穴青蟹鳃中SOD活性随胁迫时间的延长而一直呈下降趋势;血清SOD活性与鳃SOD活性变化趋势相似,但C40组拟穴青蟹血清SOD活性在氨氮胁迫48 h时最大,且与其它各组间差异显着(P<0.05);各组拟穴青蟹肝胰腺和肌肉的SOD活性变化趋势与鳃SOD活性相同。各组拟穴青蟹鳃和肌肉的SOD活性与PO活性、THC变化有相似之处,均在胁迫48 h时最大,肝胰腺SOD活性则在胁迫72 h时最大。各组拟穴青蟹鳃GSH-PX活性在氨氮胁迫24 h、48 h和72 h时随氨氮浓度的升高而下降,胁迫96 h时随氨氮浓度的升高而增大;血清GSH-PX活性变化与鳃GSH-PX活性变化趋势完全相反,各组拟穴青蟹血清GSH-PX活性在胁迫24 h、48 h和72 h时,随氨氮浓度的升高而增大,胁迫96 h时随氨氮浓度的升高而下降;各组拟穴青蟹肝胰腺和肌肉GSH-PX活性变化与肝胰腺SOD活性变化相似,C40组肝胰腺GSH-PX活性均在氨氮胁迫48 h时达到最大值。血清Ua、U_L与肝胰腺SOD活性变化趋势相同。拟穴青蟹鳃Na~+-K~+-ATPase活性除C40组外,其余各组在氨氮胁迫24 h时随氨氮浓度的升高而增大,而在氨氮胁迫48 h、72 h和96 h时则随氨氮浓度的升高而下降;C40组拟穴青蟹鳃Na~+-K~+-ATPase活性随胁迫时间的延长而一直呈下降趋势,C40组、C30组与其它各组间差异显着(P<0.05),这与THC在高浓度处于较低水平吻合;拟穴青蟹鳃Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性变化趋势与Na~+-K~+-ATPase活性变化相似,但C40组却随胁迫时间的延长而增强,这可能是拟穴青蟹处于蜕皮前期的生理信号。各组拟穴青蟹鳃和肝胰腺ACP活性变化与Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性变化一致;而肌肉ACP活性则随氨氮浓度的升高和胁迫时间的延长而下降,胁迫前期与胁迫后期差异显着(P<0.05);鳃AKP活性在胁迫24 h、72 h和96 h时随氨氮浓度的升高而下降,但在胁迫48 h时却随着氨氮浓度的升高而增大;肝胰腺和肌肉的AKP活性变化与血清SOD活性变化一致。拟穴青蟹鳃及肝胰腺组织细胞结构在氨氮胁迫下发生了氧化损伤,作用于鳃上皮细胞及肝胰腺肝小管引起细胞结构受损,影响了拟穴青蟹组织、器官正常的生理生化功能,且这种损伤随着水体中氨氮浓度的升高而加剧。2亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹生理生化影响过滤海水中分别添加NO_2-N(以亚硝酸钠为亚硝酸氮源)浓度分别为0.00mg·L~(-1)、0.25 mg·L~(-1)、0.50 mg·L(-1)、1.00 mg·L(-1)、1.50 mg·L(-1)、2.00 mg·L(-1),胁迫48 h、96 h和144 h时对拟穴青蟹生理生化影响的结果表明,各组拟穴青蟹血清PO、肌肉和肝胰腺的SOD活性、Ua以及肌肉AKP活性和肝胰腺U_L均随NO_2-N浓度的升高和胁迫时间的延长而逐渐下降,肌肉和肝胰腺的ACP活性、肝胰腺AKP活性和肌肉U_L则逐渐升高。3 pH胁迫对拟穴青蟹生理生化影响将海水pH分别调节到4.5,6.0,7.5,9.0,10.5,研究拟穴青蟹在pH胁迫24 h、72 h、120 h、168 h和216 h时的结果表明,pH对拟穴青蟹血清PO和SOD活性及Ua影响显着,对肌肉和肝胰腺SDO活性影响显着(P<0.05);相同pH下肝胰腺SOD活性差异显着(P<0.05)。4盐度胁迫对拟穴青蟹生理生化影响将海水盐度分别调节为5,15,25,35,研究拟穴青蟹在盐度胁迫24 h、48h、72 h和96 h的结果表明,盐度显着影响拟穴青蟹血清PO活性和SOD活性,且表现出明显的时间效应性,各组拟穴青蟹在盐度低于或高于25时,其肌肉SOD活性升高,同浓度组的拟穴青蟹肝胰腺SOD活性则随着盐度胁迫时间的延长而呈现出先降后升的趋势;鳃中Na~+-K~+-ATPase、Ca~(2+)-Mg(2+)-ATPase活性随盐度降低均升高,随着胁迫时间延长,Na~+-K~+-ATPase活性呈现不同的变化规律,且趋于平缓。肌肉ACP活性随着盐度的升高而呈小幅度下降,而肝胰腺ACP活性则呈小幅度升高。不同胁迫时间同一盐度组肌肉ACP活性有升有降;肌肉、肝胰腺AKP活性随着盐度升高而升高;随着胁迫时间延长,同一盐度组肌肉AKP活性均呈升高趋势,肝胰腺AKP活性有升有降。综上所述,环境因子胁迫会影响拟穴青蟹的生理生化及其免疫力。控制氨氮、亚硝酸盐、pH和盐度在一定范围内,有助于维持拟穴青蟹机体正常代谢与健康。 许国蓉[3]2017年在《温度对红螯光壳螯虾生长及免疫影响的初步研究》文中研究说明本文以红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)为研究对象,运用生物化学、免疫毒理学以及分子生物学等相关学科的研究方法及生物技术,通过控制外部的环境温度条件,初步探讨了温度变化尤其是低温对红螯光壳螯虾生长及免疫的影响,具体研究结果如下:1.不同温度对红螯光壳螯虾生长性能及抗氧化指标的影响为探究温度对红螯光壳螯虾生长性能、抗氧化指标、免疫力及抗病力的影响,进行了 8周的养殖试验,试验设置了四个温度组,分别为10℃、16℃、22℃、28℃,每组3个重复。结果表明,不同温度的红螯光壳螯虾存活率和增长率存在显着差异,低温条件(10℃)下会显着抑制红螯光壳螯虾的摄食、生长和存活,而适宜的温度,则对红螯光壳螯虾的存活和生长有显着促进作用。研究温度对红螯光壳螯虾肝胰腺、胃、鳃叁种组织消化酶和抗氧化酶活性的影响时,发现28℃组红螯光壳螯虾的淀粉酶和胰蛋白酶活性最高,显着高于其余组,而10℃组的淀粉酶和胰蛋白酶活性最低,显着低于其余组。叁种组织SOD酶活性在28℃时达到峰值,10℃时SOD酶活性最低。结果表明,低温能够显着抑制红螯光壳螯虾消化酶和抗氧化酶的活性,从而影响其生长和存活。2.不同温度对红螯光壳螯虾免疫指标的影响研究温度对红螯光壳螯虾肝胰腺、鳃、肌肉叁种组织ACP、AKP、LSZ活性影响时,发现22℃组的ACP和AKP活性最高,10℃组ACP和AKP活性最低且显着低于其它组(P<0.05)。溶菌酶活性在10℃组最低,22℃组的溶菌酶活性和28℃没有显着差异。实验结果表明,低温会显着抑制红螯光壳螯虾的免疫酶活性,从而对其免疫系统造成损害,而适宜的温度,则能增强红螯光壳螯虾的免疫力。3.不同温度对红螯光壳螯虾抗病力的影响试验虾红螯光壳螯虾经注射0.1m1,1.0× 108cfu/ml浓度的嗜水气单胞杆菌,不同温度组SOD酶活力有显着差异。结果表明,低温条件(10℃)时,嗜水气单胞杆菌感染能力很弱,SOD酶活力较强,但随着感染时间的延长,也会降低SOD酶活力,表明感染程度与温度和时间都有关,虽然低温条件下,嗜水气单胞杆菌的感染能力比较弱,但若长时间处于低温条件中,也会显着影响免疫酶的活性。而随着感染时间的延长,22℃组和28℃组SOD活力却逐渐增强恢复到原水平,表明适宜的温度能显着增强红螯光壳螯虾的抗病力。4.红螯光壳螯虾α-淀粉酶基因的克隆和表达分析运用分子生物学技术,克隆了红螯光壳螯虾α-淀粉酶基因的片段,该片段长970bp,开放阅读框长528bp,编码175个氨基酸残基,对α-淀粉酶做基因同源性比对,结果表明,序列与克氏原螯虾和凡纳滨对虾的同源性最高,分别为89%和85%,对其生物起源进行分析发现与克氏原螯虾亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,不同温度组的红螯光壳螯虾α-淀粉酶基因表达量存在显着差异,28℃组表达量最高,10℃组最低,显着低于其余组,表明α-淀粉酶基因参与了红螯光壳螯虾生长过程,对红螯光壳螯虾的生长有显着的促进作用。5.红螯光壳螯虾HSP70和Mn-SOD基因的表达分析运用实时荧光定量PCR技术,RT-PCR结果显示,不同温度对两条基因的表达都有显着的影响。HSP70基因在10℃和28℃时都有高表达,Mn-SOD基因在10℃组时表达量最低。表明,高温和低温环境都会提高HSP70基因的表达,从而诱导合成HSP70蛋白,而Mn-SOD基因在适宜温度时才会诱导其表达。 苏诗娟[4]2007年在《不同酸碱度和盐度对对虾氧自由基的产生和抗氧化系的影响》文中研究说明随着对虾养殖业的发展，对虾病毒性疾病已成为日益严重的全球性问题。引起病害发生的因素很多，如环境条件、苗种质量、对虾的自身免疫健康水平以及病原的致病能力等，对虾病害的发生是病原体、对虾自身免疫水平和环境条件相互作用的结果。对疾病问题的研究必须从多个角度入手综合考虑，其中从环境角度入手，研究环境因子对对虾自身免疫水平的影响是根本解决病害的重要对策之一。现已确认自由基和抗氧化系统参与了动物体内的许多生理和病理过程。因此从自由基角度研究虾类在应激状态的适应性机制和生理反应对于揭示其体内抗氧化系统的调节过程以及解释某些病理现象具有重要的理论意义和应用价值。本文从诸多环境因子中选择酸碱度和盐度，从凡纳对虾和斑节对虾的氧自由基产生以及抗氧化系统(SOD、CAT、GPX、GR和GST)和形成脂质过氧化物(MDA)的角度，研究了酸碱度和盐度对对虾自身免疫水平与环境条件相互作用的影响。主要有：慢性酸碱度应激对对虾血淋巴氧自由基产生和肌肉中抗氧化系统的影响。以凡纳对虾成虾为实验材料，比较不同时间(48h，72h，96h，120h，144h和168h)酸碱度应激对凡纳对虾血淋巴氧自由基产生量和肌肉中五种抗氧化系统酶活(SOD、CAT、GPX、GR和GST)和肝胰腺中产生脂质过氧化物(MDA)量的差别。结果显示，(1)抗氧化酶活中SOD、CAT、GPX和GR以及肝胰腺中MDA含量可以作为监测不同酸碱度对凡纳对虾免疫水平影响的指标。超氧阴离子量在碱性条件下，48小时应激组显着升高；GR酶活力和肝胰腺中MDA含量在低酸或高碱条件下升高，SOD、CAT和GPX活力也发生显着变化。(2)在应激条件下，SOD酶活与GR酶活有补偿作用，如在低酸性条件SOD活力是不断被抑制，GR活力不断升高；同时CAT活力与GPX活力也有补偿作用，如96小时CAT突然下降而GPX却突然升高。盐度应激对对虾肌肉氧自由基的产生和抗氧化系统的影响。以不同生长阶段斑节对虾(仔虾和幼虾)为实验材料，比较不同时间(24h和48h)盐度应激(2‰、7‰(对照)、20‰、30‰和40‰)对不同生长阶段斑节对虾肌肉氧自由基产生量和五种抗氧化系统酶活(SOD、CAT、GPX、GR和GST)的差别。结果显示，(1)盐度应激能影响斑节对虾抗氧化系统免疫水平。如幼虾在低盐度时超氧阴离子的产生和GPX活力显着下降，GST活力也显着变化；在盐度20‰时超氧阴离子的产生显着下降，CAT活力显着升高，GPX活力受到显着抑制，GST活力也发生显着变化；在盐度为30‰时SOD活力和GR活力显着升高；在高盐度40‰时超氧阴离子的产生和CAT活力显着下降，SOD活力显着升高，GST活力也发生显着变化。仔虾在低盐度时超氧阴离子的产生和GPX活力显着下降，SOD、CAT和GR活力显着升高；在盐度为20‰时仔虾超氧阴离子的产生、CAT、GPX和GST活力显着下降，GR活力显着升高；在盐度为30‰时GPX和GST活力显着下降；在盐度为40‰时超氧阴离子的产生显着升高，GPX和GST活力显着下降。(2)不同生长阶段斑节对虾的抗氧化系统调节机制不一样。仔虾和幼虾在24小时应激中SOD和GR酶活力变化相反，48小时应激中产生的超氧阴离子量以及CAT和GST酶活变化也相反。(3)不同生长阶段斑节对虾的抗氧化系统免疫水平不一样。对照组的仔虾产生超氧阴离子量低于幼虾，而SOD、GPX、GST活力高于幼虾。 许星鸿[5]2014年在《环境胁迫对日本蟳免疫及消化生理影响的研究》文中指出本文采用生物酶测定、组织学及分子生物学等方法，分析了养殖水体中常见的污染胁迫因子（氨氮、亚硝态氮、硫化物及镉、铅等重金属）对海蟹-日本蟳免疫及消化生理的影响规律，以探讨环境胁迫因子对日本蟳的毒性作用，为健康养殖水环境调控及相关毒理学等研究提供依据。研究结果表明：环境胁迫下，日本蟳的血细胞密度（DHC）、血蓝蛋白含量以及酚氧化酶（PO）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力等免疫相关指标多表现为先升后降，而过氧化代谢产物-丙二醛（MDA）含量总体呈上升趋势。胁迫15d后，除低浓度处理组外，所测指标均显着低于对照组，且SOD和CAT活力与胁迫浓度呈显着负相关，MDA含量与胁迫浓度呈显着正相关。较低浓度(氨氮≤10mg/L，亚硝态氮≤10mg/L，硫化物≤0.75mg/L)的胁迫对日本蟳肝胰腺消化酶活力可产生一定的诱导效应，而高浓度(氨氮≥20mg/L，亚硝态氮≥20mg/L，硫化物≥1mg/L)的胁迫对蛋白酶和淀粉酶活力表现出明显的抑制效应。胁迫7d后，氨氮≥10mg/L、亚硝态氮≥2mg/L及硫化物≥1mg/L的胁迫会导致消化酶活力明显下降，其中淀粉酶活力与剂量浓度间呈显着负相关。高浓度的氨氮和硫化物胁迫会导致日本蟳器官结构发生显着变化：鳃几丁质膜变薄、断裂，鳃上皮排列紊乱、胞质中细胞器减少、染色质异固缩；鳃腔中血淋巴减少，密度降低，血细胞凝集、质膜破裂，胞质严重空泡化；肝胰腺上皮形态不规则，B细胞减少，腺细胞出现大量空泡，染色质凝聚；胃几丁质膜断裂，胃上皮排列不规则，胞质中出现大量残余体。高浓度氨氮、亚硝态氮及硫化钠的胁迫对日本蟳的α-淀粉酶（α-AMY）、乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）和过氧化物酶（POD）等同工酶表达均出现出一定的抑制作用：条带减少、变浅甚至消失。但胁迫下，日本蟳肌肉中新增两条活性较强的酶带：MDH-2和MDH-4，鳃中MDH-1和心脏中MDH-4活性显着增强。镉和铅在日本蟳体内的积累以肝胰腺和鳃较多，而卵和肌肉仅在高质量浓度（镉≥0.1mg/L，铅≥5mg/L）胁迫下才有微量的蓄积。肝胰腺中镉和铅含量与胁迫质量浓度之间存在明显的浓度-效应关系。克隆了日本蟳热休克蛋白（HSP）基因全长cDNA序列，该序列由2203bp组成，含有一个长1953bp的开放阅读框（ORF），分布于108～2060bp，共编码650个氨基酸，阅读框两侧分别存在107bp（5’端）和143bp（3’端）的非翻译区。聚类分析表明，日本蟳HSP70氨基酸序列与拟穴青蟹、锯缘青蟹、叁疣梭子蟹和蓝蟹等紧密聚为一支。氨氮、亚硝态氮和硫化物胁迫对日本蟳HSP基因表达均有一定的诱导效果，诱导程度与胁迫浓度呈正相关，表达量于胁迫后3h或6h达到最高，但胁迫的时间过长会对HSP基因表达起抑制作用。研究表明高浓度的环境胁迫对日本蟳免疫相关指标、消化酶活力、同工酶表达及HSP基因表达起抑制作用，并造成器官结构的明显损伤。可将SOD活力和MDA含量长期变化情况作为衡量日本蟳在环境胁迫下免疫状态的指标；日本蟳淀粉酶活力的变化情况可作为衡量机体在胁迫状态下消化功能的监测指标；日本蟳肝胰腺中镉和铅含量的长期变化可作为镉、铅污染的生物监测指标；机体HSP70的表达反应灵敏，可作为一种环境胁迫的早期应激评价指标。 王芸[6]2011年在《pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究》文中研究说明中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国重要的海水养殖品种,具有适应能力强、生长速度快、耐低温、营养丰富等优点。养殖环境恶化、管理不当等因素引起的环境胁迫所诱导的应激反应,不仅对中国对虾的生理状态及抗病力有显着的影响,甚至严重影响了对虾的养殖成活率。良好的水环境是对虾养殖成败的关键,pH、氨氮是衡量养殖水质质量的重要指标,本文通过研究pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响,揭示了中国对虾应对pH、氨氮胁迫的应激机理,为对虾抗逆选育和健康养殖提供技术支撑。研究内容包括以下四个部分:第一部分,中国对虾细胞凋亡因子Caspase基因cDNA克隆和表达分析。从中国对虾肝胰腺中克隆了Caspase基因,该基因cDNA全长1329b(pGenBank注册号为GU597089),其中开放式阅读框为972bp,包含109bp的5′非编码区(5′-UTR),248bp的3′非编码区(3′-UTR)及一个多腺苷酸信号AATAAA。该基因编码323个氨基酸,预测分子量为36.0kDa,pI为6.27。Caspase编码的氨基酸包含Caspase家族保守的活性位点中心(QACRG五肽)和两个结构域(大亚基p20和小亚基p10),推导的氨基酸不存在信号肽序列。中国对虾Caspase蛋白包含特殊的氨基酸残基His150和Cys198,这两个氨基酸对于催化Caspase酶活性起到至关重要的作用。多序列分析结果表明F. chinensis Caspase与Penaeus monodon Caspase、Fenneropenaeus merguiensis Caspase、Litopenaeus vannamei Caspase-3蛋白质序列同源性分别为83%、82%、76%。应用荧光定量PCR方法分析了中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0水环境中,各组织Caspase基因表达的水平。结果显示:pH7.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平12h显着升高,48h达最低,96h达最高值,148h显着低于对照组(P<0.05);pH9.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平3h显着升高,24h显着低于对照组(P<0.05),120h达最大值并显着高于对照组。pH7.0组中国对虾鳃Caspase基因表达水平在48h和120h低于对照组,其余各时间点表达水平均高于对照组,且在148h达最高值;pH9.0组中国对虾鳃Caspase表达水平3h显着低于对照组(P<0.05),之后逐渐增加,24h达最高值,48h后随着胁迫时间的延长Caspase基因表达水平逐渐降低。pH7.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平均低于对照组,但3h、48h和96h例外;pH9.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平3h显着增加,之后表达水平逐渐增加,120h达最高值,且在24h至148h期间均显着高于对照组(P<0.05)。高、低pH胁迫对中国对虾肌肉Caspase基因表达变化相似,3h略有升高,96h达最高值,148h均显着低于对照组(P<0.05)。高、低pH胁迫中国对虾3h后,其淋巴器官Caspase基因表达水平增加,且随着胁迫时间延长,各组Caspase基因表达水平一直处于较高水平。pH7.0组中国对虾胃Caspase基因表达3-12h显着低于对照组(P<0.05),之后呈波浪式变化,148h达最高值,与对照组相比差异显着(P<0.05);pH9.0组中国对虾胃Caspase基因表达3h显着降低,12-72h表达水平逐渐升高,120h达最高值。TUNEL分析结果表明中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0的水环境中12h,肝胰腺组织开始出现细胞凋亡现象,并且随着胁迫时间的延长肝胰腺细胞凋亡现象越明显,与TUNEL分析中的阳性对照表现相一致。相反pH8.2(对照组)中国对虾肝胰腺没有发现被深染的细胞核,与TUNEL阴性对照组的表现一致。这说明高、低pH胁迫均能够诱导中国对虾肝胰腺组织的细胞凋亡。第二部分,中国对虾Caspase基因的重组表达、分离纯化和多克隆抗体的制备。克隆中国对虾Caspase基因开放式阅读框序列,构建了该基因原核表达载体pET30a-CAS,通过E. coli稀有密码子分析,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE) pLysS,成功实现了Caspase基因在E. Coli中的表达。SDS-PAGE分析显示该重组蛋白分子大小约为50 kDa,略大于软件预测的分子量。MALDI-TOF-MS分析验证了该蛋白是中国对虾Caspase蛋白。利用固定金属亲和层析和Co-NTA技术获得的纯化Caspase重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备了特异性多克隆抗体,Western blot结果表明中国对虾血淋巴细胞、鳃、肌肉、淋巴器官、心脏、胃和肝胰腺组织中均有Caspase蛋白的表达,但在血清中未检测到特异性的谱带。第叁部分,pH胁迫对中国对虾抗氧化系统及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于pH8.2(对照组)、7.0、9.0(胁迫组)的水体中148 h,于胁迫后0、3、12、24、48、72、96、120、148h测定鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴总抗氧化活力(T-AOC)、抗超氧阴离子活力、过氧化氢酶(CAT)活力和CAT、过氧化物还原酶(Prx)和HSP90基因表达的情况。结果显示, pH胁迫12h-24h,对虾各组织T-AOC、抗超氧阴离子、CAT酶活力及CAT基因表达均增加,pH胁迫120h-148h上述指标受到抑制。对虾肝胰腺和肌肉Prx基因表达随胁迫时间增加逐渐升高,鳃和血淋巴Prx基因表达随胁迫时间增加呈下降趋势。高pH(9.0)胁迫时,对虾鳃抗氧化系统酶活力及基因表达水平达峰时间较其他3个组织明显缩短;而低pH(7.0)胁迫时,对虾肝胰腺抗氧化系统酶活力比其他组织变化快。高pH(9.0)组中国对虾肝胰腺HSP90基因表达显着高于对照组(P<0.05),肌肉组织HSP90基因表达除72h外均显着低于对照组(P<0.05)。试验结果表明,pH胁迫3h-24h对中国对虾抗氧化系统酶活力及相关基因表达有一定的诱导效果,但胁迫120h-148h则抑制其抗氧化系统功能,可能会导致中国对虾机体的氧化损伤;中国对虾鳃和肝胰腺分别对高、低pH胁迫较敏感。第四部分,氨氮胁迫对中国对虾抗氧化系统、血淋巴氨氮成分及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于不同氨氮浓度(0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L)的水体中96h,于胁迫后0、6、24、48、72、96h测定中国对虾血淋巴氨氮、尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴的T-AOC、抗超氧阴离子、Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及CAT、Prx、Caspase、HSP90基因表达水平,结果显示:(1)当水体氨氮浓度从0.220mg/L到13.449mg/L时,中国对虾血淋巴氨氮浓度明显升高,于24h-28h达最低值,72-96h达最高值,但均显着高于对照组(P<0.05)。(2)当水体氨氮浓度从0.220mg/L到9.446mg/L时:中国对虾血淋巴尿素氮含量明显升高且显着高于对照组(P<0.05),各组尿素氮浓度6h达最高值;中国对虾鳃、肝胰腺和肌肉Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显升高,并且各指标变化基本一致。当水体氨氮浓度从9.446mg/L到13.449mg/L时,血淋巴尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显降低,说明高氨氮浓度抑制血淋巴尿素氮的合成、ATPase活性及HSP90基因表达水平(3)当水体氨氮浓度从0.303mg/L到8.625mg/L时,中国对虾T-AOC、抗超氧阴离子活力及CAT基因表达水平升高,并在胁迫后6h或96h达最高值;Prx基因表达水平均在72-96h达最高值。当水体氨氮浓度大于8.625mg/L时中国对虾的抗氧化系统受到抑制。(4)Caspase基因表达水平均在氨氮胁迫后的72-96h达最高值(实验后期),该表达变化与pH胁迫后Caspase基因的表达变化相似。推测高浓度氨氮能够诱导中国对虾Caspase基因的表达,进而诱导中国对虾的细胞凋亡。 王慧春[7]2010年在《虾青素对凡纳滨对虾的免疫防护及对虾养殖的水质监测和WSSV检测》文中进行了进一步梳理将虾青素添加到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)配合饲料中,从抗氧化角度入手,在个体、细胞和分子水平研究虾青素对凡纳滨对虾免疫防护和抗氧化酶基因的影响,以期全面评价虾青素在改善凡纳滨对虾的生理功能和提高凡纳滨对虾抗病力等方面的作用,进而推测虾青素的作用机理。虾青素对感染WSSV的凡纳滨对虾的免疫防护作用。评价指标有：血液免疫指标(血细胞计数、血细胞吞噬百分比、血细胞吞噬指数、血清抗菌活力、血清溶菌活力、血清酚氧化酶活力、血清抗超氧阴离子自由基活力),WSSV感染后的累积死亡率及相对免疫保护率。实验证明：饲料中添加80 mg/kg虾青素可显着提高实验组对虾的血液学指标(p<0.05)；实验组中感染WSSV的凡纳滨对虾累计死亡率为76.3%,免疫保护率为23.7%：虾青素对凡纳滨对虾抗氧化酶基因转录的影响。采用β-actin作为内参,用半定量PCR法研究添加虾青素作为抗氧化剂对凡纳滨对虾肝胰腺MnSOD、CAT和GPX 3种抗氧化酶基因转录水平的影响。结果表明,饲料中添加80mg/kg虾青素能明显提高抗氧化物酶系统包括SOD、CAT、GPX的mRNA水平(p<0.05)。针对养殖对虾病害频发的现状,本实验还初步研究了中国明对虾(Fenaeus chinensis)养殖水体理化因子变化与对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染率的相关性。通过对养成池的水质监测及对虾WSSV检测,发现在WSSV感染率较高的的8月份,水体溶解氧迅速下降,温度处于WSSV易感的温度范围,pH值变化剧烈,,铵盐和硝酸盐含量骤然升高。这说明恶化的水体环境能增加对虾WSSV的易感性,或使潜伏感染WSSV的对虾产生应激反应引起急性感染死亡 周元雪[8]2014年在《口虾蛄消化酶及免疫因子特征的初步研究》文中进行了进一步梳理本试验研究了幼体阶段、温度、盐度、饥饿胁迫以及饵料对口虾蛄不同生长阶段的淀粉酶、纤维素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶五种消化酶活力的变化。同时，研究了温度、盐度及饥饿胁迫对口虾蛄成虾血细胞总数、血蓝蛋白浓度、溶菌酶体活性等免疫因子的影响。旨在为不同条件下人工育苗和养殖口虾蛄提供理论依据。研究结果如下：1、不同发育阶段阶段对口虾蛄消化酶活力的影响测定了口虾蛄假溞状幼体Ⅲ-Ⅺ期以及仔虾期的消化酶活力，试验结果表明，口虾蛄幼体生长过程中，消化酶表现出不同的变化模式：淀粉酶活力先增大，至假溞状幼体Ⅴ期达到峰值后逐渐减小；纤维素酶活力呈现下降的趋势；脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶活力则逐渐增大；A/T的比值逐渐减小。2、温度、盐度胁迫对口虾蛄消化酶活力的影响比较了不同温度、盐度胁迫条件下口虾蛄消化酶活力的差别，试验结果表明，在盐度18-39范围内，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力随着盐度的升高呈现先增大后减小的趋势，纤维素酶活力则在到达某一峰值后上下波动；纤维素酶、胃蛋白酶、脂肪酶活力在盐度27时最高，淀粉酶、胰蛋白酶活力在盐度30时最高。在5-30℃范围内，消化酶活力随温度的升高而增加，在30℃时最高。3、饥饿胁迫对口虾蛄消化酶活力的影响测定不同饥饿时间对口虾蛄消化酶活力大小的影响，试验结果表明，消化酶活力随着饥饿时间的增加呈现先增大后减小的趋势；除胃蛋白酶在3d时达到最大值外，其余消化酶酶活力在饥饿1d时最高，至14d达到最低值。4、饵料对口虾蛄消化酶活力的影响：比较了不同饵料投喂下口虾蛄消化酶活力的差别，试验结果表明，投喂小球藻组的口虾蛄的淀粉酶及纤维素酶活力最高，蛋白酶和脂肪酶活力最低，变态率最低；小球藻强化的卤虫组酶活力略高于卤虫组的酶活力，小球藻强化的卤虫组变态率更高；投喂酵母强化的卤虫组除了纤维素酶活力在Ⅺ期幼虾时最低外，均表现出较高的消化酶活力，对消化酶活力的影响比较均衡，且具有较高的变态率；投喂糠虾组的的幼体变态率最高，幼体消化酶除淀粉酶外均表现出较高的酶活力，其中，蛋白酶和脂肪酶活力最大。5、温度、盐度胁迫对口虾蛄免疫活性的影响：分析了温度、盐度胁迫对口虾蛄免疫因子的影响，试验结果表明，在盐度18-36范围内，血蓝蛋白浓度、血细胞总数、磷酸酶活力随着盐度的增加表现为先增大后减小趋势，除了酸性磷酸酶活力至盐度27时达到最大值外，其余的均在盐度30时表现出最大活性；而过氧化氢酶、溶菌酶以及过氧化物歧化酶随着盐度的增加表现为先减小后增大，溶菌酶酶活力在盐度27时最小，其余酶活力在盐度30达到最小值。在5-30℃范围内，除了碱性磷酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力一直增大外，其余的免疫活性均随着温度的升高表现为先增大后减小，血蓝蛋白浓度、血细胞总数在15℃时达到最大值，酸性磷酸酶、溶菌酶活力分别在25℃、20℃最大，其余酶活力在30℃表现最大。6、饥饿胁迫对口虾蛄成虾免疫活性的影响测定不同饥饿时间对口虾蛄免疫因子的影响，试验结果表明，随着饥饿时间的增加，口虾蛄血蓝蛋白浓度、血细胞总数、磷酸酶活力一直减小，至25d达到最低值；过氧化氢酶、溶菌酶、过氧化物歧化酶活力则表现为先增大后减小的趋势，过氧化氢酶活力在饥饿5d时最大，其余酶活力在饥饿10d时达到最大值。 赵莉[9]2010年在《壬基酚对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的免疫毒性及雌激素效应研究》文中研究指明中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹,是我国极为重要的水产经济动物。随养殖规模的扩大,中华绒螯蟹病害也随之加剧,给养殖业造成了极大经济损失。自身的免疫能力下降、病原体增加以及其生存水环境污染是导致河蟹疾病的叁大主要原因。其中环境因素起着重要作用,不仅影响甲壳动物机体抗病能力同时也导致病原生物的大量繁殖。对甲壳动物来说,水体污染物引起的环境压力是其免疫力下降的一个重要原因。甲壳动物机体变化或患病率的上升可以作为环境压力的标志。目前对中华绒螯蟹的环境胁迫研究主要集中在氨氮,温度,pH值,重金属离子等环境因子方面,有关壬基酚(NP)等环境内分泌干扰化学物质对河蟹的毒性作用的研究未见报道。NP是一种常见的、化学性质稳定的,并且容易在生物体内积累的污染物。随着工业的发展,污染加剧,我国长江流域水体和沉积物中发现了NP的存在。目前已有大量研究证实NP可对生物体产生的不良作用：包括对内分泌、生殖和发育、致癌、免疫等方面。中华绒螯蟹的生存环境也受到NP的威胁,因此,有必要探索NP对水产养殖虾蟹类的胁迫效应,为建立相应的评价体系提供理论指导。本研究借助免疫检测技术和分子生物学手段,通过对免疫相关酶活性的测定,对血细胞密度(THC)、酚氧化酶激活系统(proPO、PPAF)、抗菌肽(crustin)、抗氧化酶系统(SOD、CAT、GPX)等免疫相关基因表达量以及卵黄蛋白原(VTG)的变化的检测,分别从细胞和分子水平检测腹腔注射NP对中华绒螯蟹的免疫毒性及雌激素效应,为NP对中华绒螯蟹作用的研究丰富资料。主要研究结果如下：1、NP暴露10d后,中华绒螯蟹总血淋巴细胞THC密度下降,且与NP的剂量(10mk／kg～1000mg／kg)呈反比线性关系。在本实验的中剂量300mg／kgNP进行的时间效应实验中,中华绒螯蟹THC密度在腹腔注射暴露后的3d内呈下降；暴露6d后,血细胞数回升,此后血细胞数呈现明显的回升,并在第14d接近对照组。2、较低剂量(≤100mg／kg)NP可提高中华绒螯蟹血细胞ProPO和PPAF基因的表达量,但是高于此浓度时,诱导效应反而下降。NP对中华绒螯蟹ProPO和PPAF基因表达的诱导具有时间效应,注射后6d内表达量一路上调,其后回落。3、低剂量的NP同样可以使中华绒螯蟹血淋巴细胞抗菌肽甲壳素crustin mRNA表达的上调。经低剂量NP预暴露1d的中华绒螯蟹,感染嗜水汽单胞菌时血淋巴细胞中crustin的表达量远高于未预暴露组,但是NP暴露14d后的个体,受细菌感染时血淋巴细胞中crustin的表达量低于未感染组,显示出短时间免疫应激效应。4、中华绒螯蟹肝胰腺超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶GPX对NP暴露的感应灵敏。最低剂量(10mg／kg)的NP即可诱导酶活性的升高,并且有明显的剂量效应关系。NP对中华绒螯蟹抗氧化酶类的作用是双向的,即较低剂量的NP暴露可以显着提高酶的活性,并诱导抗氧化酶基因的表达,而较高剂量组暴露反而使得酶活性显着低于对照组,表现为抑制效应。此外,NP对中华绒螯蟹的毒性作用有时间变化过程,即呈现先缓慢上升,后下降的过程。5、NP对中华绒螯蟹也有雌激素效应。不仅可提高雌蟹肝胰腺中卵黄蛋白原基因的表达水平,也可诱导雄性中华绒螯蟹肝胰腺VTG基因的表达。10mg／kg剂量组NP暴露就检测到了VTG基因的表达量的升高,500mg／kg表达量达到最大值。综合分析各项实验结果可知,低剂量的NP可刺激中华绒螯蟹产生免疫应激反应,这种应激反应随NP在体内的代谢消除而减弱,并会对中华绒螯蟹的免疫能力产生一定的负效应。高浓度的NP,通过减少中华绒螯蟹血淋巴细胞影响免疫功能。与高等脊椎动物的反应相似,NP对中华绒螯蟹也有雌激素效应。 郭春雨[10]2007年在《虾青素对中华绒螯蟹的影响及作用机理》文中认为本实验从雨生红球藻中提取虾青素,添加到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)配合饲料中,从抗氧化角度入手,在个体和细胞水平上研究虾青素对中华绒螯蟹的影响,以期全面评价虾青素在改善中华绒螯蟹的生理功能和提高中华绒螯蟹抵抗外界不良环境能力等方面的作用,进而推测虾青素的作用机理。本文分别从虾青素投喂中华绒螯蟹的最适添加量的确定；虾青素的不同投喂方式对中华绒螯蟹的影响；虾青素对中华绒螯蟹抗环境胁迫能力的影响；虾青素对中华绒螯蟹的光保护作用；虾青素对中华绒螯蟹卵巢发育的影响五个方面进行探讨。根据不同的实验目的所选取的评价指标有：生长生理指标(存活率、蜕皮频率、抗病菌侵染能力、Na+-K+-ATPase)；抗氧化指标：(CAT、MDA、总抗氧化能力)；血液免疫指标(血细胞计数、血淋巴吞噬百分比)；性腺发育指标(性腺指数、肝胰腺指数、卵母细胞直径、卵黄蛋白含量)；分子水平(DNA损伤)。通过实验证明：虾青素作为免疫增强剂可以提高中华绒螯蟹的存活率和抗氧化能力p<0.05),其最适添加量为80 mg/kg,最佳投喂时间为4周；虾青素连续投喂时间过长可以引起免疫疲劳,间隔投喂可以消除虾青素引起的免疫疲劳,提高中华绒螯蟹免疫力,使中华绒螯蟹的生理机能更加稳定；添加虾青素的中华绒螯蟹抗环境胁迫能力和抗病菌侵染能力增强,能够有效的抵抗温度突变(15℃—28℃)、盐度突变(0—10‰)、致病菌(嗜水气单孢菌Aeromonas hydrophila浸浴感染,106ind.／mL)叁种因子的胁迫：虾青素具有强抗氧化性,可作为潜在的光保护剂,使细胞免受UVA所造成的损伤；虾青素可以促进中华绒螯蟹雌蟹性腺发育,促进卵母细胞的成熟和卵黄蛋白的积累。 [1]. 环境因子对甲壳动物免疫力和抗氧化酶活力的影响[D]. 姜令绪. 中国海洋大学. 2004 [2]. 环境因子对拟穴青蟹生理生化影响[D]. 曾媛媛. 厦门大学. 2009 [3]. 温度对红螯光壳螯虾生长及免疫影响的初步研究[D]. 许国蓉. 华东师范大学. 2017 [4]. 不同酸碱度和盐度对对虾氧自由基的产生和抗氧化系的影响[D]. 苏诗娟. 华南师范大学. 2007 [5]. 环境胁迫对日本蟳免疫及消化生理影响的研究[D]. 许星鸿. 中国矿业大学. 2014 [6]. pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究[D]. 王芸. 上海海洋大学. 2011 [7]. 虾青素对凡纳滨对虾的免疫防护及对虾养殖的水质监测和WSSV检测[D]. 王慧春. 河北大学. 2010 [8]. 口虾蛄消化酶及免疫因子特征的初步研究[D]. 周元雪. 大连海洋大学. 2014 [9]. 壬基酚对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的免疫毒性及雌激素效应研究[D]. 赵莉. 华东师范大学. 2010 [10]. 虾青素对中华绒螯蟹的影响及作用机理[D]. 郭春雨. 河北大学. 2007 标签：水产和渔业论文; 中国对虾论文; 基因表达论文; 濑尿虾论文; 海水盐度论文; 抗氧化论文; 青蟹论文; 对虾论文; 参考文献：